一种蜡样芽孢杆菌快速磁分离的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于磁性纳米粒子的蜡样芽孢杆菌分离方法。

背景技术：

蜡样芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛分布于土壤、灰尘和水中，因此很容易污染各类食品，是常见的食品污染菌和条件致病菌。食品在20℃以上的条件下放置时，蜡样芽孢杆菌能迅速繁殖并产生毒素，同时，由于菌体本身不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生食物中毒。因蜡样芽孢杆菌污染引起食物中毒事件显示，多数是由剩米饭、米粉、剩菜、甜点、肉类制品等食物造成，最常见可导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。鉴于需要建立一种高效，快速的检测方法，基于功能化的磁性纳米粒子的分离技术在致病菌监测中得到了迅速发展。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便、分离时间短、低梯度磁场下从复杂基质中快速、特异分离目的菌蜡样芽孢杆菌的方法。

蜡样芽孢杆菌的快速分离方法，包括以下步骤：(1)吸取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，将对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs溶液中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs溶液中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs溶液洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取聚乙二醇90mg，溶解到1.8ml无菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性纳米粒子溶液中，反应3h，然后用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子；(5)称取91.3mg万古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分别溶于无菌的pbs溶液中，混合均匀后通过碳化二亚胺法，活化万古霉素表面羧基，活化10min；(6)将活化后的万古霉素加入到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子中，孵育6h；(7)反应完毕后，用无菌的pbs溶液洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到终浓度为2mg/ml的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，用于富集蜡样芽孢杆菌。(8)取10ml待测样品溶液，加入1mg万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，置于培养箱内，以200rpm/min的转速37℃孵育45min；插入磁力架分离6min；(9)磁分离后，无菌pbs溶液清洗后，再用无菌的pbs缓冲液混合重悬即得富集有蜡样芽孢杆菌的蜡样芽孢杆菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。

所述两端接有氨基的聚乙二醇，其分子量为2000da，其结构如图1。

所述磁性纳米粒子粒径为180nm，表面连有羧基。

首先万古霉素通过羧基与聚乙二醇的氨基相连，然后聚乙二醇的另一端氨基与磁珠表面的羧基相连，最后万古霉素通过五个氢键与蜡样芽孢杆菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相连。具体原理见图2。

本方法适用于从样品基质分离目的菌，特别适用从复杂基质中分离目的菌。食品样品包括各类新鲜或冷冻加工后的食品材质，如新鲜蔬菜、肉类、海鲜类和奶类等产品。样品处理按照常规处理方法即可，如将样品粉碎溶解后制成待测溶液。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明采用的是180nm的磁性纳米粒子，主要用于基质中目标菌的快速富集，而现有技术采用30nm或者50nm纳米磁珠结合树状分子的富集方法是用于磁信号的放大。

2、本发明采用的万古霉素是传统的商业药物，相比于抗体，具有稳定好，成本低，质量可控等优点。基于上述优点，在单次分离过程中，本发明构建的分离万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物在成本上比免疫磁分离陈本降低了195倍；在材料保存方面比免疫磁珠保质期也更长。

3、在食品基质或者血液中，是多种致病菌共存的环境。本发明采用的万古霉素是广谱的识别革兰氏阳性菌的分子识别剂，用于分离基质中的革兰氏阳性菌是一种通用的分离策略，可以将基质中的大多数革兰氏阳性菌都分离出来，然后通过聚合酶链式反应(pcr)或者选择性培养进行鉴别。相比之下，抗体因其只能专一的识别，从而分离出对应的目标菌，其他存在于机制中的致病菌无法鉴别。

4、本发明合成的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物是先将聚乙二醇偶联到磁性纳米粒子的表面，然后再将万古霉素修饰到聚乙二醇-磁性纳米粒子表面，相比于万古霉素先与聚乙二醇偶联后，再与结合多聚赖氨酸(pll)修饰磁性纳米粒子的方法，本发明的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物不仅可以达更好的分离效率，而且在材料合成中耗时更短时间和成本更低。

5、本发明将聚乙二醇分子先偶联在磁性纳米粒子表面，然后再将万古霉素分子偶联于聚乙二醇包被的磁性纳米粒子上，避免了常规方法中将万古霉素分子偶联于磁珠表面或者直接将万古霉素分子直接接在磁性纳米粒子表面，导致万古霉素或者万古霉素分子活性降低和空间位阻大的缺点。同时聚乙二醇作为分子臂具有很好的灵活性，有利于万古霉素分子与单增李斯特菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相连，提高了捕获效率。相比于直接偶联或者借助万古霉素分子中氨基作为反应基团的方法，该方法分离单增李斯特菌能力更强，特别适用于复杂样品单增李斯特的分离，如食品样品、全血样品等。

6、磁性纳米粒子偶联万古霉素时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的万古霉素联接在磁性纳米粒子表面。万古霉素与磁性纳米粒子表面距离太近，磁性纳米粒子本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起万古霉素空间构象发生改变，导致万古霉素生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引入聚乙二醇分子，其具有一定的空间长度，从而使万古霉素分子远离磁性纳米粒子和磁性纳米粒子表面，避免了磁性纳米粒子本身性质及表面对万古霉素分子的影响。同时，引入聚乙二醇却不会影响万古霉素分子的空间构象，从而起到了保护万古霉素分子生物活性的作用。

7、本发明采用聚乙二醇分子，提高磁性纳米粒子在溶液的稳定性，避免发生沉淀，增加复合物的水溶性和生物相容性。

附图说明

图1两端氨基的聚乙二醇聚合物结构示意图；

图2本发明所涉及的磁分离技术操作流程图；

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

磁性纳米粒子(180nm)购买于上海奥润有限公司。

两端氨基的聚乙二醇2000da，购自于威海晨源化工新材料有限公司。

万古霉素分子购自于上海阿拉丁有限公司。

n-羟基丁二酰亚胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐edc等均为常规试剂，不再赘述。

0.01mpbs溶液配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸馏水中，用5mnaoh调节ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs溶液。

实施例1

1.万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，按照如下步骤制备:

(1)取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；

(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；

(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；

(4)称取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml无菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性纳米粒子溶液中，反应3h，然后无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子；

(5)称取91.3mg万古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分别溶于无菌的pbs溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化万古霉素表面羧基，活化10min；

(6)将活化后的万古霉素加入到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子中，孵育6h；

(7)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到浓度为2mg/ml的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，用于富集蜡样芽孢杆菌。

2.富集捕获：取待测样品溶液10ml，加入1mg万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，置于混匀仪上，以200rpm/min的转速室温孵育45min形成蜡样芽孢杆菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物复合物；将离心管插入常规磁力架分离6min；

3.去离子水轻轻清洗后，用pbs缓冲液混合重悬即得富集有蜡样芽孢杆菌的蜡样芽孢杆菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。

实施例2富集效果实验

(1)取1ml浓度为10⁵cfu/ml的蜡样芽孢杆菌于1.5ml无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，用等体积无菌pbs溶液重悬。

(2)富集捕获：分别设置本发明技术方案组：聚乙二醇-磁性纳米粒子组、万古霉素-磁性纳米粒子、万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子组富集目的菌。

(3)磁分离后，将上清液移入无菌离心管中，而分离出来捕获有蜡样芽孢杆菌的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子则用pbs溶液清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬蜡样芽孢杆菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子。

(4)捕获率计算：将各组富集的目的菌重悬液进行梯度稀释后，用平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算目标菌的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：[被富集吸附的菌落总数/(上清液中菌落总数+被富集吸附的菌落总数)]×100％。

所述各组富集捕获目的菌的方案如下：

a.本发明技术方案组(蜡样芽孢杆菌-万古霉素和万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子组)富集捕获目的菌方案如实施例1，具体如下：将1mg万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以200rpm/min的转速室温孵育45min。将离心管插入常规磁力架分离6min。

b.万古霉素-磁性纳米粒子组富集捕获目的菌方案具体如下：

将1mg制备好的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以200rpm/min的转速室温孵育45min。最后，将离心管插入常规磁力架分离6min。

所述万古霉素修饰的磁性纳米粒子制备：(1)取2ml磁性纳米粒子(1)取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取91.3mg万古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分别溶于无菌的pbs溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化万古霉素表面羧基，活化10min；(5)将活化后的万古霉素加入到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子中，孵育6h；(6)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到浓度为2mg/ml万古霉素修饰的磁性纳米粒子。

c.聚乙二醇-磁性纳米粒子组

将1mg制备好的聚乙二醇-磁性纳米粒子加入到含蜡样芽孢杆菌离心管中，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min。最后，将离心管插入常规磁力架分离6min。

所述万古霉素修饰的磁性纳米粒子制备：取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml无菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性纳米粒子溶液中，反应3h，然后无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子，得到浓度为2mg/ml的聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，用于富集蜡样芽孢杆菌。

各组捕获率如下：

实验结果表明，万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子组的捕获效率明显高于万古霉素修饰的磁性纳米粒子组捕获效率，这说明聚乙二醇作为分子臂增加了万古霉素与目标菌的结合机会，使得目标菌的表面结合了更多的纳米粒子，因此，在短时间内就能分离富集较多的目标菌。聚乙二醇-磁性纳米粒子组的捕获效率很低，说明其对目标菌的非特异性很低，从而说明用万古霉素分子来捕获目标菌具有良好的效果。

实施例3

将无菌肉类粉碎，按常规方式制成待测样品溶液，加入蜡样芽孢杆菌调节菌液浓度至10⁵cfu/ml备用。

将制备好万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子(1mg)分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以200rpm/min的转速室温孵育45min。然后常规磁力架分离6min。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有蜡样芽孢杆菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物则用无菌pbs溶液清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬蜡样芽孢杆菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。结果见表1，表明本方案能高效富集分离样品中的蜡样芽孢杆菌。

实施例4

无菌牛奶为样品待测样品溶液，加入蜡样芽孢杆菌调节菌液浓度至10⁵cfu/ml。其余同实施例3。

实施例5

无菌蔬菜粉碎，按常规方式制成待测样品溶液，加入蜡样芽孢杆菌调节菌液浓度至10⁵cfu/ml。

实施例6

待测样品为无菌全血，加入蜡样芽孢杆菌调节菌落浓度至10⁵cfu/ml。其余同实施例4。

表1不同实际样品中蜡样芽孢杆菌分离效果的比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。