室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的制作方法

本发明涉及一种室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置，属于植物病理学技术领域。

背景技术：

聚合酶链式反应PCR广泛应用于研究、法医学和农业，PCR通常利用与靶序列的5'和3'边界杂交的两种寡核苷酸引物和通过聚合脱氧核糖核苷酸三磷酸dNTP延伸退火引物以生成双链产物的DNA依赖性DNA聚合酶。通过提高和降低反应混合物的温度称为热循环，DNA产物的两条链被分开，并且可以充当下一轮退火和延伸的模板，同时重复该过程。目前，PCR技术广泛用于菌株的鉴定和检测，具有方便快捷的特点。生防菌株在进行田间施用时，定殖数量是其成功发挥其生防效果的关键。而在实际生产中，菌株的定殖受多种环境因素的影响，这往往使我们很难确定其定殖状况，从而可能导致防效不佳的后果。如果能在田间快速方便地对生防菌进行识别的话，那就能确定所用生防菌的有效性，从而决定是否施用及下一次的施用时间，可以一定程度上降低生防菌的使用成本。因此，生防菌的田间施用需要常温的PCR反应。目前，最常用最有效的常温PCR反应为HAD。HAD指解旋酶依赖性扩增，是一种通过使用解旋酶制备物解开双链核酸以生成扩增模板来扩增核酸的体外方法。其中，解旋酶指能够解开双链核酸的酶，它可沿着DNA以5'-3'方向或以相反的3'-5'方向移位。通过实验，我们发现柑橘病害生防菌株ML27对柑橘炭疽病菌的抑菌率为72.15％，对柑橘溃疡病菌的抑菌圈为2.05厘米，其抑菌的机理主要是对真菌的细胞壁产生影响，对细菌的菌体具有溶解作用。可见，该菌株有较好的生防潜力，我们的温室试验也证明确实如此。那么，ML27在田间的防治效果和施用情况就成为我们研究的重点。鉴于田间环境的复杂性，研究常温PCR以便快速检测生防菌株成为继续解决的一大难题。而我们试验中发现，在柑橘病害生防菌株ML27中，有一种特异的质粒pML27，只存在于菌株ML27中，这为常温PCR装置的设计提供了条件。因此，如何研究出一种解旋酶依赖性扩增反应装置，设计出特定菌株所需的引物，放入特定的反应液，即可在室温下检测柑橘病害生防菌株的定殖量，是保证这些菌株在田间有效使用的重要因素。所以利用HAD技术，设计出特定柑橘病害生防菌株ML27的引物，发明一种室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置是必要的。

技术实现要素：

为了克服的难题，本发明提供了室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置，该室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置利用HAD(解旋酶依赖性扩增)技术，设计出柑橘病害生防菌株比如ML27特异质粒pML27的引物，扩增出特异质粒pML27，在1小时内将靶序列扩增至10⁹-10¹⁰倍，然后采用核酸染料SYBR Green I对扩增后的特异质粒pML27染色，当反应液中加入核酸染料SYBR Green I后(SYBR Green I:一种核酸染料)，在紫外光或日光下通过肉眼可进行判断，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变,从而达到室温下快速识别该柑橘病害生防菌株的目的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置，由载玻片1、菌液腔2、储液管3、显示玻片4、牵拉活塞5、反应管6、阻液片14构成，其特征在于：所述的反应管6内部设置有牵拉活塞5和阻液片14，两侧壁上开口有储液管孔17，上壁通过进液孔13和释压孔15与显液腔21相通连，圆柱形，长度为5-10厘米，横截面圆形，圆形直径为0.5-3毫米，包括反应管腔23和反应管壁25；反应管腔23圆柱形，长度为5-10厘米，横截面圆形，圆形直径为1-3毫米，与菌液腔2、储液管腔19、和显液腔21相连通，最外端被牵拉支板10封堵；反应管壁25上有储液管口11、进液孔13和释压孔15，在进液孔13和释压孔15之间还设置有前后两个阻液片14；阻液片14圆片状，直径为0.5-3毫米，中间有一个直径为0.5-1毫米的圆孔，周缘固定在反应管壁25上；牵拉活塞5设置在反应管6中，包括牵拉活塞头8、牵拉索9、牵拉支板10和牵拉索环20；牵拉活塞头8橡胶质，圆柱形，直径为0.5-3毫米，长度为0.5-1毫米，牵拉活塞头8底面中央固着有牵拉索9；牵拉索9由市售的钓鱼线制成，横截面圆形，直径为0.1-0.5毫米，与牵拉支板10中央的圆孔和阻液片14中央的圆孔之间有宽度为0.4-0.5毫米的缝隙，一端固定在牵拉活塞头8底面中央，另一端形成牵拉索环20；牵拉索环20环形，环形直径为3-5厘米；牵拉支板10圆片状，直径为1-5毫米，固定在反应管6末端，中央有一个直径为0.5-1毫米的圆孔。

所述的载玻片1玻璃质，长方体形，长度为10-15厘米，宽度为3-5厘米，厚度为1-5毫米，制作时先用模具采用公知的槽沉成形法制成上下两部分，然后再采用集中的高温火焰对上下两部分边缘局部加热，依靠表面张力的作用使玻璃边缘在软化时变得圆滑，同时将两部分融合在一起，形成内部具管道的整体结构。

所述的菌液腔2梭形囊状，长度为0.5-1厘米，中央最粗横截面椭圆形，椭圆的长向直径为0.5-0.8厘米，椭圆的短向直径为0.1-0.2厘米；菌液腔2在载玻片1上的开口称为菌液腔口7，菌液腔口7圆形，直径为1-2毫米；菌液腔2另一端连通反应管6，整个菌液腔2斜向位于载玻片1中，菌液腔2中轴与水平面呈20°-30°夹角。

所述的储液管3共9个，依次设置在反应管壁25的两侧，从菌液腔2向显示玻片4方向的储液管3管内依次装有10pmol引物1、10pmol引物2、100ng UvrD解旋酶、100ng DNA依赖性DNA聚合酶、400ng MutL蛋白、0.1-100mM的核苷三磷酸NTP10ul、1-10mM的脱氧核苷三磷酸dNTP10ul、1.2-12.5mM的二价镁离子10ul和10ul核酸染料SYBR Green I；每个储液管3基部圆柱状，直径为0.5-3毫米，开口于载玻片1的侧壁上，该开口称为储液管口11；端部圆台形，圆台形顶部开口为储液管孔17，储液管3包括储液管口11、储液封堵12、储液管孔封膜16、储液管孔17、储液管壁18和储液管腔19；储液管口11是储液管3在载玻片1的侧壁上的开口，储液封堵12油质，在反应液置入储液管3后被注入储液管3；储液管孔封膜16蜡质，圆片状，直径为0.1-1毫米，厚度为0.01-0.05毫米；储液管孔17直径为0.1-1毫米，开口于反应管壁25处；储液管腔19是储液管3基部和端部内的空腔，基部圆柱状，直径为0.5-3毫米，端部圆台形，直径为0.1-1毫米。

所述的显示玻片4包括进液孔13、释压孔15、显液腔21、显示基片22、显示顶片24；显示基片22是显示玻片4下方的盖玻片，长度为0.5-2厘米，宽度为0.5-1.5厘米，厚度为0.01-0.05毫米，一侧向上凸起，凸起的长度为0.5-1.5厘米，宽度为0.01-0.05厘米，厚度为0.01-0.05毫米，在反应管6上方有两个孔，接近储液管3一侧的孔为进液孔13，接近牵拉支板10一侧的孔为释压孔15；进液孔13为圆孔，直径为0.05-0.1厘米，高度为0.01-0.05毫米；释压孔15为圆孔，直径为0.05-0.1厘米，高度为0.01-0.05毫米；显示顶片24是显示玻片4上方的盖玻片，长度为0.5-2厘米，宽度为0.5-1.5厘米，厚度为0.01-0.05毫米，与显示基片22一侧向上凸起相对应的另一侧也有一个凸起，凸起的长度为0.5-1.5厘米，宽度为0.01-0.05厘米，厚度为0.01-0.05毫米，显示顶片24与显示基片22上下之间和显示顶片24与显示基片22相对应的凸起之间所共同形成的空间为显液腔21；显液腔21长度为0.48-1.9厘米，宽度为0.5-1.5厘米，高度为0.01-0.05毫米。

本发明的有益效果为，室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置以柑橘病害生防菌株ML27为例来说明其具体实施过程，所以，主要能够设计出生防菌的特定遗传物质的引物，均可使用室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置利用HAD(解旋酶依赖性扩增)技术对该生防菌株在室温下进行快速识别。室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置利用HAD(解旋酶依赖性扩增)技术，设计出柑橘病害生防菌株ML27特异质粒pML27的引物，扩增出特异质粒pML27，在1小时内将靶序列扩增至10⁹-10¹⁰倍，然后采用核酸染料SYBR Green I对扩增后的特异质粒pML27染色，当反应液中加入核酸染料SYBR Green I后(SYBR Green I:一种核酸染料)，在紫外光或日光下通过肉眼可进行判断，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变,从而达到室温下快速识别柑橘病害生防菌株ML27的目的。室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置制作简单、可操作性强、成本低廉、效果明显。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为本发明室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的整体结构示意图。

图2为本发明室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的储液管结构示意图。

图3为本发明室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的牵拉活塞结构示意图。

图4为本发明室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的显示玻片结构示意图。

图5为本发明室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的柑橘病害生防菌株ML27的质粒pML27碱基序列图。

图中1.载玻片，2.菌液腔，3.储液管，4.显示玻片，5.牵拉活塞，6.反应管，7.菌液腔口，8.牵拉活塞头，9.牵拉索，10.牵拉支板，11.储液管口，12.储液封堵，13.进液孔，14.阻液片，15.释压孔，16.储液管孔封膜，17.储液管孔，18.储液管壁，19.储液管腔，20.牵拉索环，21.显液腔，22.显示基片，23.反应管腔，24.显示顶片，25.反应管壁。

具体实施方式

实施例一：

如图所示，以室温下快速识别柑橘病害生防菌株ML27为例，来说明本发明的室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的具体实施方式。室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置，由载玻片1、菌液腔2、储液管3、显示玻片4、牵拉活塞5、反应管6、菌液腔口7、牵拉活塞头8、牵拉索9、牵拉支板10、储液管口11、储液封堵12、进液孔13、阻液片14、释压孔15、储液管孔封膜16、储液管孔17、储液管壁18、储液管腔19、牵拉索环20、显液腔21、显示基片22、反应管腔23、显示顶片24、反应管壁25组成。载玻片1是室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的骨架，玻璃质，长方体形，长度为10-15厘米，宽度为3-5厘米，厚度为1-5毫米，室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置的所有结构均设置在载玻片1上，制作时先用模具采用公知的槽沉成形法制成上下两部分，然后再采用集中的高温火焰对上下两部分边缘局部加热，依靠表面张力的作用使玻璃边缘在软化时变得圆滑，同时将两部分融合在一起，形成内部具管道的整体结构。菌液腔2是盛放柑橘病害生防菌株ML27的空间，梭形囊状，长度为0.5-1厘米，中央最粗横截面椭圆形，椭圆的长向直径为0.5-0.8厘米，椭圆的短向直径为0.1-0.2厘米。菌液腔2在载玻片1上的开口称为菌液腔口7，菌液腔口7是将柑橘病害生防菌株ML27液体注入到菌液腔2中的入口，圆形，直径为1-2毫米；菌液腔2另一端连通反应管6，整个菌液腔2斜向位于载玻片1中，菌液腔2中轴与水平面呈20°-30°夹角。反应管6是将柑橘病害生防菌株ML27细胞破裂，将细胞中特异质粒DNA常温PCR，并使反应产物由于表面张力扩散而被吸到显示玻片4通过染色显示出来的部件，内部设置有牵拉活塞5和阻液片14，两侧壁上开口有储液管孔17，上壁通过进液孔13和释压孔15与显液腔21相通连，圆柱形，长度为5-10厘米，横截面圆形，圆形直径为0.5-3毫米，包括反应管腔23和反应管壁25。反应管腔23是将柑橘病害生防菌株ML27细胞破裂和将菌株ML27细胞中特异质粒DNA常温PCR的空间，圆柱形，长度为5-10厘米，横截面圆形，圆形直径为1-3毫米，与菌液腔2、储液管腔19、和显液腔21相连通，最外端被牵拉支板10封堵。反应管壁25是围成反应管腔23的结构，壁上有储液管口11、进液孔13和释压孔15，在进液孔13和释压孔15之间还设置有前后两个阻液片14。阻液片14圆片状，直径为0.5-3毫米，中间有一个直径为0.5-1毫米的圆孔，供牵拉索9在其中穿行，周缘固定在反应管壁25上。牵拉活塞5设置在反应管6中，在手动牵拉牵拉索环20时，能够将牵拉活塞头8牵引拉动，使其在反应管6发生位移，是将菌液腔2中的菌液和储液管3中的反应液抽吸到反应管腔23中形成混合液体，使混合液体发生反应的动力部件，包括牵拉活塞头8、牵拉索9、牵拉支板10和牵拉索环20。牵拉活塞头8橡胶质，圆柱形，直径为0.5-3毫米，长度为0.5-1毫米，牵拉活塞头8底面中央固着有牵拉索9，牵拉活塞头8在反应管6发生位移时，能够改变反应管6内的压力，产生抽吸力量，将液体吸入反应管腔23中，同时，牵拉活塞头8在移动过程中，还可以将储液管孔封膜16从储液管孔17处刮掉，以便储液管腔19中的反应液被抽吸出来。牵拉索9由市售的钓鱼线制成，横截面圆形，直径为0.1-0.5毫米，与牵拉支板10中央的圆孔和阻液片14中央的圆孔之间有宽度为0.4-0.5毫米的缝隙，供气体通过，一端固定在牵拉活塞头8底面中央，另一端形成牵拉索环20，供使用者伸进手指牵拉牵拉活塞5，使其在反应管6移动。牵拉索环20环形，环形直径为3-5厘米。牵拉支板10圆片状，直径为1-5毫米，固定在反应管6末端，中央有一个直径为0.5-1毫米的圆孔，供牵拉索9在其中穿行，同时还是牵拉索9出入反应管6的支点。所述的柑橘病害生防菌株ML27特异质粒pML27是长度为2628bp的核酸序列，其碱基组成如Seq ID No:1所示；采用HAD反应扩增质粒pML27所用引物为引物1和引物2，引物1是长度为23p的核酸序列，其碱基组成如Seq ID No:2 所示；引物2是长度为22p的核酸序列，其碱基组成如Seq ID No:3所示。储液管3是储存将柑橘病害生防菌株ML27细胞破裂和细胞中特异质粒DNA常温PCR以及染色反应产物所需要的试剂的部件，共9个，依次设置在反应管壁25的两侧，从菌液腔2向显示玻片4方向的管内依次装有10pmol引物1(5'-AATGCGCTACCAGATGAGCCGCG-3')、10pmol引物2(5'-ATGGCAGGGTCGATCCTGGGCA-3')、100ng UvrD解旋酶、100ng DNA依赖性DNA聚合酶、400ngMutL蛋白MutL蛋白是一种用于增强UvrD解旋酶活性的辅助蛋白、辅因子辅因子指解旋酶解开活性所需要的小分子试剂，包括核苷三磷酸NTP、脱氧核苷三磷酸dNTP和二价镁离子，其中，核苷三磷酸NTP的浓度为0.1-100mM，脱氧核苷三磷酸dNTP的浓度为1-10mM，二价镁离子的浓度为1.2-12.5mM和10ul核酸染料SYBR Green I。储液管3的试剂与菌液接触后能够发生HDA(解旋酶依赖性扩增)反应，HDA(解旋酶依赖性扩增)反应是一种通过使用解旋酶制备物解开双链核酸以生成扩增模板来扩增核酸的常温PCR反应。每个储液管3基部圆柱状，直径为0.5-3毫米，开口于载玻片1的侧壁上，该开口称为储液管口11；端部圆台形，圆台形顶部开口为储液管孔17，储液管3包括储液管口11、储液封堵12、储液管孔封膜16、储液管孔17、储液管壁18和储液管腔19。储液管口11是储液管3在载玻片1的侧壁上的开口，储液管3中的各种反应液和储液封堵12以及储液管孔封膜16均从储液管口11注入，操作时，首先在储液管孔17外用蜡制成一个厚度为0.01-0.05毫米的薄膜，即储液管孔封膜16，封堵住储液管孔17，然后注入各自的试剂，注好后，接着注入油质的储液封堵12，即可使反应所需的试剂被储存于不同的储液管3中。储液封堵12油质，在反应液置入储液管3后被注入储液管3，用于封堵储液管3中的各种反应液，并且在牵拉活塞5抽吸时，能够像圆珠笔芯内的封堵一样，随着反应液的移动而移动，使得反应液由于与外界隔绝而完全处于最初的无菌状态，以免发生变质反应。储液管孔封膜16蜡质，圆片状，直径为0.1-1毫米，厚度为0.01-0.05毫米。储液管孔17直径为0.1-1毫米，开口于反应管壁25处。储液管腔19是储液管3基部和顶部内的空腔，基部圆柱状，直径为0.5-3毫米，端部圆台形，直径为0.1-1毫米。储液管壁18是围成储液管腔19的壁。显示玻片4是柑橘病害生防菌株ML27细胞破裂和细胞中特异质粒DNA序列见图5常温PCR反应后，扩增的DNA与染色反应产物所需要的试剂发生反应，从进液孔13由于表面张力造成液体在显液腔21迅速扩散，使得颜色颗粒弥散分布在显液腔21内，从而呈现出蓝色的结构，包括进液孔13、释压孔15、显液腔21、显示基片22、显示顶片24。显示基片22是显示玻片4下方的盖玻片，长度为0.5-2厘米，宽度为0.5-1.5厘米，厚度为0.01-0.05毫米，一侧向上凸起，凸起的长度为0.5-1.5厘米，宽度为0.01-0.05厘米，厚度为0.01-0.05毫米，在反应管6上方有两个孔，接近储液管3一侧的孔为进液孔13，接近牵拉支板10一侧的孔为释压孔15。进液孔13为圆孔，直径为0.05-0.1厘米，高度为0.01-0.05毫米，是反应后液体进入显液腔21的通道。释压孔15为圆孔，直径为0.05-0.1厘米，高度为0.01-0.05毫米，是为反应后液体进入显液腔21缓解空气阻力的通道，反应后液体在显液腔21中由于表面张力扩散的过程中，逐渐占据显液腔21的空间，迫使里面原来的气体被压挤，从释压孔15进入反应管6，并从牵拉索9与牵拉支板10中央圆孔之间的缝隙排出。显示顶片24是显示玻片4上方的盖玻片，长度为0.5-2厘米，宽度为0.5-1.5厘米，厚度为0.01-0.05毫米，与显示基片22一侧向上凸起相对应的另一侧也有一个凸起，凸起的长度为0.5-1.5厘米，宽度为0.01-0.05厘米，厚度为0.01-0.05毫米，这样显示顶片24与显示基片22上下之间和显示顶片24与显示基片22相对应的凸起之间所共同形成的空间为显液腔21。显液腔21长度为0.48-1.9厘米，宽度为0.5-1.5厘米，高度为0.01-0.05毫米，是将颜色反应发生后将颜色颗粒分散从而使颜色能够被肉眼看到的空间。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110>江西农业大学

<120>室温下快速识别柑橘病害生防菌株的解旋酶依赖性扩增反应装置

<160>3

<210>1

<211>2628

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>1

TTCTCGCCAA TCTGGTGGAT TCTCTCCCAC TCTCACACAG TCTCCGCACA CACACCTAGC 60

CTCGTGGCGG ACAATCCATA GCCAAAGCCC CTCTCTAACA TCTCGACCGC CTGCTGCCGA 120

AGCATACGAT CATGCGTCAA ACCCAGATCC ACAGTCACGA TAAGCCTCCC ATTCGCTGGA 180

CTTCAAATTC GATGTCGAAG ATACGGGAGG CAGTACACAA TCAGACAAGG CCGCGGCCGG 240

TTGCTACGGA AGACGACCCT TACGCGATGG TCTACTCGGC GCCGTCCTGG GCGCAGGCCG 300

GAGCCATATC CTGCGAGTAG TCCATCTCTG CGGGCTTCAG GCAGATCGAG GAGCCCGTGA 360

ACTTCCGGTC CCGGCCGGCC TTAAGCTGGG CGAGGTAGTC GTTCGCTCAG CGGATGACCT 420

GGTAGCCGAG GATATCGATG ACGGCCAGGT TGATGTGCGC CATGAGGCCA ATCACGATGT 480

CGCGGAGGTT GCACGGGACC TCATAGTTCA GGAGCTGGCC GCAGATATCG AGTCTAGCGG 540

CCACGTGACG GAAGGCGGTG AGCATCGAGT GCTTGATTTC GATCTAGCGC AGCAGCAAGC 600

GGAAGTAGAC CTCGTCGTAG TAGATGTTGC CGACTAGCGT CGTGATCGCG AAGAGTAACA 660

GTGCGAACGA GATGAAGACA TGGACGACCG GCTGGACGAG CACCGTGACC ATCGCGTCAT 720

TCACGAAGGG AGCGCCAGTC ACGCCGCAAT CATCGCAGAC GCCCGAGAAG AGAACAACGA 780

ACGCTGTGAA GGTACATATG ATCATTGTGT CGATGATGAC GGAGTGCATC TGGTCGAGGC 840

CTTGCTTGGC TGGGTGGGAC ACGTAGGCGG AGGCTGCGGC GTTCGTCGCC GAACCATCGC 900

CGGCGTCGTT CGAGTGCAGG CCGCGGTTGA TGCCGTAGAT CATGGCGGAA CCGGCGAGGC 960

CGCCGTAGAT AGCCTGTAAG TCGAATGCAC CCTTGATGAT CGCGGAGTAC ATCGCGGTAA 1020

TGTTGTGCAA GTTGAGGCCG ATGACGACCG CGCCCACACC CAGGTACATG ATGGCCCTGA 1080

CGGGACCGAG GAAGCCCGTC ACCTCGCTCA GGCGCCGCGT GCCGCCCAGG ATCGACCCTG 1140

CCATCACAAT CGCCAGGATG GCACCGATGA TCCACGGAGT CCACTCGCTT TGCCCAGCTC 1200

TACTGGATGA AGGCATCGGC GACATTGAAA GATGCAAGCA TGTTAGAAAG CCACCAATGT 1260

AGATAAGGAT CAGAACGATA GCGAAGAGAT AAGGCGAGAC AGTACTGCTT AGAGCAGTCT 1320

GTATATAATA GCAGGAACCA CCGTTAGAAG TGGTTAAGGG CAGCGCATTC CTAGTAAATC 1380

TTAAAGTGCC CCGCATGGGA AGTACGACCG CAAGGCAAAA CTCAAAGGAA TTGACAGGGG 1440

CCAGCACAAG CAGCGGAGCA TGCGAATTAA TTCGATGCAA CGCAAAGAAC CTTAACCTAG 1500

GGCTAGACAT GCACAGCGGC ACTGCAGAGA TGTGATGGCA TTTAGATGGT CGTGTGAAGG 1560

TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG 1620

CAGCCCTTGC CCTATGTTGG CAGCACGTGG TGGTGGGGAC TCGTGGGTGA CTGCCGTGGT 1680

TAACTCGTAG GAAGGTGGGT ATGACGTCTA ATCATCATTC CCCTTATTTC TTGGGCTGCA 1740

CGCATGGTAC AATGGCTGCT ACAGAGGCTT GCGATACTGC GAGCTGGAGC GAATCGCTTA 1800

AAGCGAGTCT CAGTGCGGAT TGGGCTCTGC AACTCGAGCC CATGAACGTG GAGTCGTTAG 1860

TAATCTCAGA TCAGCATCGC TGCGTTGAAT ACGTTCTCGC GCCTTGTAGA CACCGCCGGT 1920

CACGTCACGA AAGTGGGTAA CACCGGAAGC CCATGGCGTA ACCGCTGTGT GCGGGGTGAG 1980

TGGGCGAAGG TGGTATTGGC GATTGGTACG AAGTCGTTAC AAGGTAGTCG TACCGTAAGG 2040

TGCGTCTGGA TCACTTCCTT TCTATGGAGC CCATTTGTTG GGGATCAATG CAGCATGTTG 2100

GCCTTGTGGT TGGTGTGTGG GGTTGTTGTC TTGTGCGTGC ATGTGTAGGC CACCGGATGT 2160

GGCTGGTGGG TGTGGCTGCG TTACTGCGTT GGGCATACGA AGTCATACGA GCGCGCACAC 2220

TGTCGGCTTC ACGTTCACCA CCGTGTCGGC GTCCGCCACG TGTTGTGCTG GTTGCCCGCG 2280

CAGCCCGCCT GATGGTCTGT TGGCTGTCGG TGTGCGTGGT GGCTCGTTTG TGATCTGTAT 2340

AGTGGTCGCG AGCATATTCG TTCTGTACCG TTCTTTGTGT TTTGTCTAGT CTTATTGGGC 2400

ATTCGGTGGA TGCTTTGGCA TCATGAGCTG ATGAATGACG TTGCGGCCTG CGATATGCCT 2460

CGGTGAGCTG GCGAGCTAGC GTTATTATCT GAGGTTGTCC GAATGGGTGA ACCTAACCTG 2520

GGTTGTGCTG GTTTACCATC ATCTGATCGT GTATAGGTTG GTGGGTGGAA CGCGGTGAAG 2580

TGATACATCT CAGTACTCGC AGGATAAGAT ATTCGGTGAG TAGTGGCC 2628

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

AATGCGCTACCAGATGAGCCGCG 23

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ATGGCAGGGTCGATCCTGGGCA 22