FITC标记的维生素B12衍生物及其合成方法与应用与流程

文档序号:11191637阅读:1746来源:国知局
FITC标记的维生素B12衍生物及其合成方法与应用与流程

本发明涉及一种维生素b12衍生物,特别是涉及一种新型的荧光标记的维生素b12衍生物,简称为vb12-fitc,以及该衍生物的合成方法以及应用。



背景技术:

维生素b12,又称甲钴胺,是一种人体必需的水溶性维生素,无法在体内自身合成,仅能通过食物摄入,并储存于肝脏中。在人体缺乏持续补充外源性维生素b12的情况下,肝脏中储存的维生素b12总量在3-6个月内即被消耗殆尽。在人体细胞代谢的甲基化、维护神经髓鞘的代谢与功能、促进红细胞的发育与成熟、参与脱氧核酸(dna)的合成、脂肪及碳水化合物的代谢、核酸与蛋白质的合成等多个重要环节,均离不开维生素b12的参与。随着维生素b12的缺乏,最终导致恶性贫血、不可逆性神经病变等并发症。

维生素作为参与一碳基团代谢的辅酶,与核酸和蛋白质的合成密切相关。细胞的增殖和发育过程中,核酸和蛋白质的合成显著加快,因而在快速增殖组织——肿瘤病灶中,针对维生素b12受体数目显著上调,表现出对维生素摄取的显著增加,因而肿瘤对vb12有高摄取现象。这一特性使维生素b12本身具有一定的肿瘤靶向性,在肿瘤吸收代谢途径、肿瘤显像治疗等方面的研究,维生素b12一定意义。

维生素b12的正常吸收代谢、肿瘤代谢特点日益得到关注,其吸收代谢途径、及该途径下新型靶向给药,是近年关注研究热点,所以维生素b12的显像、可视化显得尤为重要。目前vb12的显像标记,主要通过放射性核素co+、111in、10b、99mtc或正电子cu+标记等途径来实现,该类方法需要特殊显像设备、成本高、操作难度大,另外放射性核素、正电子对人体均有放射性的损害。荧光显像是目前相对安全、成本低廉、无需借助超大型仪器、操作简便的显像方法,在维生素b12吸收研究中若能通过荧光标识,可极大降低操作的难度及成本。

然而,维生素b12结构上可反应基团少,难以直接与荧光剂直接反应结合,必须先在本结构上增加一个“桥梁”,可同时与vb12、荧光剂结合,进而完成维生素b12的荧光标记。但维生素b12本身结构不稳定,见光、遇热易分解,在剧烈反应条件下则有降解的可能,因此维生素b12荧光标记有很大难度。本发明通过偶联二氨基化合物,将维生素b12结构上的-oh转化成反应活性更高的氨基,在室温下再与fitc的异硫氰酸根反应,从而实现在温和条件下制备fitc荧光标记vb12。



技术实现要素:

本发明的第一个目的在于提供一种fitc标记的维生素b12衍生物,所构建的荧光标记的vb12在维持vb12原有结构的前提下,常温下活化其低反应活性基团,从而解决了目前核素、正电子标记的维生素b12显像存在成本高、操作难度大等难题。

本发明所述的fitc标记的维生素b12衍生物(vb12-fitc),具有如下的分子结构式:

本发明的第二个目的是提供所述的fitc标记的维生素b12衍生物的制备方法。

本发明所述的vb12-fitc的制备方法包括:在vb12结构的低反应活性-oh基团上,偶联双氨基,进而与fitc的异硫氰酸根反应,合成vb12-fitc衍生物。

在一个优选实施例中,本发明所述的vb12-fitc的制备方法包括以下步骤:

(a)维生素b12的氨基化:在惰性气体气保护下,将维生素b12溶解于经除水处理的二甲基亚砜(dmso)中,按照1:1-1:2比例加入活化剂n,n'-羰基二咪唑(cdi),20-25℃下避光活化6-12小时,按照1:2-1:5比例加入二氨基化合物,继续在20-25℃下反应3-12小时;沉淀并分离反应产物,20-25℃下干燥得到氨基化的维生素b12;

(b)fitc与氨基化维生素b12的偶联:将步骤a中反应得到的氨基化维生素b12溶解于经除水处理的二甲基亚砜(dmso),按照1:1-1:2比例加入催化剂三乙胺,按照1:1.5比例加入异硫氰酸荧光素(fitc),20-25℃下避光反应4-12小时,沉淀并分离反应产物,20-25℃下干燥得到fitc标记的维生素b12。

根据本发明所述的vb12-fitc的制备方法的进一步特征,所述步骤a中选用的二氨基化合物为1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷。

根据本发明所述的vb12-fitc的制备方法的进一步特征,所述步骤a和b中,在沉淀时加入丙酮作为沉淀剂。

根据本发明所述的vb12-fitc的制备方法的进一步特征,所述步骤a和b中,在分离反应产物时,采用离心机在10000r/min条件下离心10min,除去未反应的化合物。

根据本发明所述的vb12-fitc的制备方法的进一步特征,所述步骤a和b中,所述干燥是真空干燥。

本发明第三个目的在于提供所述的vb12-fitc的应用,也就是所述的vb12-fitc在制备诊断和监测vb12吸收代谢途径以及肿瘤中的显像治疗剂中的应用。

基于本发明所述的vb12-fitc所制备的显像治疗剂在评估vb12-fitc衍生物在诊断和监测vb12吸收代谢新途径以及肿瘤中具有良好的应用前景。

本发明具有如下有益效果:

(1)本发明所提供的fitc标记的维生素b12的制备条件温和(可在常温下进行),原料低毒,操作方法简便,合成效率高,反应产物性质稳定,具有良好的荧光显像效果;

(2)本发明所提供的fitc标记的维生素b12具有肿瘤摄取靶向性,在vb12吸收代谢途径、肿瘤显像治疗等方面的研究具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明所述的fitc标记维生素b12的1hmr质谱图。

图2是本发明所述的fitc标记维生素b12的hplc图。

图3是本发明所述的fitc标记维生素b12的流式分析结果图。

图4是本发明所述的fitc标记维生素b12的共聚焦显微镜结果图。

图5是本发明所述的fitc标记维生素b12的在体成像图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。

实施例1:本发明所述的vb12-fitc的制备

(a)氮气保护下将200mg的维生素b12溶解于4ml经除水处理的二甲基亚砜(dmso),加入200mg的活化剂n,n'-羰基二咪唑(cdi),20℃下避光活化12小时,加入400mg二1,8-氨基-3,6-二氧杂辛烷,继续在20℃下反应6小时。用500ml丙酮沉淀反应产物,并在10000r/min条件下离心10min分离反应产物,20℃下真空干燥得到氨基化的维生素b12。

(b)将步骤a得到的氨基化维生素b12,称取150ng溶解于4ml经除水处理的二甲基亚砜(dmso),加入0.1ml的催化剂三乙胺,按照1:1比例加入fitc,20℃下避光反应6小时,沉淀并分离反应产物,20℃下真空干燥得到fitc标记的维生素b12。

实施例2:本发明所述的vb12-fitc的制备

(a)氮气保护下将200mg的维生素b12溶解于4ml经除水处理的二甲基亚砜(dmso),加入300mg的活化剂n,n'-羰基二咪唑(cdi),22℃下避光活化12小时,加入600mg的1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷,继续在22℃下反应6小时。用500ml丙酮沉淀反应产物,并在10000r/min条件下离心10min分离反应产物,22℃下真空干燥得到氨基化的维生素b12。

(b)将步骤a得到的氨基化维生素b12,称取150ng溶解于4ml经除水处理的二甲基亚砜(dmso),加入0.1ml的催化剂三乙胺,按照1:1.25比例加入fitc,22℃下避光反应6小时,沉淀并分离反应产物,22℃下真空干燥得到fitc标记的维生素b12。

实施例3:本发明所述的vb12-fitc的制备

(a)氮气保护下将200mg的维生素b12溶解于4ml经除水处理的二甲基亚砜(dmso),加入400mg的活化剂n,n'-羰基二咪唑(cdi),25℃下避光活化12小时,加入800mg二1,8-氨基-3,6-二氧杂辛烷,继续在25℃下反应6小时。用500ml丙酮沉淀反应产物,并在10000r/min条件下离心10min分离反应产物,20℃下真空干燥得到氨基化的维生素b12。

(b)将步骤a得到的氨基化维生素b12,称取150ng溶解于4ml经除水处理的二甲基亚砜(dmso),加入0.1ml的催化剂三乙胺,按照1:1.5比例加入fitc,25℃下避光反应6小时,沉淀并分离反应产物,20℃下真空干燥得到fitc标记的维生素b12。

实施例4:本发明所述的vb12-fitc的分析

(1)vb12-fitc的合成验证:利用高效液相色谱仪(hplc)、质谱分析仪,分别检测vb12、fitc各自的波谱、分子量,验证vb2-fitc的偶联。

(2)vb12-fitc的肿瘤吸收流式分析:培养胃癌细胞(ags)至70-80%的密度,加入vb12-fitc,共孵育4h后,pbs重悬两次后,使用流式细胞仪检测细胞对荧光标记维生素b12的吸收率。

(3)vb12-fitc的肿瘤吸收显像:在共聚焦皿中培养胃癌细胞(ags)至70-80%的密度,加入vb12-fitc,在不同时间段固定细胞,用dapi染细胞核,并用激光共聚焦观察vb12-fitc的吸收部位及吸收量。

(4)vb12-fitc的在体肿瘤显像:利用慢病毒转染技术,在胃癌细胞(ags)中稳定转入表达红光载体片段,进而扩大培养细胞。取1×107细胞,注射入裸鼠皮下,构建胃癌裸鼠模型。在尾静脉注射vb12-fitc前后,分别用活体成像仪观察vb12的肿瘤靶向性。

质谱分析结果如图1所示:fitc标记的维生素b12,经过离子化后带上二价电荷,出现不同质荷比的离子碎片(1007.41、1020.92,1034.42丰度最高)是因为fitc标记的维生素b12分子结构比较复杂,离子化过程带上不同数量的正离子(na+、k+或h+),如1034的离子碎片带上了两个钾离子、三个钾离子和3个氢离子:1034×2-1918(fitc-vb12)=39(k+)×2+23(na+)×3+3×1(h+)。

高效液相色谱法分析如图2所示:用荧光检测器fld,采用fitc的激发波长490nm,发射波长为520nm,从高效液相的流出曲线看,fitc修饰vb12后,分子极性发生变化,相比fitc,更快流出柱子,fitc-vb12的流出时间为15.1min,fitc的流出时间为16.8min。从fitc-vb12的流出曲线看,没反应的fitc的残留非常少,说明标记效率较高。

流式分析结果如图3所示:ags在fitc通道有90.9%的阳性率,这提示ags胃癌细胞对vb12-fitc有高度摄取能力。

共聚焦显微镜结果如图4所示:随着时间增加,fitc标记维生素b12的胃癌细胞的吸收量逐渐增加。

活体成像结果如图5所示:在胃癌裸鼠模型中,fitc标记维生素b12在肿瘤部位高度聚集。

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