可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用的制作方法

本发明属于生物工程技术及基础医学领域，涉及可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用。

背景技术：

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)泛指长度大于200nt，不能翻译产生蛋白质的一类转录本。与编码蛋白质的mRNA相比，lncRNA种类更多，组织表达特异性更强，表达丰度较低，物种间的保守性也较差。lncRNA虽不能翻译合成蛋白质，但仍具有强大的基因调控能力，能够通过对编码蛋白质的RNA的调控，参与到生物发育、疾病发生等诸多环节当中。事实上，lncRNA与能够编码蛋白质的mRNA具有众多相似之处：他们的转录均依赖于RNA聚合酶II，且都需要经历剪接、加帽、加尾等转录后修饰，部分lncRNA也能够与细胞核糖体结合，这些特征都提示部分lncRNA可能具有潜在编码蛋白质的能力。由于目前lncRNA的发现多依赖于高通量测序(RNA-seq)，而其注释主要依靠生物信息学工具，正因如此，许多隐藏在lncRNA序列中的较短的开放阅读框(open reading frame,ORF)被忽视掉了。前期已有部分研究，报道了在线虫和果蝇等低等生物中发现从lncRNA中合成的短肽，而在哺乳动物中，也相继发现了三种从注释为lncRNA的转录本中编码出的短肽，参与骨骼肌收缩及损伤后修复等重要生物学功能。然而，以上报道均是在研究lncRNA时偶然的发现，并没有形成一套固定的研究方法，相信还会有更多的潜藏在lncRNA中的具有重要功能的蛋白质被发掘。

分布在血管壁中层的血管平滑肌细胞，与血管功能关系密切，生理状态下血管平滑肌细胞的增殖能力和分泌活性都很低；然而在受到胞外不良因素刺激后，平滑肌细胞会发生去分化，失去成熟平滑肌细胞的功能和分化标志，而增殖和迁移能力显著增强。血管平滑肌细胞的表型转换是动脉粥样硬化、高血压的血管重构中的关键环节。因此，寻找到调控血管平滑肌细胞表型转换的因素，有助于更好地理解心脑血管疾病发生发展的机制，为寻找新的治疗策略提供线索，这也是多年来全球科学家共同努力攻克的命题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于(1)提供一种可编码ArtRD蛋白基因；(2)基因序列如SEQ ID NO：4所编码的ArtRD蛋白；(3)由ArtRD蛋白制备出抗体；(4)ArtRD蛋白作为靶点在生物学上检测、标志物中或在平滑肌细胞表型转化试剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种可编码ArtRD蛋白基因，其所述基因序列如SEQ ID NO：4所示。

由基因序列SEQ ID NO：4编码的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

一种重组蛋白载体，由空载体和插入该空载体的ArtRD蛋白基因组成。

进一步，空载体为PGEX-4t-1或pcDNA3.1(+)。

由基因序列SEQ ID NO：4编码的ArtRD蛋白作为抗原制备得到的抗体。

进一步，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测高血压试剂盒中的应用。

检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测血管平滑肌细胞表型转化试剂盒中的应用。

ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的抑制剂在制备降低血管平滑肌增殖迁移试剂中的应用。

进一步，所述抑制剂为含有干扰序列如SEQ ID NO：14所示的shRNA慢病毒载体。

本发明的有益效果在于：从lncRNA中研究出可编码为ArtRD蛋白的基因，并克隆出的一种血管组织表达特异性的ArtRD蛋白，识别其生物学功能，ArtRD蛋白能够促进血管平滑肌细胞表型转换，参与高血压及血管重塑等病理过程的发生发展。本发明SEQ ID NO：4所示可编码ArtRD蛋白基因，及其可表达的ArtRD蛋白对进一步研究血管平滑肌细胞病理生理功能、血管重构相关疾病发生发展提供基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为ArtRD原核表达SDS-PAGE鉴定；

图2为ArtRD原核表达纯化蛋白SDS-PAGE鉴定

图3为ArtRD纯化后特异性抗体SDS-PAGE鉴定；

图4为ArtRD在大鼠不同组织中的表达情况；

图5为FLAG-ArtRD过表达于HEK293a细胞，IP及WB检测；

图6为慢病毒shRNA干扰ArtRD表达后，VSMC分化标记蛋白改变情况；

图7为FLAG-ArtRD质粒转染VSMC后，VSMC分化标记蛋白改变情况；

图8为FLAG-ArtRD质粒转染VSMC后，ArtRD与FLAG表达及共定位情况。

其中：图1泳道M：蛋白分子量标志

泳道1：未经IPTG诱导；

泳道2：0.5mM IPTG诱导后；

泳道3：37℃0.5mM IPTG诱导后上清液；

泳道4：37℃0.5mM IPTG诱导后沉淀；

图2：泳道M：蛋白分子量标志；

泳道1：未经GST亲和层析柱纯化蛋白溶液；

泳道2：GST亲和层析柱通过蛋白溶液；

泳道3：GST亲和层析柱洗脱液。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

部分材料如下：

1.载体和感受态细胞：

PGEX-4t-1质粒(钟鼎生物保存)，pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)，TOP10菌株(钟鼎生物保存)，DH5α感受态细胞(TIANGEN)。

2.分子生物学试剂与培养基：

限制性内切酶及T4连接酶(NEB)，PCR相关试剂(TAKARA)，WB所用抗体均购自Abcam公司，WB SDS-PAGE配置试剂盒购自碧云天公司，RASAL2-AS1shRNA由汉恒生物合成，anti-FLAG M2beads购自Sigma公司，DMEM高糖培养基及胎牛血清购自Gibco公司。

3.细胞：

大鼠VSMC A10细胞系、HEK293a细胞系均由第三军医大学大坪医院心血管病实验室保种。

4.实验动物：

新西兰白兔(雄性，2-2.5kg)购自南京模式动物研究所。

实施例一、ArtRD的发现

通过长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片检测，比较了自发性高血压大鼠(SHR)与正常血压大鼠(WKY)主动脉组织中差异性表达的lncRNA。在差异性表达的lncRNA中，关注到了一条在Refseq数据库中注释为lncRNA的转录本NR_027983，由于其位于RASAL2基因反义链上，将其命名为lncRNA RASAL2-AS1(RASAL2antisense1)，如序列SEQ ID NO：1所示。lncRNA RASAL2-AS1在高血压大鼠的主动脉组织中高表达，并且特异性分布于血管组织中，在人的转录本NR_027982human RASAL2-AS1(如序列SEQ ID NO：2所示)和小鼠转录本NR_027984mouse RASAL2-AS(如序列SEQ ID NO：3所示)的基因组中具有同源序列，上述序列在数据库中均注释为lncRNA。

数据库对于lncRNA的注释基于生物信息学分析，但并未通过实验验证其实际能否编码。使用NCBI ORF Finder在线工具分析lncRNA RASAL2-AS1的编码潜能时，意外地发现其外显子中包含了一段长为354bp的开放阅读框(ORF)，提示其可能编码蛋白质，如序列表SEQ ID NO：4所示。

实施例二、ArtRD表达载体的制备与原核表达：

(1)ArtRD原核表达载体构建及表达检测：

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因ArtRD，引物序列如下：

F：CCGGAATTCATGGGAAAGGCGCTTCCCTTTCT，如SEQ ID NO：10所示；

R：GATGCGGCCGCCTAGGTCTGATCTTGGACAG，如SEQ ID NO：11所示。

1)双酶切连接至PGEX-4t-1载体的EcoR I和Not I酶切位点之间以获得重组质粒PGEX-4t-1-ArtRD，再将该质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，选取测序完全正确的单克隆，用于后续实验。ArtRD基因序列见序列SEQ ID NO：6。

2)通过重组质粒PGEX-4t-1-ArtRD表达出的蛋白含有GST-tag，蛋白大小理论分子量为39.63kDa，氨基酸序列见SEQ ID NO：7。

3)质粒转化：将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min，42℃热激90sec，迅速置冰中5min，加入600μl LB培养液，37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

4)异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导pGEX-4T-1-ArtRD载体融合蛋白的表达：挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml AMP的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜，次日按体积比1:100接种于50μg/ml AMP的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4h，诱导融合蛋白表达；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000g，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。进行12％SDS-PAGE检测分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，考马斯亮蓝染色显带，结果见附图1所示。

5)包涵体蛋白的变复性：将菌体沉淀重悬于20ml lysis buffer(20mM Tris-HCl contain 1mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail,pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素pH8.0)溶解包涵体，4度放置过夜；18～25℃，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20mM Tris-HCl 100mM NaCl pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。

6)融合蛋白的GST柱亲和纯化及结果分析：利用低压层析系统，包涵体复性溶液以0.5ml/min流速上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱；用GST Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用GST Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，50m MGSH，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜；进行12％SDS-PAGE分析，结果见附图2所示。

(2)ArtRD真核表达载体构建：

1)采用基于逆转录PCR方法合成FLAG-ArtRD基因序列：使用TAKARA RNAiso试剂从大鼠胸主动脉平滑肌细胞提取总RNA，使用TAKARA一步法逆转录试剂盒，用随机引物逆转录获得总cDNA文库。设计FLAG-ArtRD扩增特异性引物，引入EcoR I及Xba I双酶切位点，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAAAGGCGCTTCCCTTTCTTC-3’(引入FLAG-tag，及EcoR I酶切位点)如序列SEQ ID NO：12所示；下游引物：5’-CGTCTAGACTAGGTCTGATCTTGGACAGCTGGTGCACCGGT-3’(引入Xba I酶切位点)，如序列SEQ ID NO：13所示。使用TAKARA PrimeSTAR Max Polymerase进行PCR扩增。PcDNA3.1(+)-FLAG-ArtRD插入片断序列如序列SEQ ID NO：8所示；翻译编码的FLAG-ArtRD融合蛋白序列如SEQ ID NO：9所示。

2)将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit切胶回收，限制性内切酶双酶切后，使用QIA quick PCR Purification Kit进行DNA纯化，再将纯化后的目的DNA片段使用NEB Quick Ligation Kit连接入真核表达pcDNA3.1(+)载体，再转化DH5-α感受态细胞，铺LB平板37°过夜。

3)挑取单克隆，摇菌培养，测序，质粒鉴定无误后保存并用于后续实验。

实施例三、ArtRD特异性抗体的制备

1免疫动物：以实施案例一种原核表达出的ArtRD蛋白进行BCA蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400ug/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对ArtRD蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

2抗血清(抗体)效价检测：

1)抗血清间接ELISA效价检测：根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记；包被：用PBS包被液将ArtRD蛋白、GST蛋白抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。包被抗原：ArtRD蛋白、GST蛋白包被浓度：5ug/ml,100ul/孔包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)；封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200ul封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次；一抗反应：抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100ul，37℃恒温箱1h；二抗反应：取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀释好的酶标二抗，酶标二抗：羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1小时。显色取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。终止反应每孔加入100ul 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

2)抗体效价检测结果：

包被抗原：ArtRD蛋白、GST蛋白

包被浓度：5ug/ml，100ul/孔

包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)

二抗：羊抗兔-HRP，1/5000

抗血清效价大于121K。

3抗体纯化：

将ArtRD蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将兔子抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，再进行纯度，浓度和效价测定。然后将GST蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，用上步所得洗脱液(即所需纯化抗体)缓慢上样，收集流出液，即最终得到的纯化ArtRD抗体，再进行相关纯度、浓度和效价测定。

4抗体鉴定：

1)通过ELISA检测上步中经过GST蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱最终得到的纯化ArtRD抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。最终得到纯化抗体效价大于512K。

2)抗体浓度鉴定：0.2mg/ml缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)

3)抗体纯度鉴定：纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。电泳条带见附图3。

上述ArtRD原核表达及特异性抗体合成委托南京钟鼎生物有限公司实施。

实施例四、ArtRD表达水平的鉴定。

在获得ArtRD特异性抗体后，能够使用该抗体进行自然状态下ArtRD蛋白的检测。使用Thermo Fisher T-PER组织蛋白提取试剂提取了大鼠多种组织的蛋白，并通过蛋白质免疫印迹实验(WB)检测该段蛋白质天然表达情况及组织分布情况，结果见附图4。依据WB结果可知，ArtRD分子量为12.9kDa，且特异性分布于血管组织，据此，将其命名为Arteridin，缩写为ArtRD。

在检测了自然状态下ArtRD表达水平后，使用上述构建的FLAG-ArtRD过表达质粒，利用QIAGEN Attractene转染试剂将过表达质粒转染入HEK293a工具细胞中，经过48小时表达，提取蛋白质用于后续实验。提取出的蛋白质一部分直接使用ArtRD特异性抗体进行WB检测；另一部分使用Sigma anti-FLAG M2beads进行免疫沉淀(IP)，再将IP后的蛋白使用ArtRD特异性抗体进行WB检测，结果见附图5。结果表明，FLAG-ArtRD过表达载体成功表达于HEK293a细胞。

同时，将FLAG-ArtRD过表达质粒转染入大鼠原代血管平滑肌细胞，经过48小时表达，将细胞固定，再分别使用小鼠来源的抗FLAG抗体及抗ArtRD特异性抗体进行免疫荧光染色，二抗使用不同颜色荧光标记。经过共聚焦显微镜观察，可见FLAG蛋白与ArtRD蛋白共定位，成功过表达于大鼠原代血管平滑肌细胞中，结果见附图8。

以上实验证明ArtRD在自然状态下特异性表达于血管组织，FLAG-ArtRD过表达质粒能够成功克隆ArtRD，使之过表达于哺乳细胞中。

实施例五、ArtRD蛋白质的生物学功能

针对lncRNA RASAL2-AS1序列设计了多条探针(委托广州锐博生物有限公司)，使用RNA荧光原位杂交技术(FISH)，发现lncRNA RASAL2-AS1特异性分布于血管组织中层，即血管平滑肌细胞(VSMC)层。同时使用ArtRD特异性抗体，进行蛋白质免疫荧光染色，发现ArtRD蛋白特异性分布于血管平滑肌细胞(VSMC)中，提示其功能在于调控VSMC功能。

使用Q-PCR，实验发现相较于正常血压大鼠(WKY)，lncRNA RASAL2-AS1在自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉组织中显著高表达，其表达的差异性出现于高血压稳定后，提示其功能在于加重高血压后的血管重构。因血管平滑肌细胞的表型转换是动脉粥样硬化、高血压的血管重构中的关键环节，所以表明ArtRD蛋白对于VSMC表型转换中的作用。首先，使用RASAL2-AS1shRNA慢病毒，shRNA序列：GTGGCAAGACCAAGATAATGT，如SEQ ID NO：14所示，敲降了VSMC中RASAL2-AS1，VSMC分化标记蛋白(α-SMA，Calpinin)表达量显著上升，参见附图6，另外，VSMC的增殖迁移能力也显著下降；同时，使用FLAG-ArtRD过表达质粒在VSMC中过表达ArtRD，附图7表示VSMC分化标记蛋白表达量显著上升。

综上，表明ArtRD促进了VSMC由收缩型向分泌型表型转换，加重血管重构，能够成为潜在的检测、治疗靶点。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院

<120> 可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 890

<212> DNA

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<223> NR_027983 rat RASAL2-AS1

<400> 1

gaggaggaac tgccgccgaa gacagcaaaa atcgggcacc gaaatactca tcgggccagg 60

cccgcctact ttcctaagac tgtccggctc ggaccgcctc tcggtgcggg atcttcgagc 120

tgctggtgga agctgagacg gtgtggggag gcggagagaa aagggggtgc gggaaattta 180

aaaagatggg aaaggcgctt ccctttcttc ttagcccctt ccctgttgat ttctggacca 240

atgcttcttt cttgaacgaa gagcatgaag acgctgcttt atctaacagt caccttggag 300

gaaacgccat cgttcttcca gaagggagat ctggcccccg gtcttggatt ctgagatcag 360

tgcgagatcc cggctctgcg ccctgtccgc cctggaactg gatttatcat cagtttagaa 420

tagcatggct acgatgtgtg gtgtggatgg atggacgagc cccgcaagtg caaacaggac 480

agtccaggtt acctgacaaa gcagccaccg gtgcaccagc tgtccaagat cagacctagg 540

tcaatcactg acatggctaa aagcaccaag aaggtctgga tcattgtgct gcctcactcc 600

aaaaaatggt gacaaaaatt aaaatcaacc agcacgccag gatcctctgt ggcaagacca 660

agataatgtg ggccactgtc atctggcact gtggttcctt catgacaaca atggctggtg 720

ggtcctgggt ttactacacc acttctgctg tcagtcaaac tagccatcag gagactgaag 780

gaaatgaaag accatagaag tgctactgtc tgagcagccc tggcctccag taaatgagtc 840

attcctatga caaaattata ataaaaagtg ttggttgagt aacccttctg 890

<210> 2

<211> 2329

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<223> NR_027982 human RASAL2-AS1

<400> 2

gcctgaggag gggtaggggg cggtggcccc gggttctagc ccgcctgtcc tcggccccca 60

cttctggaat gagcctgccc gccccctgac tctcaggcca cagctccggc cacagctctg 120

gctcctgctc cgcggcggat cccacaaacc cggcagccac ggcggtggcg gtggcggtgg 180

cggtggcggt ggcggcggcg gcggcggcgg cagcggcagg cggcatccca gggtgatagg 240

ctgaagcaat cgagggccga gagcccggcc gcgtgtgcac tcgagtaacg aagccgggga 300

gggactgcgc cgcaggcagg aaaagtcgga caccgaatta ttcatccggc ctgtcccgcc 360

tactttccaa gtaccctccc agggatagcc gggtattgag cggtccgggt ctctgctgct 420

caaaagatcg aagaagctgc tttatcttac agtcacccaa gggggagcgc cttcttcctt 480

cccagagtgg agtggcagtg ggtccgggat tctgggatat gcacagggtc tgcgccctgc 540

gccctgtccg cgctgaagct gaacttgtca ttggtttgca acagcatggt gaagaagtgt 600

ggtgtggatg gacggacggg cctctcaggc acatgaaata ctcaaagccc agtattaacc 660

aaacatgttt ctctgttttg tctttgatct ttgtgcagtg tgttggcttt tttcctttaa 720

tgatgtcact tgtattttat ttttggttta tttgtagact gtctccctcc ttggccatgg 780

ctttactttt atgtccaccc aaggagagtt tcaccagttt aggtttaaga aattactgac 840

aagttaacaa taataatttc aaaattgaac agtaataact taaaccgtgc cttggacata 900

gtagatctcc aacagttttt cttgaatgtg gctacctaat gtggaacaag atttttcata 960

attacatgtt gctattttta ataccttttg ggaggttctt tagtcccccc cgccctttct 1020

ccctacgttg cacaaagaga ctggtctaca aggggtcctg ttagttttct ggttttgtgg 1080

ggtcctggaa tattgtttgg gcttattgag agttaacaag gatgtatttt gtgagtttct 1140

ccaaagtctt atttagagta atagtatttc aaagcaagaa gtgttttaga gagaacatca 1200

ttctgcctct tgtttaacag gtgaggaaac tgaggaaaaa ccagcttacc tggctaatca 1260

accacaagta cagatagttc cacaatgact caatggatat tacttcaact ttgttccctc 1320

aagaaacttt tgtgattaag cttgttgatt tgtggcttga tggtttacag gaatggtcat 1380

ttttaatatc taggaccctg cttgcttgct tgcttgcttg cttactagac tggctgcata 1440

gtcagtcttc cacgtgtaaa caacagtgtg tgctttagtg gataagagat gttgagtgct 1500

gagatttcaa ggctcagcac tgagtagacc tagagcattt ttatttatac taaattaatg 1560

ccatggtaac ataagttaga cagcaagtga atatggcatc aaatgtacaa agttgagtat 1620

ctctttacta gtcaatgtat aaggaattta tttacccaag caattatctt aaaaacagca 1680

ttacaagtgg tatgcgaaac atttccagaa tttatttcca catctgctct ttcagtggca 1740

tcatccattc ctgagctcaa gaaaaggcct ctgccaaccg ccagtaatcc tgctttttta 1800

gtaatcctac tatttttttt ttaactttaa gttctgggat acatgtgcag aacatgcagg 1860

tttgttacat aggtatacat gtgcctatgt atacctatgt aacatggtgg ttacagtaaa 1920

catggtggtt tactgcatct atcaacccgt catctaggtt ttaagccctg cattcattag 1980

atatttgtcc taatgctctc cctccccttt cccccacgcc ccgacaggcc ccagtatgtg 2040

atattaccct ccctgtgtcc atgtgttctc atcgttcaac tcccacttat aagtgagaat 2100

atgcagagtt tggttttctg ttgtgttact ttgcttagaa tgatggctcc cagcttcatc 2160

catgtccctg caaatgacat gaactcattc ttttttatgg ctgcatagta ttccatggtg 2220

tatatgtgcc acattgtctt tatccagtct atcatcgatg gcatttgggt tggttccaag 2280

tctttgctat tgtaaatagc actgcaataa acatacatgt gcatgtgtc 2329

<210> 3

<211> 1194

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<223> NR_027984 mouse RASAL2-AS1

<400> 3

cggctcccgc cgccgtcgcc tcgggggctc aaagcgccgg ctccctcagc ctgaggggcg 60

cgccccggcc cagcttctgt ccgcctggcg tcggcttgct cccgcggaac gcgcaggccg 120

gcccgctaac tctcaggccg ccgctccggc cgctgcttgg gctcctccgg ctcgcgctcc 180

tctgagaaac ccacaagccc ggcagccgcg gcgctggcgg cggcggcagg cggcatccca 240

gggtgatagg ccgaagcaat cgagtgccga gctcacggcc gcgtgtgcaa tccagtaacc 300

gagcggagga ggaactgccg ccgaagacag caaaaatcgg gcaccgaaat actcagcggg 360

ccaggcccgc ctactttcct aagactatcc tgctccgacc gcctctcggt gcggggatcc 420

tcgagctgct ggtggaagca gagacggtgt tggggaggcg gagagaaaac ggggtgcggg 480

aaatttaaaa agatgggaaa ggcgcttccc ttttatctta gcccctatcc tgttgatttc 540

tggaccaatg cttctttctc ggacgaagaa catgaagacg ctgctttatc taacagtcac 600

ctcggaagaa acgccatggt tcctccacaa gggagatctg gccccgcgtc ttggatcctg 660

agatctgtgc gagatcccgg ctttgcgccc tgtccgccct ggagctggat ttatcatcag 720

tttagaatag catggctacg atgtgtggtg cggatggatg gacgagcccc gcaagtgcag 780

acaggacagt ccacatcacc tgccaaagca gccagcaatg caacagctct ccaagatcag 840

gcctaggtgg atcactgacc tggctaaaag taccaagaag gcctggatca ttgtggtgcc 900

tctctccaga aaatggtgac aaaaattgaa atcaaccagc acatcaggat cctctgtggc 960

aagaccaaga taataatggg ggacactgtc atctggcact gtggttcctt cacgacaaca 1020

gtggctggtg ggtcctagat ttacaacatc acttctgctg tcacagtcaa accggccatc 1080

aggagactga aggaaattaa agaccagtag aagtgctact gtttgagcag ccctggcctg 1140

caataaatga gttcattcct atgaaaggtt gtaataaagt gttggttgag taac 1194

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD DNA序列

<400> 4

atgggaaagg cgcttccctt tcttcttagc cccttccctg ttgatttctg gaccaatgct 60

tctttcttga acgaagagca tgaagacgct gctttatcta acagtcacct tggaggaaac 120

gccatcgttc ttccagaagg gagatctggc ccccggtctt ggattctgag atcagtgcga 180

gatcccggct ctgcgccctg tccgccctgg aactggattt atcatcagtt tagaatagca 240

tggctacgat gtgtggtgtg gatggatgga cgagccccgc aagtgcaaac aggacagtcc 300

aggttacctg acaaagcagc caccggtgca ccagctgtcc aagatcagac ctag 354

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> ArtRD 氨基酸序列

<400> 5

Met Gly Lys Ala Leu Pro Phe Leu Leu Ser Pro Phe Pro Val Asp Phe

1 5 10 15

Trp Thr Asn Ala Ser Phe Leu Asn Glu Glu His Glu Asp Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Asn Ser His Leu Gly Gly Asn Ala Ile Val Leu Pro Glu Gly Arg

35 40 45

Ser Gly Pro Arg Ser Trp Ile Leu Arg Ser Val Arg Asp Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Pro Cys Pro Pro Trp Asn Trp Ile Tyr His Gln Phe Arg Ile Ala

65 70 75 80

Trp Leu Arg Cys Val Val Trp Met Asp Gly Arg Ala Pro Gln Val Gln

85 90 95

Thr Gly Gln Ser Arg Leu Pro Asp Lys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Ala

100 105 110

Val Gln Asp Gln Thr

115

<210> 6

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pGEX-4T-1- ArtRD插入片段序列

<400> 6

tgattttctt agcaagctac ctgaaatgct gaaaatgttc gaagatcgtt tatgtcataa 60

aacatattta aatggtgatc atgtaaccca tcctgacttc atgttgtatg acgctcttga 120

tgttgtttta tacatggacc caatgtgcct ggatgcgttc ccaaaattag tttgttttaa 180

aaaacgtatt gaagctatcc cacaaattga taagtacttg aaatccagca agtatatagc 240

atggcctttg cagggctggc aagccacgtt tggtggtggc gaccatcctc caaaatcgga 300

tctggttccg cgtggatccc cggaattcat gggaaaggcg cttccctttc ttcttagccc 360

cttccctgtt gatttctgga ccaatgcttc tttcttgaac gaagagcatg aagacgctgc 420

tttatctaac agtcaccttg gaggaaacgc catcgttctt ccagaaggga gatctggccc 480

ccggtcttgg attctgagat cagtgcgaga tcccggctct gcgccctgtc cgccctggaa 540

ctggatttat catcagttta gaatagcatg gctacgatgt gtggtgtgga tggatggacg 600

agccccgcaa gtgcaaacag gacagtccag gttacctgac aaagcagcca ccggtgcacc 660

agctgtccaa gatcagacct aggcggccgc atcgtgactg actgacgatc tgcctcgcgc 720

g 721

<210> 7

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> GST-ArtRD氨基酸序列

<400> 7

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

210 215 220

Gly Ser Pro Glu Phe Met Gly Lys Ala Leu Pro Phe Leu Leu Ser Pro

225 230 235 240

Phe Pro Val Asp Phe Trp Thr Asn Ala Ser Phe Leu Asn Glu Glu His

245 250 255

Glu Asp Ala Ala Leu Ser Asn Ser His Leu Gly Gly Asn Ala Ile Val

260 265 270

Leu Pro Glu Gly Arg Ser Gly Pro Arg Ser Trp Ile Leu Arg Ser Val

275 280 285

Arg Asp Pro Gly Ser Ala Pro Cys Pro Pro Trp Asn Trp Ile Tyr His

290 295 300

Gln Phe Arg Ile Ala Trp Leu Arg Cys Val Val Trp Met Asp Gly Arg

305 310 315 320

Ala Pro Gln Val Gln Thr Gly Gln Ser Arg Leu Pro Asp Lys Ala Ala

325 330 335

Thr Gly Ala Pro Ala Val Gln Asp Gln Thr

340 345

<210> 8

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pcDNA3.1(+)-FLAG-ArtRD 插入片断序列

<400> 8

atggattaca aggatgacga cgataaggga aaggcgcttc cctttcttct tagccccttc 60

cctgttgatt tctggaccaa tgcttctttc ttgaacgaag agcatgaaga cgctgcttta 120

tctaacagtc accttggagg aaacgccatc gttcttccag aagggagatc tggcccccgg 180

tcttggattc tgagatcagt gcgagatccc ggctctgcgc cctgtccgcc ctggaactgg 240

atttatcatc agtttagaat agcatggcta cgatgtgtgg tgtggatgga tggacgagcc 300

ccgcaagtgc aaacaggaca gtccaggtta cctgacaaag cagccaccgg tgcaccagct 360

gtccaagatc agacctag 378

<210> 9

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> FLAG-ArtRD氨基酸序列

<400> 9

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Lys Ala Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Leu Ser Pro Phe Pro Val Asp Phe Trp Thr Asn Ala Ser Phe Leu Asn

20 25 30

Glu Glu His Glu Asp Ala Ala Leu Ser Asn Ser His Leu Gly Gly Asn

35 40 45

Ala Ile Val Leu Pro Glu Gly Arg Ser Gly Pro Arg Ser Trp Ile Leu

50 55 60

Arg Ser Val Arg Asp Pro Gly Ser Ala Pro Cys Pro Pro Trp Asn Trp

65 70 75 80

Ile Tyr His Gln Phe Arg Ile Ala Trp Leu Arg Cys Val Val Trp Met

85 90 95

Asp Gly Arg Ala Pro Gln Val Gln Thr Gly Gln Ser Arg Leu Pro Asp

100 105 110

Lys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Ala Val Gln Asp Gln Thr

115 120 125

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表达合成基因 ArtRD上游引物序列 F

<400> 10

ccggaattca tgggaaaggc gcttcccttt ct 32

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表达合成基因 ArtRD上游引物序列 R

<400> 11

gatgcggccg cctaggtctg atcttggaca g 31

<210> 12

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表达合成基因 ArtRD上游引物序列 F

<400> 12

ccggaattca tggattacaa ggatgacgac gataagggaa aggcgcttcc ctttcttc 58

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ArtRD原核表达合成基因 ArtRD上游引物序列 R

<400> 13

cgtctagact aggtctgatc ttggacagct ggtgcaccgg t 41

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtggcaagac caagataatg t 21