一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用与流程

技术特征：

1.一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其特征在于：其基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)基因组DNA的获取；

(2)特异性引物的设计；

(3)1st PCR反应；

(4)2nd PCR反应；

(5)3rd PCR反应；

(6)取1st、2nd、3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳；

(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；

所述SP3Primer如序列表中SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求2所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体包括：取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasy Plant Maxi Kit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg。

4.根据权利要求3所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体包括：根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；

设计方向为5'端；设计原则为：SP2位于SP1内侧，SP3位于SP2内侧；每两个引物之间的距离为100bp左右，引物长度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；

所述引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQ ID NO:2-4所示。

5.根据权利要求4所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(3)具体包括：

基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARA genome walking试剂盒AP Primer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1st PCR反应；

A.按表1中的组份配制1st PCR反应液：

表1

试剂使用量紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL2μLdNTP Mixture，2.5mM each8μl10×LA PCR Buffer II，Mg²⁺plus5μlTaKaRa LA Taq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP Primer，10pmol/μl1μldH₂O32.5μl

B.1st PCR反应条件及步骤如表2所示：

表2

6.根据权利要求5所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(4)具体包括：取1μl 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行2nd PCR反应；

A.按表3中的组份配制2nd PCR反应液：

表3

B.2nd PCR反应条件及步骤如表4所示：

表4

7.根据权利要求6所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(5)具体包括：取1μl 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行3rd PCR反应；

A.按表5中的组份配制3rd PCR反应液：

表5

试剂使用量2nd PCR反应液1μLdNTP Mixture，2.5mM each8μl10×LA PCR Buffer II，Mg²⁺plus5μlTaKaRa LA Taq，5U/μl0.5μlAP1Primer，100pmol/μl1μlSP3Primer，10pmol/μl1μldH₂O33.5μl总体积50μl

B.3rd PCR反应条件及步骤如表6所示：

表6

8.权利要求1所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及逆境反应中的应用。