沙福芽孢杆菌YJC‑4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用的制作方法

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一株沙福芽孢杆菌YJC-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用。

背景技术：

烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)是一种兼性寄生菌，会诱发烟草黑胫病(Tobacco Black Shank)，对烟草具有毁灭性危害。黑胫病菌喜高温高湿，温度在28-30℃，湿度达到80％以上时，会给病菌孢子囊的释放和游动孢子的传播创造有利条件，此时最易引起烟草黑胫病的流行与发生，引起烟株大面积死亡。烟草作为其寄主植物，在其团棵期到旺长期间发病达到高峰期，主要危害烟株根部和茎基部。另外，土地多年连作、与烟草青枯病、根结线虫病混合发生，将加重危害烟株健康，导致烟叶减产和烟叶质量降低。

土壤中主要含有细菌、真菌和放线菌3类微生物，研究发现许多芽孢杆菌作为拮抗菌对烟草黑胫病具有良好的防治效果。国内外众多研究表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等通过抗生、溶菌、竞争、重寄生等作用机制对烟草黑胫病具有良好的防治效果。有些拮抗菌对烟株有促生作用，促进烟苗氮、磷、钾吸收，可有效降低带病烟苗的发病率和病情指数。

目前也有商品化的枯草芽孢杆菌，但是在防治烟草黑胫病及促生长方面仍有不足。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供一株沙福芽孢杆菌，能有效防治烟草的黑胫病，并能对烟草的生长产生明显的促进作用。

一株沙福芽孢杆菌YJC-4，分类名为Bacillus safensis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月15日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12356。

进一步地，沙福芽孢杆菌YJC-4的菌体呈杆状，革兰氏染色显阳性。

进一步地，所述沙福芽孢杆菌YJC-4的培养基组份为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L。

进一步地，所述沙福芽孢杆菌YJC-4的培养条件为：30-35℃、pH7-8恒温震荡培养24-72h。优选35℃、pH7.5恒温震荡培养60h。

上述沙福芽孢杆菌YJC-4在防治烟草黑胫病中的应用。

进一步地，沙福芽孢杆菌YJC-4在防治烟草黑胫病中应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷cfu。

更进一步地，灌根采用分三次灌根的形式，第一次在烟株生长到5-6片真叶时，以后每隔7天灌根一次。更进一步地，三次灌根量相同。

上述沙福芽孢杆菌YJC-4在促进烟草生长中的应用。

进一步地，沙福芽孢杆菌YJC-4在促进烟草生长中应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷cfu。

更进一步地，为使拮抗菌更好地定植在烟株的根部，烟苗在移栽至生长田中前在1×10⁶-9×10⁶cfu/mL的YJC-4菌液中浸根20-40min。

本发明从烟草根际土壤中分离筛选到1株对烟草黑胫病菌具有较好拮抗活性，且对烟株具有良好促生作用的沙福芽孢杆菌YJC-4，具有以下优势：

(1)生防效果好：在盆栽试验中，用YJC-4菌液处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果达到81.59％，显著优于58％甲霜·锰锌和生物制剂枯草芽孢杆菌的防治效果，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。

(2)促生效果好：YJC-4菌液对烟株的生物量及农艺性状均具有显著的促进效果，与对照组差异显著。

附图说明

图1拮抗菌YJC-4对烟草黑胫病菌的抑制作用(A为对照、B为YJC-4菌株)；

图2在扫描电子显微镜下，YJC-4拮抗菌的形态结构；

图3温度对YJC-4菌株生长量的影响；

图4 pH对YJC-4菌株生长量的影响；

图5培养时间对YJC-4菌株生长量的影响；

图6 YJC-4的16S rDNA扩增条带；

图7拮抗菌YJC-4的16S rDNA序列系统发育树；

图8几种不同处理的烟株生长情况。

沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)YJC-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年4月15日，保藏编号为CGMCC No.12356。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

所有实施例中用到的材料如下：

主要试剂和材料如下：

DNA快速提取试剂盒Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit为全式金生物技术有限公司产品(货号EE161-01)；

革兰氏染色试剂盒为索莱宝产品(货号G1060)；

58％甲霜·锰锌可湿性粉剂为江苏灵宝化学有限公司生产；

枯草芽孢杆菌可湿性粉剂由德强生物公司生产；

其他药剂均为国药分析纯。

烟草品种：红花大金元(易感品种)，由国家烟草改良中心提供。

烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)：由国家烟草改良中心提供。

拮抗菌分离、培养和测定所用的培养基如下：

拮抗菌的培养和分离选用营养琼脂培养基NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)，和营养肉汤培养基NB(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L)。

抑菌活性测定选用燕麦培养基OA(燕麦片18g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。

生理生化性状测定选用运动型培养基(明胶80g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂4g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。

柠檬酸盐利用情况选用柠檬酸盐琼脂培养基(MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄H₂PO₄ 1g，K₂HPO₄，柠檬酸钠2g，溴麝香草酚蓝80mg，琼脂15g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。

厌氧生长情况选用葡萄糖肉汤培养基(营养肉汤8g，20％葡萄糖贮液50mL，蒸馏水950mL，调节pH7.0)。

实施例1沙福芽孢杆菌YJC-4的筛选及其对黑胫病菌的拮抗作用

1.1拮抗菌的分离和筛选：

从贵州开阳、清镇，四川攀枝花、西昌，山东诸城、沂水、即墨等地共采集土壤87份，为获得高效拮抗菌，选取5-10cm深处的黑胫病株根部土壤及相邻健康植株根部土壤，做好标记后，保存于-20℃的冰箱中待用。

对采集的87份土壤分别进行以下处理：首先将土壤中的根、茎、叶等杂物除去，进行压碎过20目筛。用电子天平称取5g处理后的土壤，放进100mL锥形瓶中，并加水定容至50mL，震荡均匀，取上清液1mL梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍。用移液枪分别吸取各稀释溶液200μL，并分别用涂布器均匀涂布在NA固体培养基上，封口后，倒置放于37℃培养箱恒温培养48h。无菌水作为空白对照，3次重复。挑取生长性状不同的单菌落324株，作为拮抗菌的候选菌，进行纯化培养(用接种环挑取单菌落，在NA固体培养基上划线，封口后，放于37℃培养箱恒温培养48h，按照上述步骤重复1-2次，获得纯化的单菌落)。

1.2拮抗菌候选菌对黑胫病菌的拮抗作用：

运用对峙培养法，用灭菌的打孔器(直径10mm)将烟草黑胫病菌接种到OA平板培养基的中心处，在烟草黑胫病菌块平行两侧离中心点25mm处平行两侧划两条短线(用接种环沾取少量菌液后，在培养基上划两道，长度约0.5cm)，此为处理组，对照组采用不含候选菌的空白OA培养液。然后倒置放在28℃恒温培养箱中培养4天，观察黑胫病菌周围有无抑制带，并利用十字交叉法测量其抑菌直径大小d(mm)。对照不接种候选菌，其他均相同。

抑菌率计算公式如下：

抑菌率(％)＝(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/处理组菌落直径]×100％。

在324株候选菌中，有12株的抑菌直径达到39.90-58.20mm，相对抑制率在46％-73％之间，见表1。其中YJC-4菌株对烟草黑胫病抑菌效果最好，其抑菌直径达到58.20mm，相对抑制率达到72.30％，具有较好的抑菌效果，见图1。

表1拮抗细菌对烟草黑胫病的平板拮抗效果

注:数字后不同的小写英文字母表示差异显著(P＜0.05),下同。

1.3菌株YJC-4的形态学鉴定

在NA培养基上，YJC-4菌落均呈乳白色，表面光滑，不透明。

通过电子扫描显微镜观察YJC-4菌株的形态、结构，步骤如下：(1)取样：将YJC-4菌株接种到NB培养基中进行震荡恒温培养48h，取其菌液样品进行离心(3000rpm)，去除上清液后，加入pH为7.0，0.01mol/L的PBS缓冲液充分清洗。(2)固定：用2.5％的戊二醛和2％锇酸进行固定，PBS清洗。(3)脱水处理：用乙醇的PBS溶液按30％，50％，70％，90％浓度梯度进行样品处理，后经过100％乙醇充分脱水，再经乙醇和叔丁醇混合液脱水10min，最后放置叔丁醇中脱水处理。(4)冷冻干燥。(5)喷施Pt粉后，在电子扫描显微镜上观察其形态结构。图2显示，菌株YJC-4的菌体为杆状，内生芽孢，大小为0.2-0.4×1.0-2.0μm。

1.4生理生化性状鉴定

参考《植病研究方法》(方中达编著，中国农业出版社出版)，鉴定YJC-4菌株的革兰氏染色阳性/阴性，运动性，氧化酶，在葡萄糖培养基中厌氧生长状况，是否水解淀粉，柠檬酸盐利用情况，V.P.测验，7％氯化钠生长状况等鉴定。

结果显示，YJC-4菌株在显微镜中观察革兰氏染色显紫色，为革兰氏阳性菌，具有一定的运动性，氧化酶显阴性，V.P.测验显阳性，可以利用柠檬酸盐，不能水解淀粉，在葡萄糖培养基中厌氧条件下不能生长，在7％氯化钠中生长。

1.5菌株YJC-4的最适培养条件

1.5.1温度对菌株YJC-4生长量的影响：以5％接种量将YJC-4菌株接种到pH7.0的液体NB培养基中，震荡均匀，分别放在20℃、25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、40℃、45℃的恒温培养箱中120r/min培养2d，通过紫外分光光度计测定拮抗菌的浓度，来反映其生长量的大小。

如图3所示：随着温度的增加，YJC-4拮抗菌的生长量总体呈“先迅速增加后迅速减少”的趋势，最适温度为35℃，其次为32.5℃。在高温低温条件下，生长均受到严重抑制。

1.5.2pH对菌株YJC-4生长量的影响：以5％接种量将YJC-4菌株接种到液体NB培养基中，初始pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，震荡均匀，在30℃培养箱中120r/min发酵2d，测定拮抗菌的浓度。

如图4所示：随着pH的增加，YJC-4拮抗菌的生长量总体呈“先迅速增加后迅速减少”的趋势，最适pH为7.5，其次为7.0，当pH<5.5时，菌落几乎不生长；在pH>9.0时，菌落生长量减少严重，表明YJC-4拮抗菌不耐强酸强碱。处理间不同pH对YJC-4拮抗菌的生长量存在显著性差异，表明pH是YJC-4拮抗菌生长的重要因素。

1.5.3发酵时间对菌株YJC-4生长量的影响：以5％接种量将YJC-4菌株接种到液体NB培养基中，在30℃培养箱中120r/min震荡培养，分别于0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取样拮抗菌的浓度。

如图5所示：随着培养时间的增加，YJC-4拮抗菌的生长量总体呈“先迅速增加后基本保持不变”的趋势，60h表现生长量最高，其次为48h。

1.6菌株YJC-4的16S rDNA鉴定

(1)根据DNA快速提取试剂盒的要求与步骤，取过夜培养的YJC-4菌液1mL，通过Resuspension Buffer11、Lysis Buffer将细胞裂解，再经过RNase A、Binding Buffer11、Clean Buffer、Wash Buffer去除杂质，最后通过Elution Buffer洗脱，得到菌株YJC-4的基因组DNA，-20℃保存。(2)以菌株YJC-4的基因组DNA为模板，以799F(5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3')和R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')作为引物扩增其16S rDNA序列；50μL扩增体系：模板1μL，正反向引物各1μL，2×EasyPCR Super Mix 25μL，超纯水22μL；PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。PCR产物经过1.5％的TAE琼脂糖凝胶电泳并EB染色，得到明亮的条带，右侧为YJC-4的16S rDNA条带，条带显示分子大小为750bp，如图6所示。(3)PCR产物委托青岛擎科生物技术有限公司进行序列测定，测得该菌的16S rDNA核苷酸序列长度为670bp，序列信息见序列表中SEQ ID No.3，GenBank登录号为KX663830；(4)测序结果利用BLAST软件进行同源性比较，用MEGA5.1的Neighbor-Joining法构建系统发育树。由图7可知，YJC-4与沙福芽孢杆菌Bacillus safensis(JF411315.1)进化关系最近，同源性达到99％。根据平板抑菌效果、形态学鉴定、生理生化性状分析、最适生长条件探究和16S rDNA序列同源性分析，由此推断，YJC-4鉴定为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。

实施例2沙福芽孢杆菌YJC-4防治烟草黑胫病的盆栽试验

取三株生长到5-6片真叶的红花大金元烟草植株盆栽，分别在相同条件下接种黑胫病菌：用小刀轻轻划伤烟株的根基部，将培养好的黑胫病菌接种到伤口处。

图8所示的为三种不同处理的烟株生长情况：1号为接种黑胫病菌后，立即灌根20mL(2±0.5)×10⁶cfu/mL YJC-4拮抗菌液后7天的生长状况；2号为黑胫病菌接种后3天，未使用YJC-4拮抗菌，烟株发病状况；3号为黑胫病菌接种后7天，未使用YJC-4拮抗菌，烟株发病状况。表明拮抗菌液对黑胫病具有较好的防治效果，有利于进行下一步深入研究。

实施例3沙福芽孢杆菌YJC-4防治烟草黑胫病防效的盆栽试验

将摇培好的YJC-4菌液，菌液浓度约(2±0.5)×10⁸cfu/mL，稀释100倍后，对盆栽生长到5-6片真叶的红花大金元烟草植株进行灌根处理，同时将烟株在相同条件下接种黑胫病菌：用小刀轻轻划伤烟株的根基部，将培养好的黑胫病菌接种到伤口处。每隔7天施一次药剂，共施3次。对照药剂用58％甲霜·锰锌可湿性粉剂和1000亿/g枯草芽孢杆菌粉剂分别500倍液喷雾接种黑胫病菌的烟株，空白对照用等量的无菌水处理，其他均相同，具体操作见表2。每个处理20株，3次重复。于第三次施药处理后7天调查发病率(％)、病情指数和相对防治效果(％)。分级标准按照中华人民共和国烟草行业标准(YC/T39—1996)规定执行。

发病率＝病株数/烟株总数×100％。

病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)。

以株为单位分级调查。

0级：全株无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围1/3～1/2，或1/3～1/2叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。

5级：茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2～2/3叶片凋萎。

7级：茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎。

9级：病株基本枯死。

相对防治效果(％)＝(对照组病情指数—处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。

以上数据采用DPS数据处理系统Duncan新复极差法进行方差分析计算。

表2药剂试验具体操作表

表3的盆栽试验结果表明，在第三次施药处理7天后，YJC-4拮抗菌具有较好的防治效果，YJC-4拮抗菌处理的烟株，发病率为11.13％，病情指数为5.32，防治效果达到81.59％；与58％甲霜·锰锌相比，YJC-4处理的菌株发病率略高，但差异不显著，处在同一水平上；YJC-4处理的烟株病情指数最小，防治效果最高，与58％甲霜·锰锌和1000亿/g枯草芽孢杆菌处理的烟株差异不显著。说明YJC-4拮抗菌对黑胫病的防治效果最好，与58％甲霜·锰锌可湿性粉剂和1000亿/g枯草芽孢杆菌防治效果相当，表明YJC-4拮抗菌具有较好的推广价值。

表3菌株YJC-4对烟草黑胫病的温室防治效果

标注：数据表示平均值±标准误，数据采用Duncan氏新复极差法，不同小写字母和大写字母分别表示在P<0.05和P<0.01水平上差异显著。

实施例4沙福芽孢杆菌YJC-4的促生试验

为验证YJC-4拮抗菌对烟株的促进生长作用，首先，将生长到5-6片真叶的烟苗从假植盘中移出，在预先配制好的供试拮抗菌液(1×10⁶cfu/mL)中浸根，30min后取出并移栽于装有灭菌土的花盆中。移栽缓苗3d后，用拮抗菌液分别对烟株灌根处理，10mL/株，每次重复10株，3次重复，空白对照用等量的清水进行处理。在温度为28℃，湿度约为80％的温室条件下培养观察。分别于移栽后15d、30d、45d，从30棵中随机选取10株烟草并记录促生指标，测量整株鲜质量、整株干质量、根部鲜重、根部干重，分析拮抗菌对烟株生物量的促生效果；测量其平均株高、平均根长、最大叶长、最大叶宽，分析拮抗菌对烟株农艺性状的促进效果。

YJC-4拮抗菌对烟株生物量的促生作用：

如表4所示，随着烟株的生长发育，探究拮抗菌对其生物量的促生作用，分别于移栽后15、30、45天调查了拮抗菌对整株鲜质量、整株干质量、根鲜重、根干重的影响。研究表明，拮抗菌对烟株生物量的促进作用显著。

9月24日(移栽后15天)调查，YJC-4拮抗菌能促进烟株生物量的生长，其中对根干重的促进作用最为明显，YJC-4与CK相比差异性极显著，增长率达到38.46％。其他指标促生作用差异性不显著，表明移栽后15天，拮抗菌对烟株生物量的促进作用不明显。

10月09日(移栽后30天)调查，与对照相比，YJC-4拮抗菌对烟株的整株鲜质量、整株干质量、根鲜重、根干重的促进作用明显，均达到极显著性差异。YJC-4拮抗菌对根干重的促进作用明显，增长率为38.46％。

10月24日(移栽后45天)调查，与对照相比，YJC-4拮抗菌对烟株的整株鲜质量，整株干质量、根鲜重、根干重的促进作用明显，均达到极显著性差异，YJC-4拮抗菌对整株干质量、根干重的促进作用最明显，增长率分别为50.00％、62.09％，拮抗菌对烟株生物量的促生作用明显，可以有效促进烟株的物质积累。

表4拮抗菌对烟株生物量的促生作用

注:同列数据上标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，下同。

YJC-4拮抗菌对烟株农艺性状的促生作用：

如表5所示，探究拮抗菌对其农艺性状的促生作用，分别于移栽后15、30、45天调查了拮抗菌对株高，根长、最大叶长、最大叶宽的影响。研究表明，拮抗菌对烟株农艺性状的促进作用显著。

9月24日(移栽后15天)调查，YJC-4拮抗菌能明显促进烟株的农艺性状，其中对根长、最大叶长和最大叶宽的促进作用最为明显，与CK相比差异性极显著，株高与CK相比差异性显著。

10月09日(移栽后30天)调查，YJC-4拮抗菌对烟株的株高、根长、最大叶长和最大叶宽的促进作用明显，均达到极显著性差异，其中YJC-4拮抗菌对株高和最大叶长的促进作用最明显，对株高的增长率为17.03％，对最大叶长的增长率为17.88％。

10月24日(移栽后45天)调查，YJC-4拮抗菌对烟株的株高、根长、最大叶长和最大叶宽的促进作用明显，均达到极显著性差异，且YJC-4拮抗菌对根长的促进作用明显，增长率为25.59％。表明YJC-4拮抗菌对烟株的生物性状有明显促生作用。

表5拮抗菌对烟株农艺性状的促生作用

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省烟草科学研究院；中国农业科学院烟草研究所；贵州省烟草公司贵阳市公司

<120> 沙福芽孢杆菌YJC-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 799F

<400> 1

aacaggatta gataccctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1492

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 670

<212> DNA

<213> Bacillus safensis

<400> 3

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 60

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 120

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 180

cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggctttccct tcggggacag agtgacaggt 240

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 300

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 360

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 420

gtgctacaat ggacagaaca aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat 480

ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 540

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 600

ccacgagagt ttgcaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggaccc cccccccaaa 660

gggggggcaa 670