一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用与流程

本发明涉及紫花苜蓿领域，特别是涉及一种紫花苜蓿启动子及其制备方法和应用。
背景技术：
：启动子是一段位于结构基因5’端上游的DNA序列，能与RNA聚合酶结合，使之与模板DNA准确结合并起始转录。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box等核心顺式作用元件，按功能及作用方式可大致将其分为组成型表达启动子、时空特异性表达启动子和诱导型表达启动子三类。目前，植物启动子已经被大量的分离并研究，花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子和木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子即组成型启动子。Pyk10启动子是拟南芥中的组织特异性表达启动子。组成型表达的启动子在植物基因工程的早期研究中发挥了重要的作用，但是在应用过程中也存在一定的问题。组成型启动子在转基因作物中驱动相关基因持续高量的表达可能造成物质和能量上的浪费，甚至会影响作物的产量和品质，而特定时空表达和诱导型表达的启动子可以较好地解决这一问题。如马铃薯中冷诱导表达启动子pCL、拟南芥中干旱诱导表达启动子Prd29A等。紫花苜蓿是世界上分布最广的一种多年生豆科牧草，也是我国最重要的豆科牧草之一。它不仅产量高而且营养丰富，为誉为“牧草之王”。但由于紫花苜蓿多年生，多倍体的特点，目前对紫花苜蓿基因方面的研究还远远落后于其它作物。对于紫花苜蓿启动子研究的相关报道还比较少。维生素E是动物不能合成但又必须的营养物质。在维生素E的生物合成中，对羟基苯丙酮酸双加氧酶是第一个关键酶，对于维生素E的合成具有重要作用。本专利以紫花苜蓿为材料，研究编码对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因的启动子，旨在阐明该启动子不同区域发挥的功能，及其响应的诱导条件，为更真实的了解紫花苜蓿的基因表达调控特性，进而帮助我们了解紫花苜蓿的维生素E性状形成的生物学过程，探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好地控制基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。同时也为一个诱导型启动子，尤其是光/暗诱导启动子的开发奠定了理论基础。技术实现要素：本发明的第一目的是提供一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子。本发明的第二目的是提供一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法。本发明的第三目的是提供一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子的应用。一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其基因序列如序列表中SEQIDNO:1所示。本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)基因组DNA的获取；(2)特异性引物的设计；(3)1stPCR反应；(4)2ndPCR反应；(5)3rdPCR反应；(6)取1st、2nd、3rdPCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳；(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；所述SP3Primer如序列表中SEQIDNO:4所示。本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体包括：取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasyPlantMaxiKit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg。本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体包括：根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；设计方向为5'端；设计原则为：SP2位于SP1内侧，SP3位于SP2内侧；每两个引物之间的距离为100bp左右，引物长度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；所述引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQIDNO:2-4所示。本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(3)具体包括：基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARAgenomewalking试剂盒APPrimer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1stPCR反应；A.按表1中的组份配制1stPCR反应液：表1试剂使用量紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL2μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSPPrimer，10pmol/μl1μldH2O32.5μlB.1stPCR反应条件及步骤如表2所示：表2本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(4)具体包括：取1μl1stPCR反应液作为2ndPCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行2ndPCR反应；A.按表3中的组份配制2ndPCR反应液：表3B.2ndPCR反应条件及步骤如表4所示：表4本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(5)具体包括：取1μl2ndPCR反应液作为3rdPCR反应的模板，以APPrimer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行3rdPCR反应；A.按表5中的组份配制3rdPCR反应液：表5试剂使用量2ndPCR反应液1μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP3Primer，10pmol/μl1μldH2O33.5μl总体积50μlB.3rdPCR反应条件及步骤如表6所示：表6本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及逆境反应中的应用。用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对该启动子序列进行了分析，发现该启动子中存在逆境响应，水杨酸(SA)以及多个光响应原件。为验证该启动子对MsHPPD基因的调控功能，构建了HPPDpromoter：：35S植物表达载体，将该载体转化到拟南芥中。用SA、干旱(PEG)、盐(NaCl)、脱落酸(ABA)和光/暗对转基因拟南芥幼苗进行处理，然后将整个植株进行GUS组织化学染色处理。结果显示：经水杨酸，PEG，NaCl，ABA多种逆境处理后，与PBI::GUS对照相比，GUS染色浓度升高；光/暗处理时，暗处理后，GUS染色浓度显著升高，而恢复光照后，GUS染色变浅。结果说明，HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中起到了重要作用，可以作为一个逆境响应，尤其是光调控响应的启动子使用。本发明的有益效果在于：(1)获得了HPPD基因的启动子基因序列，并发现了HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中的应用。(2)阐明了该启动子不同区域发挥的功能，及其响应的诱导条件，为更真实的了解紫花苜蓿的基因表达调控特性，进而可以了解紫花苜蓿的维生素E性状形成的生物学过程，探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好地控制基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。同时也为一个诱导型启动子，尤其是光/暗诱导启动子的开发奠定了理论基础。下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用作进一步说明。附图说明图1为GUS组织化学的染色结果彩色图；图2为GUS组织化学的染色结果灰度图。具体实施方式紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其基因序列如序列表中SEQIDNO:1所示。通过染色体步移技术获得该序列，具体方法为：(1)基因组DNA的获取取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasyPlantMaxiKit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg。(2)特异性引物的设计根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；设计方向为5'端；设计原则为：SP2位于SP1内侧，SP3位于SP2内侧；每两个引物之间的距离为100bp左右，引物长度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQIDNO:2-4所示。(3)1stPCR反应基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARAgenomewalking试剂盒APPrimer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1stPCR反应；A.按表1中的组份配制1stPCR反应液：表1试剂使用量紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL2μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSPPrimer，10pmol/μl1μldH2O32.5μlB.1stPCR反应条件及步骤如表2所示：表2(4)2ndPCR反应取1μl1stPCR反应液作为2ndPCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行2ndPCR反应；A.按表3中的组份配制2ndPCR反应液：表3试剂使用量1stPCR反应液1μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP2Primer，10pmol/μl1μldH2O33.5μl总体积50μlB.2ndPCR反应条件及步骤如表4所示：表4(5)3rdPCR反应取1μl2ndPCR反应液作为3rdPCR反应的模板，以APPrimer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行3rdPCR反应；A.按表5中的组份配制3rdPCR反应液：表5试剂使用量2ndPCR反应液1μLdNTPMixture，2.5mMeach8μl10×LAPCRBufferII，Mg2+plus5μlTaKaRaLATaq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP3Primer，10pmol/μl1μldH2O33.5μl总体积50μlB.3rdPCR反应条件及步骤如表6所示：表6(6)取1st、2nd、3rdPCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；所述SP3Primer如序列表中SEQIDNO:4所示。并且最终实验结果表明：AP1Primer扩增出的条带最清晰，非特异性扩增少，便于后期回收，条带最长，效果最好。紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及逆境反应中的应用：用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对该启动子序列进行了分析，发现该启动子中存在逆境响应，水杨酸(SA)以及多个光响应原件。为验证该启动子对MsHPPD基因的调控功能，构建了HPPDpromoter::35S植物表达载体，将该载体转化到拟南芥中。用SA、干旱(PEG)、盐(NaCl)、脱落酸(ABA)和光/暗对转基因拟南芥幼苗进行处理，然后将整个植株进行GUS组织化学染色处理。结果显示：经水杨酸、PEG、NaCl、ABA多种逆境处理后，与PBI：：GUS对照相比，GUS染色浓度升高；光/暗处理时，暗处理后，GUS染色浓度显著升高，而恢复光照后，GUS染色变浅(如图1-2所示及表7所示)。表7GUS组织化学染色结果对照Control染色较浅PEG染色比对照深NaCl染色比对照深ABA染色比对照深SA染色比对照深黑暗染色比对照深恢复光照染色程度较黑暗处理浅结果说明，HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中起到了重要调控作用，可以作为一个逆境响应，尤其是光调控响应的启动子使用。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>一种紫花苜蓿启动子及其制备方法和应用<130>None<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1264<212>DNA<213>Artificial<220><223>HPPD启动子序列<400>1ggcttagtaatctagagttcggccgcgaggtaatcatagcctgaccaaaaattgttccat60ccaagaatcaaactcgggtatatacactaagcaagaattaagcatattacgcctcttaaa120aaaaacatattgcctaaattatttagcttaactaataaattggttcattcatatcaacaa180gaattgagtgtagattttcacttcaccgcatacaaatctcggttgaaacagatgtacata240ttaggtgtttgatgtacctcactgaaaaatatatatagaaaaaaaatgacacttaaatta300atatgacacttttagataaatgatgctgacaatttaaatctaataagaaataattgtggt360agctcataagtatgagcagaattaagatgtggttggaggcactgatagagaatgtgtttt420gtagatagatataaggtgctatgctggtttttggcaatgtaaattttgattggtttctaa480caatgtatttaaagaatatggtgatgaggatgctagattttagttatattcttgcgcaga540agtcggtttattaattattatgtgtgaggatgtttgatgtcatgcttatcttgtgttaga600taaacatcttttaatggttgacatgtttaacgtagactttaatggataaggaaaatatga660tgtttatatttgtcgtgttcacacgtttgatacatcagtagtcgtttgatcgagcccgaa720ctattcatattttaatataaattattcaatctcgatcaaccactactgaagtataattgt780gacaaattattcgatcgtaagatcgaagaaagtaatatcagttcatgaaattgcgattgc840gtttgccattcttatttggagttaactaacttaggttactttaatgaaagttgagtgtgg900aggatgttttttccggttcaatatttctaaaaacattccgacaaaaaaaacaaaaaacta960aaacaatactactatagaaagtcgtgtttttcttctccacttccaatattttatttcttg1020tctatttcctatgaaattatcatcttcaccatttcttccttcatcctcatccatccactc1080ttacacaccatttctcccacgcaacacacaaaattccaactacgccgtcgctccattact1140ctcatccaatcacatttctccacgtttcaccttccctcaacataaaaacaccaacaagta1200caacaacactcttacaaattctaacaacaacaccaagacaaacactaaaacaacaatctc1260catg1264<210>2<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物SP1<400>2gtgtttgtcttggtgttgttgtta24<210>3<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物SP2<400>3agagtaatggagcgacggcgtagttg26<210>4<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物SP3<400>4gttcgggctcgatcaaacgactactg26当前第1页1 2 3