本发明涉及微生物资源应用的技术领域，尤其是涉及一种发酵培养基、菌糠发酵菌剂及发酵方法。
背景技术：
菌糠，是指栽培食用菌后所产生的培养基废弃物，主要由粗纤维、粗蛋白和粗脂肪构成。随着食用菌行业的飞速发展，食用菌生产后产生的菌糠也越来越多。目前，中国已是世界第一香菇生产大国，年产干菇1.68×107kg。香菇产业在带来经济效益的同时也带来了资源浪费与环境污染问题。每收获100kg的鲜菇后，会产生60kg的菌糠，这些菌糠营养物质丰富，易腐败变质，由于对菌糠的认识不足，大量菌糠未能合理开发利用而废弃荒野，这既造成大量的资源的浪费，又污染了环境。
香菇菌糠不仅含有丰富氨基酸、菌类多糖及Fe、Cu、Zn、Mg等微量元素，以及一些微生物代谢产物，如微量酚性物、少量的生物碱、黄酮及其甙类，而且还含有肌酸、多肽、皂甙植物甾醇及置萜皂甙等化学营养物质，具有松软、气味芳香和安全无毒的优点，可以作为饲料来源的新途径。但因自身木质素、纤维素、半纤维素等难以被家畜直接消化利用的碳水化合物含量过高，限制了它的进一步资源化利用。
木质素是由苯丙烷结构单元通过醚键和碳－碳键联结而成的复杂的、近似球形的无定形芳香族高聚物，溶解性差，并难以被酸水解。由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解，进而阻碍了纤维素的降解利用，木质素是影响菌糠粗纤维消化率的关键限制因子。反刍动物瘤胃中存在大量纤维素分解菌，包括细菌、真菌、纤毛虫等，但缺少分解木质素的微生物及其酶类。因此，要提高纤维素降解效率，必须首先解决木质素的降解问题。
针对这一难题，国内外使用了不同的处理方法，包括物理法、化学法和微生物处理，这些方法在一定程度上能够软化饲料，破坏细胞壁结构，降低纤维素和半纤维素含量。微生物处理是被普遍接受和广泛使用的一种方法，因为微生物处理既能降低粗纤维含量，又符合环保要求，但存在一个共同问题，就是降解率低，发酵时间长，木质素的降解相当微小。
因此，开发一种利用微生物处理，能够有效降解木质素，发酵时间短且降解率高的发酵培养基、菌糠发酵菌剂及发酵方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种发酵培养基，以缓解现有技术中培养白腐真菌及黑曲霉时产生的酶活性较低的技术问题；
本发明的第二个目的在于提供一种菌糠发酵菌剂，以缓解现有技术中存在的发酵时间长，木质素的降解率低的技术问题；
本发明的第三个目的在于提供一种菌糠的发酵方法，以缓解现有技术中存在的菌糠利用率低的技术问题。
本发明提供的一种发酵培养基，所述发酵培养基由以下重量份的组分组成：糊精3－8份，豆饼粉0.1－1份，酵母粉1－5份，Na2PO4 0.1－0.7份，KCl 0.1－0.4份，MgSO4·7H2O 0.01－0.1份，FeSO4·7H2O 0.01－0.1份，NH4Cl 0.1－0.5份，CaCO3 0.2－0.8份，维生素营养液5－10份，谷物水解液1－10份，水60－90份。
进一步地，所述发酵培养基由以下重量份的组分组成：糊精6份，豆饼粉0.5份，酵母粉3份，Na2PO4 0.4份，KCl 0.2份，MgSO4·7H2O 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NH4Cl 0.3份，CaCO3 0.5份，维生素营养液8份，谷物水解液6份，水75份。
进一步地，所述维生素营养液由肌醇25－35g，维生素B1 0.5－2g，维生素B6 0.5－2g，叶酸1－3g，生物素0.01－0.1g溶于1000mL蒸馏水中制成；
优选地，所述维生素营养液由肌醇30g，维生素B1 1g，维生素B6 1g，叶酸2g，生物素0.05g溶于1000mL蒸馏水中制成。
进一步地，所述谷物水解液由谷物，水和盐酸组成，所述谷物，水和盐酸的质量比为5：25：1。
进一步地，所述谷物水解液的制备如下：将质量比为5：25：1的谷物，水和盐酸，在65℃，0.05－0.08MPa压力下，水解60－90分钟。
进一步地，所述谷物为荞麦面。
本发明还提供了一种菌糠发酵菌剂，将活菌密度为5×105－5×106CFU/mL的白腐真菌加入上述的发酵培养基中，150r/min，30℃培养24h后，再向所述发酵培养基中加入活菌密度为5×105－5×106CFU/mL的黑曲霉，经150r/min，30℃培养24h后得到菌糠发酵菌剂。
进一步地，所述白腐真菌的活菌密度为1×106CFU/mL，所述黑曲霉活菌密度为1×106CFU/mL。
另外，本发明还提供了一种菌糠的发酵方法，将菌糠干燥粉碎后，向粉碎后的菌糠中加入上述的菌糠发酵菌剂，调节调节pH为6.2－6.6，温度为36－41℃，进行发酵，发酵时间为24－48h。
进一步地，所述菌糠为香菇菌糠。
本发明提供的发酵培养基，在培养白腐真菌及黑曲霉时，能够有效刺激孢子的萌发和菌体的生长，且保证白腐真菌产生的木质素降解酶酶活性较高，黑曲霉产生的纤维素酶酶活性较高。本发明提供的菌糠发酵菌剂，利用本发明提供的发酵培养基培养白腐真菌和黑曲霉搭配的优化组合，能够有效降解香菇菌糠，使纤维素和木质素长链易于断裂，有利于微生物降解，加快了降解过程，缩短了降解时间。本发明提供的菌糠的发酵方法，利用本发明提供的菌糠发酵菌剂对菌糠进行发酵，操作简便，易于实施，经济实用。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂、工具或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种发酵培养基，发酵培养基由以下重量份的组分组成：糊精3－8份，豆饼粉0.1－1份，酵母粉1－5份，Na2PO4 0.1－0.7份，KCl 0.1－0.4份，MgSO4·7H2O 0.01－0.1份，FeSO4·7H2O 0.01－0.1份，NH4Cl 0.1－0.5份，CaCO3 0.2－0.8份，维生素营养液5－10份，谷物水解液1－10份，水60－90份。
其中糊精例如可以为，但不限于3份，4份，5份，6份，7份或8份；豆饼粉例如可以为，但不限于0.1份，0.2份，0.3份，0.4份，0.5份，0.6份，0.7份，0.8份，0.9份和1.0份；酵母粉例如可以为，但不限于1份，2份，3份，4份和5份；Na2PO4例如可以为，但不限于0.1份，0.2份，0.3份，0.4份，0.5份，0.6份和0.7份；KCl例如可以为，但不限于0.1份，0.2份，0.3份和0.4份；MgSO4·7H2O例如可以为，但不限于0.01份，0.02份，0.03份，0.04份，0.05份，0.06份，0.07份，0.08份，0.09份和0.1份；FeSO4·7H2O例如可以为，但不限于0.01份，0.02份，0.03份，0.04份，0.05份，0.06份，0.07份，0.08份，0.09份和0.1份；NH4Cl例如可以为，但不限于0.1份，0.2份，0.3份，0.4份和0.5份；CaCO3例如可以为，但不限于0.2份，0.3份，0.4份，0.5份，0.6份，0.7份和0.8份，维生素营养液例如可以为，但不限于5份，6份，7份，8份，9份和10份；谷物水解液例如可以为，但不限于1份，2份，3份，4份，5份，6份，7份，8份，9份和10份。
在一个优选的实施方式中，发酵培养基由以下重量份的组分组成：糊精6份，豆饼粉0.5份，酵母粉3份，Na2PO4 0.4份，KCl 0.2份，MgSO4·7H2O 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NH4Cl 0.3份，CaCO3 0.5份，维生素营养液8份，谷物水解液6份，水75份。
其中，糊精作为发酵培养基中的碳源，豆饼粉和酵母粉作为发酵培养基中的有机氮源，NH4Cl作为发酵培养基中的无机氮源，Na2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和CaCO3用以补充菌体生长所需要微量元素类无机营养物，维生素营养液用以补充菌体生长所需要的维生素，谷物水解液富含纤维素，能够促进白腐真菌及黑曲霉的生长和产酶。
此外，本发明的发酵培养基中还可加入抗生素，如两性霉素B，以抑制目的细菌白腐真菌和黑曲霉之外的其他细菌生长。
在本发明中，维生素营养液由肌醇25－35g，维生素B1 0.5－2g，维生素B6 0.5－2g，叶酸1－3g，生物素0.01－0.1g溶于1000mL蒸馏水中制成。
在一个优选的实施方式中，维生素营养液由肌醇30g，维生素B1 1g，维生素B6 1g，叶酸2g，生物素0.05g溶于1000mL蒸馏水中制成。
在本发明中，谷物水解液由谷物，水和盐酸组成，所述谷物，水和盐酸的质量比为5：25：1。
在本发明中，谷物水解液的制备如下：将质量比为5：25：1的谷物，水和盐酸，在65℃，0.05－0.08MPa压力下，水解60－90分钟。
在一个优选的实施方式中，谷物水解液的制备如下：将质量比为5：25：1的谷物，水和盐酸，在65℃，0.06MPa压力下，水解75分钟。
其中，谷物可以是小麦粒、大麦、玉米、芥麦面、薏米面、高粱米、黑米中的一种或两种以上。
在一个优选的实施方式中，谷物为荞麦面。
本发明还提供了一种菌糠发酵菌剂，将活菌密度为5×105－5×106CFU/mL的白腐真菌加入上述的发酵培养基中，150r/min，30℃培养24h后，再向所述发酵培养基中加入活菌密度为5×105－5×106CFU/mL的黑曲霉，经150r/min，30℃培养24h后得到菌糠发酵菌剂。
在一个优选的实施方式中，加入白腐真菌的活菌密度为1×106CFU/mL，黑曲霉活菌密度为1×106CFU/mL。
另外，本发明还提供了一种菌糠的发酵方法，将菌糠干燥粉碎后，向粉碎后的菌糠中加入上述的菌糠发酵菌剂，调节调节pH为6.2－6.6，温度为36－41℃，进行发酵，发酵时间为24－48h。
在一个优选的实施方式中，调节pH为6.4，温度为37℃，进行发酵，发酵时间为36h。
在本发明中，菌糠干燥粉碎的方法为：将无霉变的菌糠风干，过1mm筛。
在本发明中，加入菌糠发酵菌剂的质量为菌糠干重的15％。
在本发明中，菌糠为香菇菌糠。
在上述条件下，本发明提供的发酵培养基，在培养白腐真菌及黑曲霉时，能够有效刺激孢子的萌发和菌体的生长，且保证白腐真菌产生的木质素降解酶酶活性较高，黑曲霉产生的纤维素酶酶活性较高。本发明提供的菌糠发酵菌剂，利用本发明提供的发酵培养基培养白腐真菌和黑曲霉搭配的优化组合，能够有效降解香菇菌糠，使纤维素和木质素长链易于断裂，有利于微生物降解，加快了降解过程，缩短了降解时间。本发明提供的菌糠的发酵方法，利用本发明提供的菌糠发酵菌剂对菌糠进行发酵，操作简便，易于实施，经济实用。
下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本发明实施例中，白腐真菌受赠于山东大学，黑曲霉购自于中国菌种保藏中心，香菇菌糠来源于普通种植户。
实施例1
一种发酵培养基，由以下重量份的组分组成：
糊精6份，豆饼粉0.5份，酵母粉3份，Na2PO4 0.4份，KCl 0.2份，MgSO4·7H2O 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NH4Cl 0.3份，CaCO3 0.5份，维生素营养液8份，谷物水解液6份，水75份。
其中，维生素营养液由肌醇30g，维生素B1 1g，维生素B6 1g，叶酸2g，生物素0.05g溶于1000mL蒸馏水中制成。谷物水解液由荞麦面，水和盐酸按质量比为5：25：1组成，在65℃，0.06MPa压力下，水解75分钟。
一种菌糠发酵菌剂，将活菌密度为1×106CFU/mL的白腐真菌加入本实施例提供的发酵培养基中，150r/min，30℃培养24h后，再向发酵培养基中加入活菌密度为1×106CFU/mL的黑曲霉，经150r/min，30℃培养24h后得到菌糠发酵菌剂。
一种香菇菌糠的发酵方法，将无霉变的香菇菌糠风干，过1mm筛后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本实施例提供的菌糠发酵菌剂，加入菌糠发酵菌剂的质量为本实施例香菇菌糠干重的15％，调节pH为6.4，温度为37℃，进行发酵，发酵时间为36h。
实施例2
一种发酵培养基，由以下重量份的组分组成：
糊精3份，豆饼粉0.1份，酵母粉1份，Na2PO4 0.1份，KCl 0.1份，MgSO4·7H2O 0.01份，FeSO4·7H2O 0.01份，NH4Cl 0.1份，CaCO3 0.2份，维生素营养液5份，谷物水解液1份，水60份。
其中，维生素营养液由肌醇25g，维生素B1 0.5g，维生素B6 0.5g，叶酸1g，生物素0.01g溶于1000mL蒸馏水中制成。谷物水解液由荞麦面，水和盐酸按质量比为5：25：1组成，在65℃，0.05MPa压力下，水解60分钟。
一种菌糠发酵菌剂，将活菌密度为5×105CFU/mL的白腐真菌加入本实施例提供的发酵培养基中，150r/min，30℃培养24h后，再向发酵培养基中加入活菌密度为5×105CFU/mL的黑曲霉，经150r/min，30℃培养24h后得到菌糠发酵菌剂。
一种香菇菌糠的发酵方法，将无霉变的香菇菌糠风干，过1mm筛后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本实施例提供的菌糠发酵菌剂，加入菌糠发酵菌剂的质量为本实施例香菇菌糠干重的15％，调节pH为6.2，温度为36℃，进行发酵，发酵时间为24h。
实施例3
一种发酵培养基，由以下重量份的组分组成：
糊精8份，豆饼粉1份，酵母粉5份，Na2PO4 0.7份，KCl 0.4份，MgSO4·7H2O 0.1份，FeSO4·7H2O 0.1份，NH4Cl 0.5份，CaCO3 0.8份，维生素营养液10份，谷物水解液10份，水90份。
其中，维生素营养液由肌醇35g，维生素B1 2g，维生素B6 2g，叶酸3g，生物素0.1g溶于1000mL蒸馏水中制成。谷物水解液由荞麦面，水和盐酸按质量比为5：25：1组成，在65℃，0.08MPa压力下，水解90分钟。
一种菌糠发酵菌剂，将活菌密度为5×106CFU/mL的白腐真菌加入本实施例提供的发酵培养基中，150r/min，30℃培养24h后，再向发酵培养基中加入活菌密度为5×106CFU/mL的黑曲霉，经150r/min，30℃培养24h后得到菌糠发酵菌剂。
一种香菇菌糠的发酵方法，将无霉变的香菇菌糠风干，过1mm筛后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本实施例提供的菌糠发酵菌剂，加入菌糠发酵菌剂的质量为本实施例香菇菌糠干重的15％，调节pH为6.6，温度为41℃，进行发酵，发酵时间为48h。
对比例1
一种发酵培养基，由以下重量份的组分组成：
葡萄糖6份，蛋白胨3份，NaCl 0.4份，MgSO4 0.05份，FeSO4·7H2O 0.05份，NaNO30.5份，30％肌醇溶液10份，水80份。
一种菌糠发酵菌剂，将活菌密度为1×106CFU/mL的白腐真菌加入本对比例提供的发酵培养基中，150r/min，30℃培养24h后，再向发酵培养基中加入活菌密度为1×106CFU/mL的黑曲霉，经150r/min，30℃培养24h后得到菌糠发酵菌剂。
一种香菇菌糠的发酵方法，将无霉变的香菇菌糠风干，过1mm筛后，向粉碎后的香菇菌糠中加入本对比例提供的菌糠发酵菌剂，加入菌糠发酵菌剂的质量为本对比例香菇菌糠干重的20％，调节pH为6.5，温度为37℃，进行发酵，发酵时间为96h。
菌体生长情况及酶活性
分别向100mL实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的发酵培养基中，按相应条件加入白腐真菌和黑曲霉，并进行震荡培养。振荡培养7天后发现，白腐真菌和黑曲霉在不同培养基中的生长情况出现明显差异：实施例1、实施例2和实施例3提供的发酵培养基中生长的白腐真菌和黑曲霉的生物量均明显大于对比例1提供的发酵培养基中白腐真菌和黑曲霉的生物量。说明实施例1、实施例2和实施例3提供的发酵培养基中充足的营养物质可以有效的刺激孢子的萌发和菌体的生长。其中，以实施例1提供的发酵培养基中白腐真菌和黑曲霉的生物量最大。
木质素降解酶活性定义为1分钟内氧化1μL藜芦醇的酶量为1个酶活性单位。利用紫外分光光度计测定在波长为310nm处2.5分钟内吸光度值的变化率。
纤维素酶活性采用3，5－二硝基水杨酸法测定，酶活性定义为1mg纤维素酶每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖μg数定为一个活力单位。利用紫外分光光度计测定在波长为550nm处1分钟内吸光度值的变化率。
由实验结果可以发现，在实施例1提供的发酵培养基中培养36h时出现了酶活性最大值，木质素降解酶的酶活性为297U/L，纤维素酶的酶活性为335U/L，相比于实施例2和实施例3提供的发酵培养基，酶活性有所提高，相比于对比例1提供的发酵培养基，酶活性均显著提高。
香菇菌糠各组分含量的测定
应用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的菌糠发酵菌剂，按相应条件，对香菇菌糠进行发酵，并参照饲料质量检测技术，对发酵后的香菇菌糠中，中性洗涤纤维(NDF)，酸性洗涤纤维(ADF)，纤维素，半纤维素，粗灰分，粗蛋白，水溶性碳水化合物，酸性洗涤木质素的含量进行测定，同时设未经任何处理的香菇菌糠为空白组，设不利用菌糠发酵菌剂进行发酵的香菇菌糠为对照组。测定结果见表1。
由表1中的结果可以看出，通过微生物发酵处理的香菇菌糠的化学组成能够明显改善。在各项成分中，相对于空白组和对照组，实施例1、实施例2、实施例3提供的菌糠发酵菌剂均能够明显降低香菇菌糠中酸性洗涤木质素的含量，并且能够明显降低香菇菌糠的纤维素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和半纤维素的含量，而显著提高水溶性碳水化合物和粗蛋白的含量。由此可知，本发明实施例1提供的菌糠发酵菌剂，利用本发明提供的发酵培养基培养白腐真菌和黑曲霉搭配的优化组合，能够有效降解香菇菌糠，使纤维素和木质素长链易于断裂，有利于微生物降解，加快了降解过程，缩短了降解时间。
表1香菇菌糠各组分含量的测定
香菇菌糠中各种氨基酸的含量的测定
应用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的菌糠发酵菌剂，按相应条件，对香菇菌糠进行发酵，并参照饲料质量检测技术对发酵后的香菇菌糠中，6种必需氨基酸和9种非必须氨基酸的含量进行测定，同时设未经任何处理的香菇菌糠为空白组，设不利用菌糠发酵菌剂进行发酵的香菇菌糠为对照组。测定结果见表2。
表2香菇菌糠中各种氨基酸的含量的测定
由表2的实验结果可以看出，任何发酵处理均会提高香菇菌糠的氨基酸含量，其中，应用实施例1提供的菌糠发酵菌剂对香菇菌糠进行发酵，氨基酸总量提高最显著，应用实施例2和实施例3提供的菌糠发酵菌剂对香菇菌糠进行发酵，氨基酸含量同样有所提高，且提高程度均高于对比例1提供的菌糠发酵菌剂对香菇菌糠进行发酵的氨基酸含量。因此可以推断，实施例1提供的菌糠发酵菌剂具有将非蛋白氮转化成氨基态氮的能力。
饲喂实验
为了验证应用本发明方法发酵的菌糠代替日粮对牛的饲用效果，发明人在养殖户牛场进行了为期三个月的饲喂试验。将100头体重接近，健康状况良好的肉牛随机分为5组，每组20只。实验组饲料为应用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的方法发酵的菌糠分别替代50％正常饲料，对照组饲喂正常饲料。三个月后对肉牛的生长性能进行检测，检测结果见表3。
表3肉牛的生长性能
由以上实验结果可知，以实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的方法发酵的菌糠分别替代50％正常饲料饲喂肉牛，不影响肉牛的日增重，并且能够起到降低发病率，提升肉质口感的作用。由此推算，以饲喂杂交肉牛为例，日饲喂量5kg/头，一年1500kg/头左右，若按日粮价格1元/kg计算，一年可节省饲料费用1500kg×1元/kg×50％＝750元/头。若每年能利用130万吨菌糠作饲料，就相当于多生产了70万吨的玉米。因此，利用本发明提供的菌糠发酵菌剂对菌糠进行发酵，操作简便，易于实施，经济实用，提高了菌糠的利用率，将菌糠回收再利用，作为节粮型饲料具有很好的社会效益。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。