一种钙黄绿素可视化RT‑LAMP试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒及应用。

背景技术：

新型鸭呼肠孤病毒(new-typeduckreovirus,ndrv)病，是一种以肝脏不规则坏死，出血斑点和心肌，法氏囊出血为主要特征的新疫病。其主要临床症状为病鸭精神不振、采食量降低或废绝，有些鸭有拉白稀粪、发病急、病程短(24h内)，并且与以往鸭呼肠孤病不一样，该病无软脚现象。该病毒在致病性、抗原性和基因序列方面都有别于番鸭呼肠孤病毒(黄瑜，2009；陈宗艳等，2012；袁远华等，2013)。自2005年以来，该病由福建、广东及浙江等地区不断向其它地区蔓延，来势汹汹，给养禽业的发展带来了巨大的经济损失。

目前常用于新型鸭呼肠孤病毒的检测方法包括病原学诊断法、血清学诊断法和rt-pcr诊断法。病原学诊断法是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在实际应用中有一定的局限性；血清学诊断法包括酶联免疫吸附实验(elisa)和琼脂扩散试验(agpt)，其中酶联免疫吸附实验需要配置昂贵的pcr仪器，实验操作的时间消耗较长、复杂，不便于在基层和现场检测的推广和使用，而琼脂扩散试验的敏感性不高；而rt-pcr技术需要特殊的仪器设备(如pcr仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作，显然无法满足基层和现场检测的需求。

近年来，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)广泛应用于各种病原的快速诊断，于可响等(于可响,马秀丽,韩宏宇等.新型鸭呼肠孤病毒rt-lamp检测方法的建立[j].生物技术通报.2015，31(8):71-75.)针对ndrv的σb蛋白保守序列设计了4对引物，建立了rt-lamp可视化快速检测方法，对ndrvrna最低检出量为0.1pg，敏感性约为常规rt-pcr方法的100倍，但其需要开盖加入sybrgreeni荧光剂，检测方法不够优良，检测结果易出现假阳性现象。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒及其应用，旨在解决现有技术中对新型鸭呼肠孤病毒检测方法操作复杂、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。

本发明的技术方案如下：

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒，其中，包括引物组、钙黄绿素、氯化锰；

所述引物组如下：

上游外引物f3：5’-cgtggatggtcaaagtcgt-3’；(seqidno.1)

下游外引物b3：5’-acctacactccaggaaggac-3’；(seqidno.2)

上游内引物fip：

5’-tagttctggcatggcctcgc-ctttacatgtgctgcaggga-3’；(seqidno.3)

下游内引物bip：

5’-tgttcggacgttctcttccgga-tttaatggcgcggacgac-3’；(seqidno.4)

环引物loopf：5’-agcctagattcgcactccg-3’；(seqidno.5)

环引物loopb：5’-cgaggagactacccacgtt-3’；(seqidno.6)。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒，其中，还包括新型鸭呼肠孤病毒rna模板。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒，其中，rnase-freewater、10倍反应缓冲液、dntps、甜菜碱、mgso4、bst聚合酶和amv反转录酶。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒，其中，还包括2.5mmol/l的dntps、5mmol/l的甜菜碱、100mmol/l的mgso4、625mmol/l的钙黄绿素、25mmol/l的mncl2、8u/μl的bst聚合酶和10u/μlamv的反转录酶。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒，其中，所述外引物f3+b3的浓度为10μmol/l，所述内引物fip+bip的浓度为10μmol/l，所述环引物loopf+loopb的浓度为10μmol/l。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒的应用，其中，包括步骤：

(1)配制rt-lamp反应体系：加入钙黄绿素、氯化锰、硫酸镁、甜菜碱、dntps、amv酶、bst聚合酶、10倍反应缓冲液、上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip、下游内引物bip、环引物loopf、环引物loopb以及待测样品；

(2)反应：将步骤(1)配制好的反应体系反应，条件为59～66℃恒温反应，然后灭活；

(3)结果判读：

在自然光或紫外光下判读反应的结果或者二者结合判读:

在自然光下，反应产物为绿色，说明测试样品中含有新型鸭呼肠孤病毒；在自然光下，反应产物为橙色，说明测试样品中不含新型鸭呼肠孤病毒；

在紫外光下，反应产物为荧光绿色，说明测试样品中含有新型鸭呼肠孤病毒；在紫外光下，反应产物为浅蓝色或接近透明，说明测试样品中不含新型鸭呼肠孤病毒。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒的应用，其中，所述步骤(1)中，钙黄绿素和氯化锰终浓度比为1:8～1:128，硫酸镁的终浓度为1mmol/l～6mmol/l，甜菜碱的终浓度为0.5mmol/l～1.5mmol/l，dntps的终浓度为0.2mmol/l～0.6mmol/l，amv酶的终浓度为0.06u/μl～0.16u/μl，bst聚合酶的终浓度为0.08u/μl～0.48u/μl，10倍反应缓冲液的终体积分数4％～16％。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒的应用，其中，所述步骤(1)中，内引物与外引物的终浓度比为2:1～12:1，环引物与外引物的终浓度比为0～6:1。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒的应用，其中，所述步骤(2)中，恒温反应的时间为10min～60min。

一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒的应用，其中，所述步骤(2)中，灭活的条件为温度85℃、时间5min。

有益效果：本发明通过rt-lamp技术与钙黄绿素可视化技术相结合的方法，对新型鸭呼肠孤病毒进行检测，操作更加简单，检测更加方便快捷，同时，敏感性比常规rt-pcr高约100倍，解决现有技术中对新型鸭呼肠孤病毒检测方法操作复杂、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。

附图说明

图1为primer1的rt-lamp产物酶切产物电泳图。

图1中泳道m：2000bpdnamarker；泳1：酶切产物；泳道2：阳性；泳道3：ddh2o阴性

图2为本发明引物特异性检测荧光图。

图3为本发明引物特异性检测电泳图。

图2、3中，m：2000bpdnamarker；1：阳性质粒样品；2：阳性rna样品；3～10：mdrv、arv、dpv、dhav、nd、h9+h5；h7；dtmuv；11：ddh2o阴性。

图4为本发明引物rt-lamp反应体系温度与荧光亮度关系图。

图5为本发明引物rt-lamp反应体系温度与电泳亮度关系图。

图4、5中，m：2000bpdnamarker；1～8：66℃、65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃；9：ddh2o阴性。

图6为本发明引物rt-lamp反应时间与荧光亮度关系图。

图7为本发明引物rt-lamp反应时间与电泳亮度关系图。

图6、7中，m：2000bpdnamarker；1～6：10min、20min、30min、40min、50min、60min；7：ddh2o阴性。

图8为本发明引物rt-lamp反应中钙黄绿素和锰离子的比例与荧光亮度关系图。

图9为本发明引物rt-lamp反应镁离子浓度与荧光亮度关系图。

图10为本发明引物rt-lamp反应镁离子浓度与电泳亮度关系图。

图9、10中，m：2000bpdnamarker；1～7中镁离子浓度分别为0mmol/l、1.0mmol/l、2.0mmol/l、3.0mmol/l、4.0mmol/l、5.0mmol/l、6.0mmol/l；8：ddh2o阴性。

图11为本发明引物rt-lamp反应甜菜碱浓度与荧光亮度关系图。

图12为本发明引物rt-lamp反应甜菜碱浓度与电泳亮度关系图。

图11、12中，m：2000bpdnamarker；1～4中甜菜碱浓度分别为0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l；5：ddh2o阴性。

图13为本发明引物rt-lamp反应dntps浓度与荧光亮度关系图。

图14为本发明引物rt-lamp反应dntps浓度与电泳亮度关系图。

图13、14中，m：2000bpdnamarker；1～6中dntps浓度分别为0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l；7：ddh2o阴性。

图15为本发明引物rt-lamp反应amv酶浓度与荧光亮度关系图。

图16为本发明引物rt-lamp反应amv酶浓度与电泳亮度关系图。

图15、16中，m：2000bpdnamarker；1～6中amv酶浓度分别为0.06u/μl、0.08u/μl、0.1u/μl、0.12u/μl、0.14u/μl、0.16u/μl；7：ddh2o阴性。

图17为本发明引物rt-lamp反应bst聚合酶浓度与荧光亮度关系图。

图18为本发明引物rt-lamp反应bst聚合酶浓度与电泳亮度关系图。

图17、18中，m：2000bpdnamarker；1～6中bst聚合酶浓度分别为0.08u/μl、0.16u/μl、0.24u/μl、0.32u/μl、0.4u/μl、0.48u/μl；7：ddh2o阴性。

图19为本发明引物rt-lamp反应10×buffer体积分数与荧光亮度关系图。

图20为本发明引物rt-lamp反应10×buffer体积分数与电泳亮度关系图。

图19、20中，m：2000bpdnamarker；1～6中10×buffer体积分数分别为0μl、4％μl、8％μl、10％μl、12％μl、16％μl；7：ddh2o阴性。

图21为本发明引物rt-lamp反应内外引物浓度比例与荧光亮度关系图。

图22为本发明引物rt-lamp反应内外引物浓度比例与电泳亮度关系图。

图21、22中，m：2000bpdnamarker；1：fip+bip0.4μmol/l、f3+b30.2μmol/l；2：fip+bip0.8μmol/l，f3+b30.2μmol/l；3：fip+bip1.2μmol/l，f3+b30.2μmol/l；4：fip+bip1.6μmol/l，f3+b30.2μmol/l；5：fip+bip2.0μmol/l，f3+b30.2μmol/l；6：fip+bip2.4μmol/l，f3+b30.2μmol/l；7：ddh2o阴性。

图23为本发明引物rt-lamp反应环外引物浓度比例与荧光亮度关系图。

图24为本发明引物rt-lamp反应环外引物浓度比例与电泳亮度关系图。

图23、24中，m：2000bpdnamarker；1：loopf+loopb0μmol/l、f3+b30.2μmol/l；2：loopf+loopb0.2μmol/l、f3+b30.2μmol/l；3：loopf+loopb0.4μmol/l、f3+b30.2μmol/l；4：loopf+loopb0.6μmol/l、f3+b30.2μmol/l；5：loopf+loopb0.8μmol/l、f3+b30.2μmol/l；6：loopf+loopb1.0μmol/l、f3+b30.2μmol/l；7：loopf+loopb1.2μmol/l、f3+b30.2μmol/l；8：ddh2o阴性。

图25为本发明ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp方法的敏感性分析荧光图。

图26为本发明ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp方法的敏感性分析电泳图。

图27为本发明ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp方法的阳性质粒名感性验证荧光图。

图28为本发明ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp方法的阳性质粒名感性验证电泳图。

图25、26、27、28中，m：2000bpdnamarker；1～7中drv-qy株基因组rna量分别为2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg；8：ddh2o阴性。

具体实施方式

本发明提供一种钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下结合具体实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中，新型鸭呼肠孤病毒qy株(drv-qy)、番鸭呼肠孤毒株(mdrv)、禽呼肠孤毒株(arv)和鸭瘟疫苗(dpv)、鸭肝炎疫苗(dhav)、鸭新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(h9+h5)疫苗、禽流感(h7)疫苗、鸭坦布苏病毒(dtmuv)均由佛山科学技术学院预防兽医实验室保存和提供，bstdna大片段聚合酶(配备10×thermopolbuffer)、amv反转录酶、dntps、硫酸镁(mgso4)均产自neb公司，甜菜碱(betaine)、钙黄绿素(calcein)、氯化锰(mncl2)产自sigma公司，trizolreagent试剂盒、rri、randomprimer、ex-taqdna聚合酶、琼脂糖产自takara公司，异戊醇、无水乙醇等为国产分析纯试剂，一次性密闭核酸检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司。

实施例1：引物设计

以drv-qy株sigmab基因序列为设计模板(全长1104bp)，应用lamp在线引物设计软件primerexplorer4设计出若干套引物，利用larsergene7.0primerselect和oligo7.0对引物进行筛选，并利用primer-blast检索所设计引物的特异性，既要保证每套引物进行rt-lamp扩增时具有较优的理论值，又要保证各引物对之间产生最少的二聚体和具有良好保守性及特异性。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，设计筛选出的引物如下：

表1rt-lamp钙黄绿素可视化引物(primer1)

rt-lamp钙黄绿素可视化引物在基因中的位置如下：

(注：方框内加粗的四个“ccgg”碱基为hpaⅱ酶的酶切位点，fip由f1c(f1的互补序列)和f2序列组成，bip由b1c和b2(b2c的互补序列)序列组成。)

实施例2：酶切鉴定引物特异性

用hpaⅱ酶对primer1的rt-lamp产物进行酶切，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，在100bp～250bp范围靠近100bp处有酶切条带，这与预算的两个条带(127bp和114bp)大小相符，表明primer1的rt-lamp产物的酶切特异性良好。

新型鸭呼肠孤病毒的钙黄绿素可视化rt-lamp试剂盒的应用，包括步骤：

s1、配制rt-lamp反应体系：加入钙黄绿素、氯化锰、硫酸镁、甜菜碱、dntps、amv酶、bst聚合酶、10倍反应缓冲液、上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip、下游内引物bip、环引物loopf、环引物lb以及待测样品；

s2、反应：将步骤s1配制好的反应体系反应，条件为59～66℃恒温反应，然后灭活；

s3、结果判读：

在自然光或紫外光下判读反应的结果或者二者结合判读:

在自然光下，反应产物为绿色，说明测试样品中含有新型鸭呼肠孤病毒；在自然光下，反应产物为橙色，说明测试样品中不含新型鸭呼肠孤病毒；

在紫外光下，反应产物为荧光绿色，说明测试样品中含有新型鸭呼肠孤病毒；在紫外光下，反应产物为浅蓝色或接近透明，说明测试样品中不含新型鸭呼肠孤病毒。

以下实施例中，荧光绿色越强或电泳条带越亮，则说明产物中新型鸭呼肠孤病毒含量越高

实施例3：引物特异性验证

用primer1引物分别对drv、mdrv、arv、dpv、dhav、nd、h9+h5、h7、鸭坦布苏病毒(dtmuv)进行rt-lamp特异性试验，然后进行荧光观察和2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2和图3所示，表明primer1引物对drv特异性良好。

实施例4：rt-lamp检测体系的建立

设计59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃共8个温度梯度，其他成分的用量如表2所示，进行rt-lamp反应，每个反应重复3次以上，产物用荧光和2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出rt-lamp反应的最佳反应温度。结果如图4和5所示，由图4和5可知，65℃为rt-lamp反应的最佳反应温度。

设计10min、20min、30min、40min、50min、60min6个时间梯度进行rt-lamp反应，其他成分的用量如表2所示，进行rt-lamp反应，每个反应重复3次以上，产物用荧光和2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出rt-lamp反应的最佳反应温度。结果如图6和7所示，由图6和7可知，最佳反应时间为50min。

钙黄绿素可视化rt-lamp初始反应体系(25μl)如表2所示：

表2ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp方法初始反应体系和反应条件

实施例5：rt-lamp检测体系的优化(以下实验均按25.0μl记算)

一、设计钙黄绿素和锰离子的终浓度比为1:8、1:12、1:16、1:32、1:64、1:128、1：10、1:12和1:24进行rt-lamp反应，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行rt-lamp反应，每个反应重复3次以上，产物用荧光和2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出rt-lamp反应的最佳钙黄绿素与锰离子的终浓度比。结果如图8所示，由图8可知，当钙黄绿素和锰离子终浓度比为25μmol/l:0.3mmol/l(1:12)时，钙黄绿素可视化rt-lamp反应的阳性和阴性结果区分最明显。

二、设计镁离子浓度为0mmol/l、1mmol/l、2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l和6mmol/l7个浓度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行rt-lamp反应，每个反应重复3次以上，产物用荧光和2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出rt-lamp反应的最佳反应镁离子浓度。结果如图9和10所示，由图9和10可知，在镁离子终浓度为3.0mmol/l前(泳道1～3)，随着镁离子浓度的增加，反应效率呈现上升趋势；当浓度大于3.0mmol/l时(泳道4～7)，反应效率下降但又趋于平稳，故最佳反应镁离子浓度为3.0mmol/l。

三、设计0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l4个甜菜碱终浓度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行rt-lamp反应，每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出rt-lamp反应的最佳反应甜菜碱浓度。结果如图11和12所示，由图11和12可知，无甜菜碱时，该反应仍然可以顺利扩增，但甜菜碱浓度为0.5mmol/l时条带最亮，反应最佳，甜菜碱浓度大于0.5mmol/l时反而会使反应扩增效率下降。

四、设计0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l6个dntps浓度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行rt-lamp反应。每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳dntps浓度。结果如图13和14所示，由图13和14可知，终浓度为0.3mmol/l的dntps能够使反应顺利进行，故最佳dntps浓度为0.3mmol/l(泳道2)。

五、设计0.06u/μl、0.08u/μl、0.1u/μl、0.12u/μl、0.14u/μl、0.16u/μl6个amv酶浓度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行钙黄绿素可视化rt-lamp反应。每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳amv酶浓度。结果如图15和16所示，由图15和16可知，当amv酶终浓度为0.14u/μl时，钙黄绿素可视化rt-lamp反应扩增效率最高(泳道5)，amv酶浓度增加反而使反应效率下降。故0.14u/μl为该rt-lamp反应的最佳amv反转录酶终浓度。

六、设计0.08u/μl、0.16u/μl、0.24u/μl、0.32u/μl、0.4u/μl、0.48u/μl6个bst聚合酶浓度梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行钙黄绿素可视化rt-lamp反应。每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳bst聚合酶浓度。结果如图17和18所示，由图17和18可知，泳道4、5、6在rt-lamp反应进行至22min时，反应速度比泳道1、2、3的要快，从紫外下钙黄绿素亮度可判断，随着bst聚合酶的浓度增加，反应速度是上升的，但是只有在浓度为0.32u/μl(泳道4)时，最终扩增效率最大，故钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳bst聚合酶浓度为0.32u/μl。

七、设计0μl、1μl、2μl、2.5μl、3μl、4μl6个10×buffer梯度，其他成分的用量如表2所示，由rnase-freewater补足差量，进行钙黄绿素可视化rt-lamp反应。每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳10×buffer加入量。结果如图19和20所示，由图19和20可知，从紫外可视化图可知，从开始至25min时，泳道3、4、5反应速度比较快，但从跑胶结果可知，在泳道4时(2.5μl)，最终扩增效率最佳，能使反应顺利进行，故最佳钙黄绿素可视化rt-lamp反应的10×buffer加入量为2.5μl(即在25μl反应体系中的含量为10％)。

八、分别设计内引物和外引物浓度比为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1，由rnase-freewater补足差量，具体的，依次设计fip+bip为0.4μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、fip+bip为0.8μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、fip+bip为1.2μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、fip+bip为1.6μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、fip+bip为2.0μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、fip+bip为2.4μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l，其他成分的用量如表2所示，进行钙黄绿素可视化rt-lamp反应。每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳内引物和外引物比例。结果如图21和22所示，由图21和22可知，在反应至20min时，泳道3、4、5的反应速度相当，但比泳道1、2、6的要快；由跑胶图可知泳道5最终扩增效率最高，故钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳内引物和外引物比例为10:1(fip+bip2.0μmol/l，f3+b30.2μmol/l)。

九、分别设计环引物和外引物浓度比例比为0、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1，由rnase-freewater补足差量，具体的，依次设计loopf+loopb为0μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、loopf+loopb为0.2μmol/l与f3+b30.2μmol/l、loopf+loopb为0.4μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、loopf+loopb为0.6μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、loopf+loopb为0.8μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、loopf+loopb为1.0μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l、loopf+loopb为1.2μmol/l与f3+b3为0.2μmol/l；其他成分的用量如表2所示，进行钙黄绿素可视化rt-lamp反应，每个反应至少重复3次，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，优化出钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳环引物和外引物比例。结果如图23和24所示，由图23和24可知，环引物与内引物比例在3:1时，从开始至20min时的反应速率最快，但最终扩增效率并不佳；由电泳图可知，当不加入环引物(泳道1)时，并无扩增条带产生，当环引物与内引物比例在4:1(泳道5)时，最终扩增效率最佳，可使反应有些进行，故钙黄绿素可视化rt-lamp反应的最佳环引物和外引物比例为4:1(loopf+loopb0.8μmol/l，f3+b30.2μmol/l)。

经过反应条件和反应体系的优化，最终确定ndrvrt-lamp的反应体系和反应条件如表3所示：

表3ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp反应优化后反应体系和反应条件

实施例6

对前面建立的ndrv钙黄绿素可视化rt-lamp方法进行敏感性分析，结果显示(图25、26)，该方法对drv-qy株基因组rna的最低检测量为200fg，并且经阳性质粒名感性验证结果一致。

综上所述，本发明通过rt-lamp技术与钙黄绿素可视化技术相结合的方法，对新型鸭呼肠孤病毒进行检测，操作更加简单，检测更加方便快捷，同时，敏感性比常规rt-pcr高约100倍，解决现有技术中对新型鸭呼肠孤病毒检测方法操作复杂、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

seqidno1：

cgtggatggtcaaagtcgt

seqidno2：

acctacactccaggaaggac

seqidno3：

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seqidno4：

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seqidno7：

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