一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法与流程

本发明涉及基因工程及微生物发酵，尤其是涉及一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法。

背景技术：

糖基转移酶(glycosyltransferases,Gtfs)是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的一类酶，主要负责将活性供体的单糖转移到糖、蛋白质、脂质以及核酸分子上，完成糖基化反应。已有研究表明糖基转移酶基因(epsB)是多糖生物合成过程中的重要基因，作用是参与多糖重复单元的聚合并决定多糖的链长(J Bacteriol,2003,185(20):6057-6066；Microbiology-Uk,1997,143:2395-2405)。

微生物絮凝剂(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能够使悬浮液中的固体颗粒、菌体、细胞和胶状物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有安全、高效、可生物降解和对环境无污染等优势，且能产生絮凝剂的微生物种类多、生长快、易于采用工程手段而实现产业化。因此微生物絮凝剂的开发前景十分看好。目前，多糖生物絮凝剂已经应用于去除纺织印染废水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，还可以去除工业废水中的重金属离子和其它悬浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝剂产量低、成本较高，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响多糖絮凝剂合成的报道已经很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而从地衣芽孢杆菌的遗传及生理学角度对其多糖絮凝剂合成量影响的报道甚是少见。由于多糖絮凝剂结构复杂，且大多数针对多糖的研究并不关注絮凝活性，所以有关多糖絮凝剂代谢途径的研究还较少，而通过分子生物学技术改造菌株提高多糖絮凝剂产量的报道几乎没有。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高多糖絮凝剂活性及产量，具有重要的经济价值及社会意义。

本申请人在中国专利200910111262.4提供了地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于要解决的技术问题是针对现有技术中多糖絮凝剂絮凝活性不高、调控机理不明等问题，提供糖基转移酶基因epsB。

本发明的第二目的在于提供一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法。

本发明的第三目的在于提供过表达糖基转移酶基因的工程菌在制备多糖絮凝剂中的应用。

所述糖基转移酶基因epsB利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述糖基转移酶基因epsB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

所述过表达糖基转移酶基因的工程菌是将糖基转移酶基因epsB片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，通过抗性筛选获得过表达糖基转移酶基因的工程菌。所述表达载体为游离载体，优选表达载体为PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

所述过表达糖基转移酶基因的工程菌的构建方法包括以下步骤：

1)设计PCR引物扩增糖基转移酶基因epsB；

2)将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到PHY300-epsB过表达质粒；

3)然后将PHY300-epsB过表达质粒导入到E.coli DH5α中，以备扩增后电转化；

4)将经提取、浓缩后的PHY300-epsB过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；

5)转化子经质粒提取后，利用PCR和双酶切进行验证，从而获得过表达糖基转移酶基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-4。

所述表达糖基转移酶基因的工程菌可在制备多糖絮凝剂中应用。

所述表达糖基转移酶基因的工程菌制备多糖絮凝剂的方法包括以下步骤：

1)刮一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-4接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；

2)以4％(V/V)的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验，优选在37℃，200r/min的条件下培养48～56h。

3)将所得发酵液离心收集上清液，将所得上清液用乙醇沉淀法，沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。

在步骤3)中，所述所述乙醇沉淀法的具体步骤可为用三倍体积的乙醇提取，4℃静置12h，离心的速度为6000～8000rpm，离心时间可为10～15min，离心温度可为4℃。

epsB基因是编码一系列糖基转移酶的eps基因簇上的重要基因，在不同底物特异性的糖基转移酶作用下，地衣芽孢杆菌中多糖合成的步骤基本包括：葡萄糖的磷酸化、糖核苷酸的合成和转运、多糖重复单元的合成、修饰、聚合和转运。epsB会参与多糖重复单元的聚合，并决定多糖的链长。基于以上理论分析，过表达epsB基因，能够增大多糖絮凝剂合成途径的代谢流量，有利于提高多糖絮凝剂的产量，降低成本。

本发明的技术效果在于：本发明提供了能提高多糖絮凝剂产量的的基因工程菌的构建方法。该方法包括以下过程：克隆多糖絮凝剂合成途径的关键酶糖基转移酶基因(epsB)，利用大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭质粒构建重组表达载体。通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，通过四环素筛选转化子，然后通过PCR和双酶切对对基因工程菌进行验证(如图1)，从而构建了地衣芽孢杆菌重组菌HN301-4，本发明构建的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-4比出发菌株的多糖絮凝剂活性提高了117.92％，絮凝剂产量提高了13.98％。(如图2)。可望用于多糖絮凝剂的工业化生产，提高产量，降低成本。

附图说明

图1为重组表达质粒PHY300-epsB的PCR和酶切验证结果图，其中泳道1,2:Kpn I单酶切重组质粒PHY300-epsB；泳道3,4：Kpn I和Spe I双酶切重组质粒PHY300-epsB，泳道5,6:PCR扩增epsB。

图2为地衣芽孢杆菌CGMCC 2876及其重组菌HN301-4多糖絮凝剂絮凝活性和产量比较图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅限于说明本发明。

实施例1:重组表达载体PHY300-epsB的构建

设计PCR引物，用于扩增epsB基因片段。

上下游引物分别为：

上游引物：CCGGTACCTTGGCTATTAGAAAAAAAC(下划线为KpnI酶切位点)

下游引物：CCCACTAGTACATGGTTGCGTAATTAT(下划线为SpeI酶切位点)

以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃,1min，步骤(2)～(4)重复35个循环；(5)72℃，10min，4℃保存。

PCR反应体系如表1所示。

表1

将PCR产物和表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，回收后，将PCR产物和表达载体以(3︰1)～(5︰1)的比例用T4DNA连接酶在16℃连接12h构建重组表达载体PHY300-epsB。

实施例2:地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-4的构建

将PHY300-epsB过表达质粒经提取及浓缩后，电击转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用PCR及双酶切进行验证(如图1)。从而获得过表达糖基转移酶基因epsB的地衣芽孢杆菌工程菌HN301-4。

电转化具体步骤如下：

地衣芽孢杆菌感受态的制备：

(1)在50mL LB培养基中接种一环B.licheniformis,37℃，200r/min过夜培养12h；

(2)取过夜培养液1mL接入50mL生长培养基中，于37℃，200r/min培养至对数中后期，直到细胞OD₆₀₀达到0.85～0.95；

(3)细胞冰浴30min，停止生长后，(取预先预冷的50mL干净离心管，加入40mL停止生长的培养液)再于4℃以6 000r/min离心收获细胞；

(4)用冰冷(0℃冰水浴)的EP缓冲液40mL悬浮细胞四次(每次都在0℃冰水浴中晃动，使沉淀悬浮，可用枪轻轻吹吸)，并最终将细胞悬浮于1mL EP缓冲液中,使细胞浓度达到(1～1.3)×10¹⁰CFU/mL；

(5)将感受态细胞分装于1.5mL离心管(预冷过的)中，每管100μL，再直接进行下一步实验或-70℃保存感受态；

地衣芽孢杆菌的电转：

(1)将感受态细胞和1～5μg质粒混合物转移到冰冷的0.1cm间隙的电击池中；

(2)以1800V、5ms脉冲转化；

(3)迅速往电击池中加入1mL复苏培养基，将菌悬液回收到5mL离心管中，于37℃，200r min^-1培养5h；

(4)将菌液涂布在抗性平板上，于37℃培养直到平板上出现菌落。

实施例3:利用地衣芽孢杆菌及其基因工程菌发酵制备多糖絮凝剂

将地衣芽孢杆菌CGMCC 2876出发菌株和实施例2所述基因工程菌接种于液体种子培养基中，37℃，200r/min培养16h，制备种子培养液，以4％(V/V)的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，37℃，200r/min培养，进行发酵产多糖絮凝剂实验。56h后分别测定发酵液絮凝活性及多糖絮凝剂产量(如图2)。epsB基因过表达重组基因工程菌发酵液的最终絮凝活性为5100.5U/mL，比原菌株发酵液最终絮凝活性2340.5U/mL提高117.92％；epsB基因过表达重组基因工程菌多糖絮凝剂的粗提产量为8.56g/L，较原菌株粗提产量7.51g/L提高了13.98％。生物絮凝剂的絮凝活性可采用以下方法测定:

称取高岭土粉末0.2g与50mL刻度试管中，依次加入2.5mLCaCl₂溶液(10g/L)和1mL待测液，蒸馏水加至与刻度线平齐。充分混合后，迅速置于比色皿中，静置5min后，用紫外可见分光光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水做空白测定。计算公式如下:

絮凝活性(U/mL)＝(B-A)/B×100×D

式中，A：待测样品的OD₅₅₀值，B：空白培养基的OD₅₅₀值，D：发酵液稀释倍数。

生物絮凝剂的提取纯化方法：

(1)取10mL发酵液8000rpm离心5min，除菌体，收集上清液，重复操作两次。

(2)上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h。

(3)8000rpm离心10min，弃上清液，加10mL去离子水溶解。上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h后，离心弃上清液。

(4)冷冻真空干燥。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> Bacillus Licheniformis

<400> 1

ttggctatta gaaaaaaacg ctctcgcaaa tatcaatcgg cgcttgtcgc attgcatcag 60

ccgaatgcgc cgatcgtcga acaataccgg acgatcagga ccaacattga gttctcatcc 120

tttgagaagc cgtttaaatc attgctcatc acatcgggcc tcccgggaga gggcaaatca 180

ttctcggctt caaacttggc ggtcgtattt tcgcaacagg aaaaaaaggt ccttctgatc 240

gacgcggatt taagaaagcc gacgattcac aaaatttttg agctcgataa tcattccggc 300

gtcacaaatg tattgatgaa aaaaacgacg ctggaaaatg tcgtgcagca aagcccggcg 360

gaaaatctcc atgtgctgac aagcggtccg attcctccga atccgtccga gttgttgtcg 420

tcgcaggcga tggaggatct gcttgctgaa gcgtacaacc agtacgattt agtcatcctt 480

gattcaccgc cgctattgcc ggtcgcagac gcgcaaatat tggcgaacca agtggatgga 540

agcatccttg tcatcctcag cggaaaaaca aagcttgata acgcgatcaa gtcgcgggac 600

gcgctgaatt cttcaaaaag cgaactgctc ggcgccgtgt tgaacgggcg gaaagtgaag 660

aaggcgcgtc agtataatta cgcaaccatg taa 693

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 上游序列

<400> 2

ccggtacctt ggctattaga aaaaaac 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 下游序列

<400> 3

cccactagta catggttgcg taattat 27