一种特异性结合GPC3的核酸适配体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性结合GPC3的核酸适配体及其应用。

背景技术：

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中位居世界第四位，死亡率位居第三位。中国占全球肝癌发病率及死亡率的一半，且发病率正在逐年升高。由于肝癌的特殊病理特点，患者早期常无症状，发现时多至中晚期，能接受包括外科手术、射频消融在内的“根治性”治疗的患者仅占20％左右，且长期疗效不理想，术后5年复发转移率高达60％-70％。因此，早期诊断与早期治疗是改善肝癌患者预后最有效的手段。

目前，临床多采用检测甲胎蛋白(AFP)水平来进行肝癌血清学监测。但是早期肝癌，AFP阳性检出率低于50％，且相当数量的慢性肝炎及肝硬化病例其血清AFP水平呈阳性反应，存在一定的漏诊率和误诊率，不适合作为肝癌早期诊断的指标。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是一个细胞膜蛋白，在原发性肝癌的发生发展中起重要作用，具有较高的敏感度和特异性，阳性检出率高于50％，在肝细胞癌中高表达，在肝脏良性病变及癌前病变中不表达或低表达，是原发性肝癌特别是AFP阴性肝癌的一个优选标记物。文献报道，GPC3联合AFP共同检测，阳性检出率可高达90％。

在已有研究中，针对肝癌血清和组织的GPC3表达水平的检测都依赖于抗GPC3抗体，灵敏度和特异性已得到认可，但抗体本身存在许多不足之处，如成本高、易降解、批间差异大、不易储存和运输等；在肝癌影像诊断方面，仍局限在观察器官或组织的形态学改变上，并没有针对特定靶分子的影像诊断试剂。因此，筛选特异性结合GPC3的新型分子、建立诊断肝癌的新方法对于肝癌的早诊早治具有重要意义。

核酸适配体(aptamer)，被称为“人工替代抗体”，是一种人工设计的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA)，利用体外筛选技术即“指数富集的配体系统进化”技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)获得，具有以三级结构(如发卡、口袋、凸环等)特异识别靶分子(如蛋白质、多肽、细胞、病毒、酶、染料分子等)的作用。核酸适配体的作用原理与抗体相似，同时又具有无免疫原性、可化学合成、易改造、成本低、稳定性好等优点，在临床诊断、新药开发以及基础研究中有着广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可特异性结合肝癌标志物GPC3的核酸适配体G625，所述GPC3特异性核酸适配体G625的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是提供GPC3特异性核酸适配体在肝癌诊断相关方面的应用。

所述的GPC3特异性核酸适配体G625的应用包括：

1)所述GPC3特异性核酸适配体G625在制备肝癌血清诊断试剂中的应用。

2)所述GPC3特异性核酸适配体G625在肝癌组织切片染色中的应用。

3)所述GPC3特异性核酸适配体G625在设计、制备肝癌相关的活体成像造影剂中的应用。

本发明利用基于毛细管电泳分离的SELEX技术，以GPC3蛋白为靶标，通过6轮反复筛选，对富集文库进行克隆测序，分析测得序列的亲和力和特异性，最终获得与GPC3高特异性结合的核酸适配体。

进一步地，本发明所述核酸适配体，在适配体的两端，可以进行基团修饰，所述修饰的基团包括但不局限于荧光分子、生物素、氨基、巯基、纳米物质、胆固醇或聚乙二醇基团。

进一步地，可以对所述核酸适配体的碱基进行修饰，使其具有较未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性，所述修饰包括但不局限于硫代、锁核酸、氨代、氟代或甲氧基修饰。

进一步地，将所述核酸适配体用于肝癌的体外、体内诊断，其中包括但不局限于酶联免疫反应、放射免疫测定、荧光方法检测及产品。

本发明优点在于：

1.本发明提供的GPC3特异性核酸适配体G625识别、结合GPC3的能力强，且合成简单、易修饰、稳定性好、成本低。相较之下，常规抗体工艺复杂、成本高、易降解、不易改造。

2.利用本发明的核酸适配体能够建立诊断肝癌的新方法，通过相应检测标定物的偶联，可进行肝癌的定性或定量检测。

附图说明

图1是本发明实施例中G625与GPC3蛋白结合力测定信号图；

图2是本发明实施例中流式细胞仪测定G625对Huh7和A549细胞的偏移；

图3是本发明实施例中流式细胞仪测定G625对Huh7和A549细胞的解离常数。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参阅《分子克隆》及所用仪器、试剂的说明书。

实施例1核酸适配体的筛选

1.设计并合成全长75个碱基的随机寡核苷酸文库，序列如SEQ ID NO.2所示，其中两端分别为20个碱基的固定序列，中间35个碱基为随机序列。

2.合成用于PCR扩增的上游引物(SEQ ID NO.3)和下游引物(SEQ ID NO.4)。

3.P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman-Coulter公司)，配备二极管阵列(PDA)。电泳缓冲液为30mM NaH₂PO₃、pH 7.5；分离电压-8kV，加压34mbar；温度25℃；压力34mbar进样随机寡核苷酸文库(10μM)与GPC3(0.1mg/ml)混合物(体积比1：1)10s；检测波长256nm。收集游离寡核苷酸峰后至蛋白峰间的结合寡核苷酸。

4.取步骤3中收集到的与GPC3结合的寡核苷酸进行扩增，扩增条件为：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，扩增10个循环；72℃，5min。

5.取链霉亲和素偶联的磁珠，结合步骤4中获得的PCR扩增产物，常温孵育20min，将双链DNA吸附到磁珠表面。加入150mM NaOH溶液常温变性5min，再用150mM HAc溶液中和，中和产物PAGE切胶纯化，纯化产物用于下一轮筛选。

6.根据步骤3、4、5循环6次，富集能与GPC3特异性结合的寡核苷酸。

实施例2核酸适配体的克隆与测序

在微量离心管中配制下列溶液，全量为5μl：pMD19-T Vector 1μl，适配体PCR产物0.2pmol，ddH₂O补充至5μl。加入5μl的Solution I。16℃反应30min。全量(10μl)加入至100μl Trans5α感受态细胞中，冰中放置30min。42℃加热45s后，再在冰中放置1min。加入890μl LB培养基，37℃振荡培养60min。在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养，形成单菌落。挑选白色单克隆菌落至2ml LB(Amp 80μg/ml)液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养16h，菌液交由上海生工测序。

实施例3核酸适配体的验证

测序得到82条序列。对测序结果进行整理分析，得到20条碱基组成不同的适配体序列。经结合力分析，获得特异性结合GPC3的核酸适配体G625。

G625的序列如SEQ ID NO.1所示。

考察1：生物膜干涉技术检测G625与GPC3蛋白的结合能力

采用ForteBio Octet Red 96生物分子相互作用仪对G625与GPC3蛋白的结合能力进行检测。用PBS pH 7.4稀释生物素标记的G625(Bio-G625)，至浓度为1μM。将Bio-G625偶联到SA传感器上，平衡。之后将结合了G625的传感器置于一系列不同浓度(0、75、150、375、750nM)的GPC3蛋白溶液中进行孵育，700s后转至PBS中解离、平衡。使用仪器配套软件Data Analysis 8.1对数据进行分析。图1为扣减背景(0nM GPC3溶液)后的信号曲线图，随着GPC3浓度的提高，结合到传感器上的GPC3的量增加，相应信号强度明显增强。软件分析可知，解离常数KD值为93.2±3.7nM，拟合常数R²＝0.98，检测有效。结果表明，G625与GPC3蛋白的结合力较强。

考察2：流式分析法检测G625与GPC3表达细胞的结合能力

人肝癌细胞Huh7(GPC3高表达)和人肺癌细胞A549(GPC3低表达)分别培养在含有10％FBS的DMEM高糖培养基中，细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养，所有流式实验所用细胞均处于对数生长期。分别收集5×10⁵的Huh7和A549细胞，将其和一系列不同浓度(0、5、25、100、500nM)的FAM标记的G625在100μl结合缓冲液(含有0.5％BSA的PBS溶液)中于37℃反应60min，PBS洗两次，用流式细胞仪检测；同等长度的随机文库作为随机对照。结果显示，500nM G625与Huh7细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照，而500nM G625与A549细胞孵育后的荧光强度与随机对照基本没有差别，见图2，表明筛选到的适配体G625能特异性结合GPC3，且G625与GPC3高表达的细胞结合强。利用GraphPad Prism5软件计算G625与Huh7和A549细胞的KD值。分析结果显示(图3)，G625与Huh7细胞的KD值为95.8±22.1nM，结合能力强于A549细胞(154.4±45.6nM)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院 上海艾津生物医药科技有限公司

<120> 一种特异性结合GPC3的核酸适配体及其应用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> G625

<400> 1

gtgacgctcc taacgctgac ggcagctgcc gtcgcgcgga gtgaggtgac tatgtcctgt 60

ccgtccgaac caatc 75

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213> 寡核苷酸文库

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(55)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

gtgacgctcc taacgctgac nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnncctgt 60

ccgtccgaac caatc 75

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 3

gtgacgctcc taacgctgac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 4

gattggttcg gacggacagg 20