水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法与流程

本发明涉及生物技术和植物育种技术领域，具体地说，涉及一种水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法。

背景技术：

水稻细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)种质创新是杂种优势利用的基础。目前，在生产上利用的水稻雄性不育种质资源主要是从自然界发现的突变体或远缘杂交后代产生，由此选育出的细胞质雄性不育系均为细胞质和细胞核源于不同类型或不同品种的质核异源细胞质雄性不育系，尚未见到选育出细胞质和细胞核均源于同一品种(系)的质核同源雄性不育系的报道。而且，由于自然CMS种质有限，远缘杂交难以成功以及细胞质母性遗传等因素，又限制了杂交种产量的持续提高，并存在单一细胞质杂交种大面积推广存在的某一生理小种大范围存在的风险。由于转基因具有不受物种限制的特点，而且栽培品种的细胞质资源比一般野生种资源丰富，若能将栽培品种细胞质的遗传多样性和转基因技术相结合选育CMS系，将极大地扩大CMS的细胞质来源。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，可同时选育出质核异源和质核同源细胞质雄性不育系。

本发明人长期致力于植物雄性不育种质创新及其分子基础的研究工作。2008年，由周瑞阳教授指导的博士研究生李刚采用同重标签相对定量与绝对定量(简称iTRAQ)技术分析了红麻雄性不育系和保持系花药线粒体蛋白质组差异，发现了一个差异表达的PDIL(protein disulfide isomerase-like，类蛋白质二硫键异构酶，缩写为“PDIL”)蛋白。该蛋白质部分氨基酸残基的同源序列比对结果表明，其与AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，由周瑞阳教授指导的另一位博士研究生金刚在此基础上，根据GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技术，克隆了两个红麻PDIL同源基因，并通过全长cDNA的扩增加以验证。两个基因分别命名为Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因数据库中的登录号分别为HQ638208和HQ898859。同时，这两个基因在不育系开花期的不同组织器官的表达量存在差异，其中Hcpdil5-2a在各组织的表达均受到不育胞质的影响，而其Hcpdil5-2b的表达仅在营养器官中受到不育胞质的影响。说明Hcpdil5-2a可能与雄性不育有关。然而，与雄性不育相关基因的发现，与细胞质雄性不育系的创制是两个截然不同的问题。

经过多年研究，本发明人采用花粉管通道法转红麻非全长Hcpdil5-2a基因，成功创造出了水稻细胞质雄性不育种质，继而转育成水稻细胞质雄性不育系。

为了实现本发明目的，本发明水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，包括以下步骤：

S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建

将从红麻中克隆获得的Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列插入到PBI121-GFP载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；

S2、转基因水稻植株的构建

采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP导入水稻植株中，收获转基因水稻植株的T₀代种子；

S3、转基因水稻细胞质雄性不育种质资源的获得

播种上述T₀代种子获得T₁代植株，于开花期调查T₁代植株育性，选择雄性不育株，作为水稻细胞质雄性不育种质资源；

S4、水稻转基因细胞质雄性不育系的选育

(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种或品系回交，成熟期收获T₁代种子，然后播种，观察T₂代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育，继续与原回交亲本进行核置换饱和回交所得的雄性不育系，即为质核同源细胞质雄性不育系，其野生型非转基因品种或品系即为该不育系的保持系；

(2)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之二：以转基因质核异源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与不育株原始来源相同的野生型非转基因品种或品系杂交，并与该亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，也属于质核同源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系；

(3)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：以上述转基因雄性不育种质或转基因质核同源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与其异源保持系或常规品种或品系杂交，并与回交亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，即为质核异源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系。

本发明中，所述异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种(系)。

本发明中，同源保持系是指与转基因材料为同一来源的非转基因野生型保持系或品种(系)。

本发明中，所述红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

前述的方法，步骤S2具体如下：

S21、选择受体材料：选择生长健壮、无病虫害的水稻保持系植株；

S22、质粒转化：在开花时期的晴天上午，选取当天已经开花授粉的颖花，用剪刀剪掉一半左右的颖壳，减掉柱头后，用微量注射器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒溶液，每次注射质粒直至将剩余一半颖壳装满，然后用杂交袋套好；

S23、收获：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒的水稻植株果实成熟后，收集的种子即为T₀代种子。

在本发明中，所述核置换回交的回交世代数不低于5-6代。

本发明所述水稻保持系包括但不限于水稻保持系M2B等。所述异源保持系选自以下水稻雄性不育保持系：中九B、内香B等。

本发明采用转基因方法成功创造出了转基因水稻细胞质雄性不育种质，继而与同源或异源保持系进行核置换回交，选育出了质核同源和异源的雄性不育系。

本发明以栽培品种为转基因供体，由此选育的雄性不育系为栽培品种细胞质雄性不育系。由于栽培种的进化程度高于野生种，有利基因多，因此，利用栽培品种细胞质雄性不育系有利于组配出制强优势组合；同时，也避免了农业生产上由于单一细胞质杂交种的大面积推广和长期利用可能导致的某一病害大流行的潜在风险。按照本发明方法选育的细胞质雄性不育系，经分子生物学鉴定表明，不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险，具有极为广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建流程示意图。

图2为本发明实施例6中水稻转非全长Hcpdil5-2a基因创制细胞质雄性不育系的技术路线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列的获得

红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为963bp(构建载体去掉终止密码子后长度为960bp)，为全长序列的一部分。红麻Hcpdil5-2a基因CDS全长序列为1521bp，两者相差558bp。具体序列见SEQ ID NO:1。

Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列的扩增方法如下：

提取红麻发育花药中总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；然后根据cDNA序列设计带有酶切位点Xba I、Kpn I特异引物对Hcpdil5-2a-TY，通过RT-PCR方法扩增红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列。

所述特异引物对为Hcpdil5-2a-TY：

正向引物5’-TCTAGAATGTTGCTGTTCTCGATCTTGA-3’

反向引物5’-GGTACCTCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3’

PCR反应体系如下：

反应体系用双蒸水补足至总体积20μl。

其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，30个循环；72℃终延伸10min。

利用天根凝胶回收试剂盒回收上述片段后，将其连入PMD-19T(simple)载体(购自宝生物工程有限公司)中，构建成测序中间载体，称为非全长pHcpdil5-2a，然后用该载体进行基因扩增和酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。

实施例2重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建

本实施例中，重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP由红麻非全长基因Hcpdil5-2a的开放阅读框序列与植物表达载体PBI121构成。

具体方法如下：将上述获得的含有非全长Hcpdil5-2a编码区cDNA的pHcpdil5-2a中间测序载体经过Xba I和Kpn I双酶切后获得带有酶切粘性末端的Hcpdil5-2a基因CDS序列片段。PBI121-GFP载体也用同样的Xba I和Kpn I双酶切，回收带有CaMV35S启动子的载体片段。将Hcpdil5-2a基因CDS序列片段与载体片段用连接酶连接，得到以CaMV35S启动子驱动的红麻非全长Hcpdil5-2a的植物超量表达载体，称为PBI121-Hcpdil5-2a-GFP。超量表达载体的构建流程见图1。

实施例3重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的导入

采用花粉管通道法进行，具体步骤如下：

(1)选择受体材料：选择生长健壮、无病虫害的水稻保持系或常规品种(系)植株。

(2)质粒转化：在开花时期的晴天上午，选取当天已经开花授粉的颖花，用剪刀剪掉一半左右的颖壳，减掉柱头后，用25μl微量注射器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒溶液，质粒浓度为10ng/μl，每次注射质粒直至可以将剩余一半颖壳装满，然后用杂交袋套好。

(3)收获：待上述注射PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒的水稻植株果实自然成熟后，单株上的同类种子合并编号，即获得T₀代种子。

实施例4转基因水稻细胞质雄性不育种质资源的获得

播种上述T₀代即获得T₁代植株，于开花期调查T₁代植株育性，计算雄性不育株与总植株数的比率，由此可直接获得水稻细胞质雄性不育种质资源。

实施例5水稻转基因细胞质雄性不育系的选育

对于实施例4中选出的雄性不育株当季用其野生型可育植株进行回交，成熟期收获T₁代种子。然后播种，观察T₂代植株育性，发现仍表现为雄性不育，于是推断其为细胞质雄性不育类型(CMS)，并将其命名为M2BS。

2012年9-10月，对16个保持系材料进行花粉管通道法转基因，一共收获724粒种子，当年冬季南繁在海南种植观察育性变化，结果在保持系1159(M2B)中发现了雄性不育株。在发现不育株后，立即用野生型(M2B)与之杂交，收获杂交种BC₁代后，2013年7月在南宁播种观察育性，其杂交后代全部表现不育；2013年10月继续观察BC₂代和F1代(与父本289，290杂交)育性，其表现仍为不育，由此初步断定此不育株系为CMS类型。然后分别在南宁、陵水两地播种、连续回交，进行杂交后代育性鉴定与不育系的选育，回交不低于5～6代。

实施例6水稻转基因细胞质雄性不育系选育方法的具体应用

2011年9-10月，以水稻雄性不育保持系M2B(由‘博B’与‘中浙优1号’杂交F₅代选育而成的雄性不育保持系。其中，‘博B’为雄性不育系“博A”的保持系，由广西大学莫永生研究员提供；‘中浙优1号’为市售获得)为材料，按照本发明的方法，于开花期用微量注射器将事先制备好的含有非全长Hcpdil5-2a基因CDS序列片段的重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP注入供试材料颖花中。2012年4月，在海南冬繁的T₁代群体中发现3株雄性不育株，命名为M2BS。在发现不育株后，立即用其野生型(M2B)与之杂交，收获杂交种BC₁代后，2012年7月在南宁播种，以观察育性。发现其杂交后代全部表现不育，当季用非转基因的M2B与其回交，至2015年10月已回交6代。因其质核均源于M2B，且为转非全长Hcpdil5-2a所得，故命名为转基因质核同源雄性不育系HM2A,其轮回亲本M2B为其保持系HM2B。

在选育质核同源雄性不育系的同时，于2012年同时与2个异源保持系中九B(中九B为不育系‘中九A’的保持系，由中国农业科学院水稻研究所于上世纪90年代选育而成，是水稻育种的常用材料)和内香B(内香B为不育系‘内香A’的保持系，见：曹立勇，肖培村，程式华，陈勇，占小登：内香A系列不育系的种质创新及其应用，科技成果，中国水稻研究所；内江杂交水稻科技开发中心)杂交，并进行核置换回交，于2016年选育出了质核异源雄性不育系HZJA(H中九A)和HNXA(H内香A)，其轮回亲本‘中九B’和‘内香B’即为其保持系。

利用载体骨架启动子、终止子以及报告基因引物专利进行分子鉴定，结果表明，上述质核同源雄性不育系和质核异源雄性不育系中均未能检测出载体质粒。不存在转基因安全风险。

分子鉴定的具体方法如下：

采用红麻Hcpdil5-2a基因特异引物进行转基因检测，其引物序列为：

Hcpdil5-2a-F：5，-ATGGAGTTTCTATGGAGTATTCTGG-3，

Hcpdil5-2a-R：5，-TCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3，(Tm 51.5℃)；

反应体系10μl：gDNA 1μl(200ng)，10×PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，引物(10μmol/L)0.3μl，Taq酶(5U/μl)0.1μl，ddH₂O 7.4μl。条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

在雄性不育系的T₁世代中能检测到目的基因。但由于用保持系连续回交5-6代后，转基因植株的细胞核基本被替换掉，在高世代的不育系中检测不到目的基因。

水稻转非全长Hcpdil5-2a基因创制细胞质雄性不育系的技术路线如图2所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 广西大学

<120> 水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法

<130> KHP161119327.4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 红麻

<400> 1

atgcatggag tttctatgga gtattctgga cctaggaaag cagacttact tgttcaatat 60

ctgaagaaat tcgttgctcc tgatgtgtct attcttagtt cagactctgc catcaatgat 120

tttgttgaag cagccgggac tttctttcct atatacatag gttttggctt gaatgagaca 180

gtggtatcta atttagctgt taagtacaag aaaaaggcat ggttttctgt ggcaaaggat 240

ttctcagatg atgccatggt gttgtatgac tttgacaaag ttccttcttt ggtagcactt 300

catccgagtt ataagcagca aagtgttttc tatggccctt ttgaagatac atttttgggt 360

gattttataa aacaaaattt gctccctttg gtggtgccct tgaaccatga tacactgaag 420

ctattgaaag atgaggacag gaaaattgtt ctgacaatca tagctgatga gaatgaagac 480

caatcacaga acttgatcaa gttattgaga gctgctgctt ctgcaaaccg tgatttggta 540

tttagttatg ttggagttaa gcaatgggaa gactttgctg ataaatttga ggccaacgag 600

aagtcaaagt tgccaaaaat gattgtctgg aatggagatg tggagtactt atcggttgtt 660

ggcgttgaaa gccttgataa tgaagatcag gggtctcaga tctcacgttt cctcgaagga 720

tatagagaag gaagaacaga aagaaaaaca gttaaagggc catcatttat ggacttcatc 780

cattcactaa tcggtatcag aagtgtctac ataattgtct ttattgttgc aataatgatg 840

cttatacaaa gcattgggaa agaagacgaa tctgtcaggg atggcagtcg tggtgcagtt 900

gatggtgccg agagcttcgg ggctgaaagc agtcggtata gacctgagaa gaaagaagat 960

tga 963