一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

据世界卫生组织报道，糖尿病、癌症、心血管疾病和呼吸系统疾病是四大慢性非传染性疾病。自1980年以来，患糖尿病的成年人数目增长了四倍，已达到4.22亿。目前研究表明，葫芦巴种子可用于临床治疗二型糖尿病，而在葫芦巴种子中起关键作用的物质就是(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(4-HIL)。4-HIL是一种非蛋白质氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗，调节血脂异常等生理功能，因此4-HIL在治疗二型糖尿病方面有良好的应用前景。但是目前4-HIL的产量还很低，难以满足市场需求。4-HIL的制备方法主要有：葫芦巴种子提取法、化学-酶合成法、酶合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法是生产4-HIL最简单、有效和经济的方法。

葫芦巴种子是目前所知的4-HIL含量最为丰富的天然生物材料。自1973年以来，人们不断尝试并改进葫芦巴种子的4-HIL分离提取方法，虽然目前用这种方法实现了4-HIL的生产，但是却存在着材料受限、工艺复杂、分离成本高、得率低和纯度较低等问题，总收率都不足1％，这使得4-HIL的产量很低，价格异常昂贵。化学-酶合成法则需要八步或者六步化学-酶反应，才能合成出4-HIL，不仅工艺复杂、步骤繁琐，而且分离成本较高、得率较低且纯度较低，致使这类方法没有进展下去。2007年研究者又发现了4-HIL的两步酶合成法，但是由于4-HIL产率低、副产物含量高而使得相关研究没有深入下去。最近，苏云金芽孢杆菌异亮氨酸双加氧酶(IDO)的发现使得4-HIL的生物合成成为可能。

IDO催化L-异亮氨酸发生4-羟化反应，生成4-HIL，同时使α-酮戊二酸发生氧化反应，生成琥珀酸，这个反应需要消耗氧气并生成二氧化碳(图1)。通过在大肠杆菌中克隆表达IDO编码基因ido，就可以将外源添加的L-异亮氨酸转化成4-HIL。但是由于大肠杆菌本身并不积累L-异亮氨酸，因此在这个微生物发酵体系中需要外源添加L-异亮氨酸，这无疑会增加4-HIL的生产成本。谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum)SN01是一株L-异亮氨酸生产菌，在这株菌中克隆、表达ido基因后，可以将其自身积累的L-异亮氨酸转化成4-HIL，从而实现4-HIL的一步从头合成，无需添加L-异亮氨酸等前体物质，具有明显的技术优势。然而，在利用重组表达了异亮氨酸双加氧酶的谷氨酸棒杆菌生产4-HIL时，尽管L-异亮氨酸是4-HIL的直接底物，但在L-异亮氨酸达到一定浓度后，提高L-异亮氨酸的供应量却会导致4-HIL产量降低，从而使得4-HIL的产量无法预期，造成4-HIL生产的技术困难。具体表现为，当L-异亮氨酸的浓度比较低时，IDO的活性会随着底物L-异亮氨酸浓度的提高而提高，但是当L-异亮氨酸的浓度超过20mM以后，IDO的活性却又受到L-异亮氨酸底物的抑制，且L-异亮氨酸浓度越高，抑制程度越强。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一株共表达异亮氨酸双加氧酶基因和透明颤菌血红蛋白基因的重组谷氨酸棒杆菌，用于催化L-异亮氨酸生成4-HIL，并解除底物L-异亮氨酸对双加氧酶的底物抑制，进而提高发酵法生产4-HIL的产量。

所述重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(Corynebacteriumglutamicum ssp.lactofermentum)SN01/pJYW-4-ido-vgb。是以L-异亮氨酸生产菌——谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01(保藏编号为：CCTCC NO:M2014410，记载和公布于Appl MicrobiolBiotechnol,2015,99(9):3851-3863)为宿主，以pJYW-4-ido-vgb为重组表达载体，采用tacM启动子，表达来源于苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶基因ido和来自透明颤菌的血红蛋白基因vgb。

所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括以下步骤：

(1)获得ido基因：以苏云金芽孢杆菌YBT-1520基因组DNA为模板，PCR获得ido基因；

(2)获得载体pJYW-4-ido：将片段ido和质粒pJYW-4均经过Apa I、Hpa I双酶切并纯化后连接，得到pJYW-4-ido；

(3)构建谷氨酸棒杆菌表达载体pJYW-4-ido-vgb：以透明颤菌基因组DNA为模板，PCR扩增基因vgb，将片段vgb和质粒pJYW-4-ido均经过BamHI、Sal I双酶切并纯化后连接，得到pJYW-4-ido-vgb。

(4)获得重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW-4-ido-vgb：提取质粒pJYW-4-ido-vgb，转化谷氨酸棒杆菌SN01，获得重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW-4-ido-vgb。

本发明还提供应用所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产4-HIL的方法，重组菌株发酵过程中发酵培养温度为30℃，200rpm培养144h。所用发酵培养基为：葡萄糖140g/L，(NH4)2SO420g/L，玉米浆10g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.5g/L，CaCO320g/L，pH 7.2。

本发明的有益效果：以自身积累L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌SN01作为出发菌，pJYW-4为载体，成功构建了利用tacM启动子共表达ido和vgb的谷氨酸棒杆菌重组菌株SN01/pJYW-4-ido-vgb。对重组菌SN01/pJYW-4-ido-vgb的发酵特性进行了分析。结果显示，vgb的表达使得重组菌SN01/pJYW-4-ido-vgb的菌浓比对照菌SN01/pJYW-4-ido提高了13.4％，且在发酵中期L-异亮氨酸积累量比对照菌提高的情况下，IDO的酶活不降反增，最终使得重组菌SN01/pJYW-4-ido-vgb的4-HIL发酵产量比对照菌SN01/pJYW-4-ido提高了50.0％，单位菌体的4-HIL发酵产量比对照菌提高了32.1％。说明通过共表达VHb，能够解除L-异亮氨酸对IDO的底物抑制，从而显著提高了重组菌的4-HIL产量。

附图说明

图1：IDO催化的L-异亮氨酸生成4-HIL反应。

图2：质粒pJYW-4-ido酶切验证图。M：1kb Marker；1：pJYW-4；2、3：pJYW-4-ido。pJYW-4经XbaI单酶双切后大小为141bp、6862bp，pJYW-4-ido经XbaI单酶双切后大小为880bp、6862bp。

图3：PCR扩增ido基因片段。M：1kb Marker；4、5：ido扩增片段，为757bp。

图4：质粒pJYW-4-ido-vgb酶切验证图。M1：1kb Marker；1、2：pJYW-4-ido-vgb用NotI和Sal I双酶切结果，大小分别为1200bp和7000bp左右。

图5：PCR验证质粒pJYW-4-ido-vgb。M2：2000bp的Maker；3、4：p4-ido-vgb以vgb-F/vgb-R作为上下游引物PCR验证结果，预计条带大小为480bp左右。

图6：发酵测定：(A)菌浓(B)残糖(C)4-HIL浓度(D)L-异亮氨酸浓度；方形：SN01/pJYW-4-ido，三角形：SN01/pJYW-4-ido-vgb。

具体实施方式

大肠杆菌JM109培养温度为37℃，所用培养基为LB培养基(酵母提取物4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；固体培养基添加琼脂粉18g/L)。

谷氨酸棒杆菌培养温度为30℃，所用培养基为LBG培养基(葡萄糖4g/L，酵母膏4g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)。

谷氨酸棒杆菌所用感受态培养基为：酵母粉4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，吐温801g/L，甘氨酸30g/L。

谷氨酸棒杆菌电转化恢复用LB HIS培养基为：蛋白胨4g/L，酵母提取物2.5g/L，NaCl4g/L，D-山梨醇91g/L，脑心浸液18.5g/L；固体培养基添加琼脂粉18g/L。

重组谷氨酸棒杆菌的种子培养基为：葡萄糖25g/L，(NH4)2SO40.5g/L，尿素1.25g/L，玉米浆40g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，pH 7.0。

重组谷氨酸棒杆菌的发酵培养基为：葡萄糖140g/L，(NH4)2SO420g/L，玉米浆10g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.5g/L，CaCO320g/L，pH 7.2。

菌浓的检测方法：将发酵过程中取出的发酵液用1M稀盐酸稀释一定倍数后(由于发酵过程中添加一定量的碳酸钙调节pH，为了消除碳酸钙的影响，用稀盐酸代替ddH2O稀释)，用紫外可见分光光度计在波长562nm条件下测量OD值。

4-HIL和L-异亮氨酸的检测方法：氨基酸产量用HPLC衍生化法测定：样品经过5％的三氯乙酸稀释50倍后放置沉淀2h，12000r/min离心10min，上清用滤膜过滤后用HPLC测样。测定试剂为流动相水相buffer A(1L)：醋酸钠3.01g，三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，用5％醋酸调pH至7.2；有机相buffer B(1L)：醋酸钠3.01g溶解后用5％醋酸调pH至7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇。梯度洗脱条件为：0min 8％buffer B，20min 60％buffer B，25min 100％buffer B，28.5min 8％buffer B，色谱柱温为40℃，流速为1.0mL/min。

实施例1：载体pJYW-4-ido的获得

以苏云金芽孢杆菌YBT-1520基因组DNA为模板，根据GenBank公布的异亮氨酸双加氧酶基因ido(GenBank accession no.CP004858.1,locus_tag YBT1520_06070)序列，设计引物，用ido-F/ido-R为引物PCR扩增异亮氨酸双加氧酶基因ido，引物设计如下：

ido-F：5’-CCGGGGCCCAGAAGGAGGTATAGGATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAGAAGAAAAGG-3’；ido-R：5’-CGAGGTTAACGTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTT-3’。

扩增目的片段所用酶均为高保真的PrimerStar DNA聚合酶，反应体系为50μL：5×PSBuffer 10μL，dNTP 4μL，模板1μL，上下游引物各0.5μL，酶0.25μL，ddH2O补齐。PCR扩增反应条件为：1、95℃预变性10min；2、95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸数分钟(延伸时间由扩增片段的长度决定，每1000bp扩增长度延伸时间为1min)；循环数34；3、最后72℃延伸10min；10℃保温。PCR获得的片段ido和实验室前期构建的质粒pJYW-4(pJYW-4的构建方法参见专利号为ZL201410057876.X的专利)均经过Apa I、Hpa I双酶切并纯化后连接到pJYW-4上，转化大肠杆菌JM109后在卡那霉素抗性LB平板筛选转化子，得到pJYW-4-ido。图2所示为重组质粒pJYW-4-ido酶切验证图，图3是扩增ido基因图。

实施例2：载体pJYW-4-ido-vgb和重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW-4-ido-vgb的获得

然后，再以透明颤菌基因组DNA为模板，根据GenBank公布的透明颤菌血红蛋白基因vgb(GenBank accession no.AF292694.1)序列设计引物，用vgb-F/vgb-R为引物PCR扩增基因vgb，引物设计如下：

vgb-F：5’-ATAGGATCCAGAAGGAGATATACGATGTTAGACCAGCAAACCAT-3’；

vgb-R：5’-CCTGTCGACTTATTCAACCGCTTG-3’。

以质粒pJYW-4-ido为载体，重复上述扩增、酶切、纯化、连接和化转筛选等步骤，将片段vgb和质粒均经过BamH I、Sal I双酶切并纯化后连接到pJYW-4-ido上，得到pJYW-4-ido-vgb。图4是扩增vgb基因图，图5所示为重组质粒pJYW-4-ido-vgb酶切验证图。

提取质粒pJYW-4-ido和pJYW-4-ido-vgb，用电转法转化谷氨酸棒杆菌SN01，涂布于含卡那霉素的LBHIS平板，约36h后长出转化子。随机挑取若干菌落于LB培养基中培养后，提取质粒。质粒的酶切结果及线性化大小都与目的质粒一致，证明重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW-4-ido和SN01/pJYW-4-ido-vgb构建成功。

实施例3：重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW-4-ido-vgb的4-HIL发酵

对成功获得的重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW-4-ido和SN01/pJYW-4-ido-vgb进行摇瓶发酵对比。

种子培养基为：葡萄糖25g/L，(NH4)2SO40.5g/L，尿素1.25g/L，玉米浆40g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，pH 7.0。种子培养温度为30℃，使用回旋式摇床150rpm培养18h。

发酵培养基为：葡萄糖140g/L，(NH4)2SO420g/L，玉米浆10g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.5g/L，CaCO320g/L，pH 7.2。发酵过程中发酵培养温度为30℃，使用回旋式摇床200rpm培养144h，每12h取一次样测菌浓、残糖和4-HIL及其他氨基酸的产量等。

图6是两个菌株4-HIL发酵的发酵进程。结果表明，重组菌SN01/pJYW-4-ido-vgb不仅菌体生长能力变强，菌浓(31.04±0.21g/L)比对照菌SN01/pJYW-4-ido(27.37±0.51g/L)提高了13.4％，而且在发酵中期48h～108h L-异亮氨酸积累量比对照菌提高的情况下，IDO的酶活(20.5U/L)并没有降低，反而比对照菌(6.0U/L)增加了2.4倍，使得4-HIL的总合成速率由0.074g/(L*h)提高到0.11g/(L*h)，最终4-HIL产量(15.89±1.46g/L)比对照菌SN01/pJYW-4-ido(10.59±0.82g/L)提高了50.0％，单位菌体的4-HIL发酵产量比对照菌提高了32.1％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

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