本发明属于水质监测领域，尤其涉及一种用于BOD生物传感器的工程菌。
背景技术：
生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand，BOD)是监测水体中的有机物，特别是可生物降解的有机物含量的一个重要参数，是目前最常用的水体有机污染综合指标之一。BOD的标准测定方法为五日法，即样品在20±1℃的温度中培养5天,分别测定培养前后的溶解氧,二者之差即为5天的生化需氧量,以BOD5表示。但该方法操作较复杂，耗时长，结果准确度及重现性差，无法满足当前环境监测中快速测定的要求。
快速、准确测定各种复杂水体BOD值是生化需氧量研究的主要方向，因此要求传感器对水样中各种可生物降解的有机物具有响应，同时要与常规BOD测试方法具有可比性。但基于上述检测方法的缺点，使得如何集中研究热点于生物敏感材料的优良选取以及高效微生物膜的研制，使其能够快速、准确测定水体中BOD值，实现在线连续测定，适应于现代环境监测和管理的要求将是本领域研究的重要课题。
技术实现要素：
本发明提出了一种用于BOD生物传感器的工程菌，适应面较宽、活性高、稳定性和重现性好，能够满足不同种类的水样检测需求。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种用于BOD生物传感器的工程菌，由纳豆芽孢杆菌Bacillus natto和假单胞菌Pseudomonas sp.以重量比2:1混合而成。
作为优选技术方案，所述纳豆芽孢杆菌Bacillus natto选用静止期细胞，所述假单胞菌Pseudomonas sp.选用对数期细胞。
作为优选技术方案，所述纳豆芽孢杆菌Bacillus natto的培养温度为33℃，所述假单胞菌Pseudomonas sp.的培养温度为25℃。
本发明还提供了一种用于BOD生物传感器的微生物膜，采用如上述任一项技术方案所述的用于BOD生物传感器的工程菌作为菌种。
作为优选技术方案，还包括包埋剂，所述包埋剂与所述工程菌的重量比为1:1。
作为优选技术方案，所述包埋剂为海藻酸钠。
本发明还提供了一种用于BOD生物传感器的微生物固定化颗粒，采用如上述任一项技术方案用于BOD生物传感器的工程菌作为填料。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明所提供的用于BOD生物传感器的工程菌为混合菌种，而非单一菌种或者直接使用活性污泥，这不仅解决了单一菌种只能适应单一水质的缺陷，还可避免使用活性污泥作为敏感材料时测定的不稳定性和不确定性。该混合菌种适应面较宽、活性高、稳定性和重现性好，不仅可适用测定标准BOD样品，还可满足不同种类的有机物以及废水类型的检测需求。将上述混合菌种用于BOD生物传感器中可以极大的提高检测速度，可在8-30分钟内完成相关检测。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种用于BOD生物传感器的工程菌，由纳豆芽孢杆菌Bacillus natto和假单胞菌Pseudomonas sp.以重量比2:1混合而成。
上述实施例提供了一种工程菌，该工程菌为上述二者菌种的混合菌种，使用混合菌种作为工程菌，不仅可避免单一菌种出现的只能适应单一水质的缺陷，还可呈现出适应面较宽、活性高、稳定性和重现性好，以及可满足不同种类的有机物以及废水类型的检测需求的优势。在本实施例中，具体限定了二者的重量比，这里主要是考虑到在本发明实施例所提供的工程菌是用于BOD生物传感器快速测定的工程菌，其在检测时使用量少而又少(干细胞使用是mg级)，但需要在满足不同水质的检测需求的同时，达到极高的检测精准度要求。因此，为了达到上述预期效果，本发明实施例还优化了菌种的选择以及二者的配比关系。可以理解的是，上述菌种的选择也可分别扩充为两菌种的同源或同系列菌种，但经试验发现，由同源或同系列菌种混合而成的工程菌由于环状DNA和代谢机制的相似性较高，其降解类型差异很小，不同程度的存在多方面缺陷，并不能有效达到预期效果。
在一优选实施例中，所述纳豆芽孢杆菌Bacillus natto选用静止期细胞，所述假单胞菌Pseudomonas sp.选用对数期细胞。在本实施例中，优选了不同时期的菌种细胞，这主要是考虑到二者的生长稳定性以及混合后的稳定性，以使该混合菌种的稳定性和重现性均较好。
在一优选实施例中，所述纳豆芽孢杆菌Bacillus natto的培养温度为33℃，所述假单胞菌Pseudomonas sp.的培养温度为25℃。在本实施例中，进一步优化了特定培养温度下的上述两种菌种，这主要也是考虑到了菌种的性能发挥。将上述培养温度下的菌种混合制成工程菌，更有利于该混合菌种的稳定性和重现性。
本发明实施例还提供了一种用于BOD生物传感器的微生物膜，采用如上述任一项实施例所述的用于BOD生物传感器的工程菌作为菌种。本发明实施例提供微生物膜由于所采用的工程菌为上述实施例提供的混合菌种，因此可解决现有BOD生物传感器用微生物膜适应性较窄、性能不稳定、生物固定性差等缺点。
在一可选实施例中，还包括包埋剂，所述包埋剂与所述工程菌的重量比为1:1。在本实施例中列举了微生物膜中部分组成，可以理解的是，微生物膜的组成并不限于上述的包埋剂，在一种可选的微生物膜中，还可包括透气膜等。为了达到良好的透气效果，透气膜的孔径可为0.2-0.7μm，可为醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、GF-C膜中的任意一种。在一可选的制备过程中，可将透气膜粘合于双面胶的两侧，通过在双面胶上打孔，然后将工程菌和包埋剂混合均匀并涂布在双面胶的圆孔所对应的透气膜上制得微生物膜。为了达到良好的包埋效果，包埋剂与工程菌的重量比可为1:1。在一可选实施例中，所述包埋剂为海藻酸钠。可以理解的是，本实施例中的包埋剂并不限于海藻酸钠，但以海藻酸钠与本实施例提供的工程菌配合所达到的包埋效果最好。
本发明实施例还提供了一种用于BOD生物传感器的微生物固定化颗粒，采用如上述任一项实施例用于BOD生物传感器的工程菌作为填料。本发明实施例提供的微生物固定化颗粒由于所采用的填料为上述实施例提供的混合菌种，因此不但适应性强、性能稳定、生物固定性好，而且可以使用微量进样器进样，应用面较宽，并且由于每个固定化颗粒中的微生物含量是可控的，因而还能够使BOD生物传感器测量较为稳定。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于BOD生物传感器的工程菌，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
一种用于BOD生物传感器的微生物膜，所述微生物膜包括透气膜、工程菌、包埋剂、双面胶等，其中：
透气膜的孔径为0.2-0.7μm(优选0.45μm)，为醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、GF-C膜中的任意一种；
工程菌由纳豆芽孢杆菌Bacillus natto和假单胞菌Pseudomonas sp.以重量比2:1混合而成；
包埋剂为海藻酸钠，其与工程菌的重量比为1:1；
双面胶上每隔4cm打孔，孔径(0.5-0.8cm，优选0.6cm)，透气膜粘合于所述双面胶的两侧，将工程菌和包埋剂混合均匀后涂布在所述双面胶的圆孔所对应的透气膜上。
工程菌制备方法如下：
实验仪器：电子天平、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、三角烧瓶、电炉、高压灭菌锅、试管、接种环、酒精灯、无菌操作台、生化培养箱、摇床，离心机、离心管(10ml)、移液枪
实验材料：污水样(来源于不同污水处理厂及土壤)、0.8％生理盐水，
基础培养基：牛肉膏0.75g、蛋白胨1.5g、氯化钠0.75g、琼脂3g，
磷酸盐缓冲溶液：称取(Na2HPO4·12H2O)磷酸氢二钠1.79克，称取(KH2PO4)磷酸二氢钾0.68克，定容于1000ml蒸馏水中即得0.005mol·L-1磷酸盐缓冲溶液，其pH＝7.0，
纯菌株用液体培养基进行扩大培养，震荡48h(按所需温度33℃或25℃，140rpm)，之后离心(4000rpm，6min)得到工程菌菌体，用0.8％生理盐水洗脱三次，震荡24h(30℃，140rpm)，离心得到工程菌。
性能测试
将实施例1由混合菌种制备得到的微生物膜用于不同水样的实际测定中。进一步，与由单一菌种(国家行业标准(HJ/T86-2002)推荐使用的皮状丝孢酵母)和活性污泥处理得到的微生物膜进行对比，结合传统5日法结果评价如下，具体参见表1。
表1评价结果
注：表内偏差值为微生物膜测定法与5日法对比差异
结果表明：由本发明实施例所提供的混合菌种制备得到的生物膜不仅性能稳定性、重现性好，而且还可满足不同种类的有机物以及废水类型的检测需求。相比于由单一菌种和活性污泥处理得到的微生物膜以及传统5日法结果而言，相对偏差均小于5％，对于不同污染物具有良好的降解性。