一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法与流程

文档序号:15457414发布日期:2018-09-15 01:29
本发明涉及生物
技术领域
,具体涉及通过对非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理从而将人和动物的非神经元细胞转化为功能性神经元的方法。
背景技术
:调控细胞命运,从而产生具有不同功能的特定细胞类型,在细胞替代治疗和再生治疗中具有重要应用前景。细胞命运取决于基因组的特异性表达,而表达调控方式既包括常见的生物学调控,如信号转导、转录调控网络、表观遗传修饰等,也受细胞的理化特性以及细胞所处环境中的理化因素的调控。因此细胞命运转变的方法也分为两种,即改变细胞的生物学特性和理化特性。目前通过调控细胞命运产生功能细胞的方法主要是针对若干重要基因调控通路和表观遗传修饰,通过遗传学手段或者化学小分子处理手段来完成。遗传学手段包括研究人员利用异位表达Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等转录因子将小鼠和人的成纤维体细胞重编程为诱导多能性干细胞;利用异位表达Adcl1、Brn2和Myt1l等转录因子将成纤维细胞转分化为功能性神经元;以及利用异位表达特定基因的方式获得具有功能的心肌细胞、胰岛细胞等。化学小分子手段包括研究人员利用化学小分子组合VC6TFZ将小鼠成纤维细胞重编程为多能性干细胞;利用7种小分子组成的组合(VCRFSGY)将人的成纤维细胞直接转化为神经元;利用9种小分子的组合M9将小鼠成纤维细胞重编程为神经干细胞,进而分化为功能性神经元;利用小分子组合将人胃上皮细胞转变成多潜能的内胚层祖细胞;利用小分子组合将将人的成纤维通过小分子转化为心肌细胞等。技术实现要素:本发明主要通过对非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理,从而实现对细胞命运进行调控,特别地,在将人或动物的非神经元细胞转分化为神经元细胞的方面提出了更为简便易行的途径,取得了开创性的、预料不到的技术效果。本发明提供了一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法,其特征在于所述方法包括对非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理。本发明的干扰处理选自以下的至少一种:采用细胞骨架蛋白抑制剂进行处理,采用小干扰RNA(siRNA)对胞外基质-骨架系统的基因表达进行敲低处理,对胞外基质进行低粘附处理并优选进一步定向培养。根据本发明的一个实施方式,其中所述细胞骨架蛋白抑制剂选自以下的至少一种:肌球蛋白(myosin)抑制剂、肌动蛋白(actin)组装抑制剂。优选地,其中所述肌球蛋白(myosin)抑制剂选自以下的至少一种:(-)-Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7,浓度为10μM以上,优选20μM以上,更优选10-30μM,其中所述浓度为所述抑制剂在处理非神经元细胞所用诱导培养基中的最终浓度。优选地,其中所述肌动蛋白(actin)组装抑制剂选自以下的至少一种:CytochalasinB、LatrunculinB,其中CytochalasinB的浓度为1.5μM以上,优选2μM以上,更优选2-3μM,LatrunculinB浓度为0.15μM以上,优选0.2μM,更优选0.2-0.3μM,其中所述浓度为所述抑制剂在处理非神经元细胞所用诱导培养基中的最终浓度。根据本发明的一个实施方式,所述方法包括将非神经元细胞置于诱导培养基中培养3-7天,任选地4天、5天或6天,然后采用成熟培养基培养7-14天,任选地8天、9天、10天、11天、12天或13天。优选地,其中所述诱导培养基包含:细胞骨架蛋白抑制剂、N2细胞培养基添加剂,B27细胞培养基添加剂,谷氨酰胺,β巯基乙醇。优选地,其中所述成熟培养基包含:N2细胞培养基添加剂,B27细胞培养基添加剂,谷氨酰胺,β巯基乙醇,神经营养素(NT3),脑源性神经营养因子(BDNF),胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF),二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。根据本发明的一个实施方式,本发明中非神经元细胞优选为成纤维细胞和/或神经胶质细胞。本发明还提供了细胞骨架蛋白抑制剂用于将非神经元细胞转分化为神经元细胞的用途。本发明还提供了一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的试剂盒,所述试剂盒包括诱导培养基,所述诱导培养基包含细胞骨架蛋白抑制剂。根据本发明的一个实施方式,其中所述细胞骨架蛋白抑制剂选自以下的至少一种:肌球蛋白(myosin)抑制剂、肌动蛋白(actin)组装抑制剂。优选地,其中所述肌球蛋白(myosin)抑制剂选自以下的至少一种:(-)-Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7,浓度为10μM以上,优选20μM以上,更优选10-30μM,其中所述浓度为所述抑制剂在诱导培养基中的浓度。优选地,其中所述肌动蛋白(actin)组装抑制剂选自以下的至少一种:CytochalasinB、LatrunculinB,其中CytochalasinB的浓度为1.5μM以上,优选2μM以上,更优选2-3μM,LatrunculinB浓度为0.15μM以上,优选0.2μM,更优选0.2-0.3μM,其中所述浓度为所述抑制剂在诱导培养基中的浓度。根据本发明的一个实施方式,所述试剂盒还包括成熟培养基。优选地,其中所述诱导培养基包含:细胞骨架蛋白抑制剂、N2细胞培养基添加剂,B27细胞培养基添加剂,谷氨酰胺,β巯基乙醇。优选地,其中所述成熟培养基包含:N2细胞培养基添加剂,B27细胞培养基添加剂,谷氨酰胺,β巯基乙醇,神经营养素(NT3),脑源性神经营养因子(BDNF),胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF),二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。本发明还提供了细胞骨架蛋白抑制剂用于制备抗肿瘤药物、组织再生和/或修复药物中的用途。根据本发明的一个实施方式,本发明的敲低处理包括以下的至少一种:采用与序列SEQIDNO:1具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的rock1基因表达,采用与序列SEQIDNO:2具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的rock2基因表达,采用与序列SEQIDNO:3具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc1基因表达,采用与序列SEQIDNO:4具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc2基因表达,采用与序列SEQIDNO:5具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc3基因表达,采用与序列SEQIDNO:6具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh9基因表达,采用与序列SEQIDNO:7具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh10基因表达,采用与序列SEQIDNO:8具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrckα基因表达,采用与序列SEQIDNO:9具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrckβ基因表达,采用与序列SEQIDNO:10具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的lamina/c基因表达,采用与序列SEQIDNO:11具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的lmnb1基因表达,采用与序列SEQIDNO:12具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的lbr基因表达,采用与序列SEQIDNO:13具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的sun1基因表达,采用与序列SEQIDNO:14具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的sun2基因表达,采用与序列SEQIDNO:15具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的cbx1基因表达,采用与序列SEQIDNO:16具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的cbx3基因表达,采用与序列SEQIDNO:17具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的cbx5基因表达,采用与序列SEQIDNO:18具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的banf1基因表达,采用与序列SEQIDNO:19具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的syne1基因表达,采用与序列SEQIDNO:20具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的syne2基因表达,采用与序列SEQIDNO:21具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的β-actin基因表达。根据本发明的一个实施方式,采用与序列SEQIDNO:1具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的rock1基因表达,采用与序列SEQIDNO:2具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的rock2基因表达,采用与序列SEQIDNO:8具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrckα基因表达,以及采用与序列SEQIDNO:9具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrckβ基因表达。根据本发明的一个实施方式,采用与序列SEQIDNO:3具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc1基因表达,采用与序列SEQIDNO:4具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc2基因表达,以及采用与序列SEQIDNO:5具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc3基因表达。根据本发明的一个实施方式,采用与序列SEQIDNO:6具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh9基因表达,以及采用与序列SEQIDNO:7具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh10基因表达。根据本发明的一个实施方式,采用与序列SEQIDNO:3具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc1基因表达,采用与序列SEQIDNO:4具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc2基因表达,采用与序列SEQIDNO:5具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc3基因表达,以及采用与序列SEQIDNO:6具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh9基因表达。根据本发明的一个实施方式,采用与序列SEQIDNO:13具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的sun1基因表达,以及采用与序列SEQIDNO:14具有95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的sun2基因表达。根据本发明的一个实施方式,本发明的敲低处理包括如下步骤:将稀释的脂质体与本发明的siRNA混和,室温培养以形成siRNA-脂质体混和物;将所述混合物与含有非神经元细胞的培养液混和均匀进行转染、培养。优选地,脂质体采用RNAiMAXReagent试剂。优选地,在脂质体与siRNA混合之前,进行稀释siRNA。优选地,稀释脂质体和siRNA,采用无血清Opti-MEM培养基。优选地,稀释siRNA:在无RNA酶的EP管,用100μL/每孔的无血清Opti-MEM培养基稀释12pmolsiRNA双链(2.5ul)。优选地,稀释转染试剂RNAiMAXReagent:在无RNA酶的EP管,用100μL/每孔of无血清Opti-MEM培养基稀释RNAiMAXReagent。优选地,稀释好的脂质体经过1-5min,优选2min,优选3min,优选4min的孵育后,与上述稀释好的siRNA混和,室温培养15-25min,优选20min,以形成siRNA-脂质体混和物。优选地,将siRNA-脂质体混和物加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中使之混和。优选地,将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养,转染隔6-8小时,优选7小时,后换成神经元培养液。优选地,神经元培养液培养48-72小时后,优选60小时。优选地,神经元培养液包含:N2细胞培养基添加剂,B27细胞培养基添加剂,谷氨酰胺,β巯基乙醇。优选地,神经元培养液包含:N2细胞培养基添加剂,B27细胞培养基添加剂,谷氨酰胺,β巯基乙醇,神经营养素(NT3),脑源性神经营养因子(BDNF),胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF),二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。根据本发明的一个实施方式,低粘附处理包括采用琼脂糖DMEM悬浮培养非神经元细胞。优选地,悬浮培养时间为6-8天,优选地7天。优选地,所述琼脂糖的用量为0.5g/100毫升所述琼脂糖DMEM。优选地,首先用无菌双蒸水配置1%琼脂糖溶液,微波炉加热至沸腾,随后加入等体积的2×DMEM,(Gibco,12800-017)制成溶于DMEM中的0.5%的琼脂糖溶液,然后倒入6cm的培养皿中,冷却凝固后备用。优选地,悬浮培养过程期间隔天半量换液。优选地,非神经元细胞采用琼脂糖DMEM悬浮培养后,再采用定向分化培养液培养。优选地,所述定向分化培养液包含GDNF(神经胶质细胞源性的神经营养因子,peprotech,450-10)、BDNF(脑源性神经营养因子,peprotech,450-02)、NT3(神经营养因子-3,peprotech,450-03)和Forskolin(毛喉素,stemgent,04-0025)。优选地,所述定向分化培养液中GDNF(peprotech,450-10)浓度为15-25ng/ml,优选20ng/ml,BDNF(peprotech,450-02)浓度为15-25ng/ml,优选20ng/ml,NT3(peprotech,450-03)浓度为15-25ng/ml,优选20ng/ml,4ng/ml的Forskolin(stemgent,04-0025)浓度为2-6ng/ml,优选3、4或5ng/ml。根据本发明,通过采用细胞骨架蛋白的小分子抑制剂、siRNA敲低处理、低粘附处理干扰非神经元细胞的胞外基质-骨架系统,可高效地将人或动物非神经元细胞转变成为神经元细胞。通过本发明的方法实现细胞命运改变从而获得神经元尚未有所报道,同时相比之前报道的细胞命运调控方法,本方法应用更为简单,只需单个小分子处理,或者不需要小分子及特定基因表达调控,仅通过改变细胞培养基质即可实现细胞命运改变,并且在体内体外均可高效进行,在肿瘤治疗、组织再生/修复中具有重大应用。本发明的方法具有广谱抗肿瘤活性的作用。比如,胶质瘤是一种发生于神经外胚层的肿瘤,大多数起源于不同类型的神经胶质细胞。据统计脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,占所有颅内肿瘤的百分之四十五左右。在儿童恶性肿瘤中排名第二位,近年来,原发性的恶性颅内肿瘤发生率逐年递增,每年增长率约为1.2%,在中老年人群尤为明显。据文献报道,在中国脑胶质瘤平均每年发病率为每10万人有3-6人,年死亡人数高达3万人。目前国内外对胶质瘤的治疗手段主要包括:手术、化疗、放疗、X刀和γ刀等。基于本发明,可以将细胞骨架蛋白的小分子抑制剂用于制备抗胶质瘤的药物。通过采用这种药物,能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖,从而达到抗癌效果。生理衰老或病例脑损伤导致大量神经元死亡,导致神经胶质细胞(主要为星形胶质细胞)的大量增殖,占据原有脑损伤区域,抑制神经元的再生,形成脑内胶质疤痕,引起神经退行性疾病,严重影响人的生活质量,如帕金森、艾尔海默症等。尽管人们尝试大量的方法,目前仍然没有简单而有效的方法控制胶质疤痕的产生,促进神经元再生修复。本发明利用细胞骨架蛋白抑制剂能高效地将人来源的原代星形胶质细胞高效的转分化为神经元。这为在体治疗衰老和病理损伤导致神经退行性疾病提供一种新的方法。本发明的特点在于:1.操作简单,单一的小分子加入诱导培养液或单因素处理即可进行命运转换。2.高效快速,在myosin抑制剂/actin组装抑制剂处理非神经元细胞向神经元转分化过程中,在第7天就可获得接近100%的Tuj1阳性的神经元命运的细胞,悬浮培养液仅需7天时间即可实现非神经元细胞向神经元的转化。3.普适性,该方法在不同物种的不同类型起始细胞向神经元转分化过程中具有普遍适应性,可以将小鼠TTF、MEF、setoli和人的背皮成纤维细胞、包皮成纤维细胞和肌肉细胞高效地转分化为神经元。4.安全性,本发明的方法相比于传统的病毒载体介导的遗传学手段具有更高的安全性。5.可控性,单个小分子的缓释系统相比于多个小分子组合介导的转分化更具有可行性,便于计量控制。附图说明图1A为成人包皮成纤维细胞(HFF20y,北京干细胞库)的显微照片(左)和Tuj1免疫荧光染色图片(右)。图1B为实施例1-1中针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后细胞的显微照片(左)和Tuj1免疫荧光染色图片(右)。图1C显示了实施例1-1中针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的表达成熟神经元的Marker:Map2(santacruzbiotechnology,sc-20172)、NF200(Abcam,ab4680)和NeuN(chemicon,MAB377)。图1D显示了实施例1-1中针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的表达成熟的神经元表达经典的突触前标记蛋白Syn1(millipore,AB1543P)和Syt1(abcam,ab133856)及突触后标记蛋白PSD95(abcam,ab18258)。图1E为实施例1-1中针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的成熟的神经元膜片钳实验结果图。图1F显示了实施例1-1中针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的神经元进行类型标记蛋白染色表达GABA能神经元标记蛋白GABA(sigma,SAB4501067),GAD65/67(santacruzbiotechnology,sc-7513)。图1G显示了实施例1-1中针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的神经元表达中脑多巴胺能的标记物TH(santacruzbiotechnology,sc-14007)和谷氨酸能标记物vGlut1(santacruzbiotechnology,sc-377425)。图1H显示了实施例1-1中超高效液相-超高分辨率质谱检测测得诱导GABA神经元响应高钾缓冲液处理释放γ氨基丁酸结果图。图2A为实施例1-3中小鼠尾尖成纤维细胞未处理前神经元标记蛋白Tuj1和Map2染色图片。图2B为实施例1-3中针对小鼠尾尖成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后表达神经元的Marker:Tuj1、Map2、NF200和NeuN。图2C为实施例1-3中针对小鼠尾尖成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后成熟的神经元膜片钳实验结果图。图3A为实施例2中采用不含任何抑制剂的DMSO培养基培养7天后的细胞形态显微照片。图3B为实施例2中采用含有0.4μMCytochalasinB的培养基培养7天后的细胞形态显微照片。图3C为实施例2中采用含有2μMCytochalasinB的培养基培养3天后的细胞形态显微照片。图3D为实施例2中采用含有0.2μMLatrunculinB的培养基培养7天后的细胞形态显微照片。图3E为实施例2中采用含有2μMCytochalasinB的培养基培养7天后,又采用神经元成熟培养基培养10天后的细胞神经元表达神经元标记蛋白Map2与采用对照的DMSO的对比图。图4A显示实施例3中采用含有(-)-Blebbistatin处理相比于对照组DMSO处理胶质瘤细胞在第3天神经元形态的变化对比图。图4B显示了实施例3的抗肿瘤药物对胶质瘤细胞U87和U251抑制效果对比图。图4C显示了实施例3的抗肿瘤药物与对照组DMSO对胶质瘤细胞U87处理后细胞表达神经元标记蛋白Tuj1情况。图5A为实施例4中部分靶点敲低后第7天的细胞形态变化图。图5B为实施例4中部分靶点敲低后第7天细胞Tuj1免疫荧光染色结果图。图6A为实施例5中成纤维细胞经神经干细胞培养液悬浮培养7天后光镜照片。图6B为实施例5中成纤维细胞经神经干细胞培养液悬浮培养7天后的免疫荧光染色图。图6C为实施例5中成纤维细胞经神经干细胞培养液悬浮培养7天后,再经随机分化培养液培养7天后的免疫荧光染色图。图6D为实施例5中成纤维细胞经神经干细胞培养液悬浮培养7天后,再经定向分化培养液培养7天后的免疫荧光染色图。图7A原代星形胶质细胞形态(左图)及表达星形胶质细胞的标记蛋白GFAP(右图)。图7B为实施例6中(-)-Blebbistatin诱导星形胶质细胞13天的形态图。图7C为实施例6中(-)-Blebbistatin诱导星形胶质细胞20天,表达经典神经元标记蛋白Tuj1图。具体实施方式所述实施方式以及以下实施例是用于示例目的,且无意于限制请求保护的范围。有关本发明所述组合物的其它修饰、用途或组合对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的,而不脱离请求保护的主题的精神和范围。实施例1-1以12孔板为例(corning,3335)每孔用20ug/ml纤连蛋白溶液(millipore,fc010)1×PBS配制,包被6小时,或先用0.1mg/ml多聚赖氨酸溶液(sigma,P6407)无菌水配制,包被培养皿2小时,无菌水洗三次,再用10μg/ml层粘连蛋白溶液(sigma,L6274)1×PBS配制,包被6小时。去掉包被液用1×PBS冲液洗一遍。去掉洗液,将成人包皮成纤维细胞(HFF20y,北京干细胞库)均匀种于每一个孔,每孔1×104个细胞,用基础培养液(高糖DMEM(Gibco,C12430500BT),1×丙酮酸钠(100×,gibco,11360-070),1×非必须氨基酸(100×,Gibco,11140-050),双抗)加10%胎牛血清(Gibco,16000-044)培养24小时。去除培养液,PBS洗一遍。选用本发明的细胞转化试剂盒,所述试剂盒包括如下的诱导培养基和成熟培养基。将经上述处理后的成纤维细胞加入神经元诱导培养基(N2B27培养液:DMEM/F12(gibco,10565018)与Neurobasal(Gibco,21103-049)1比1混合,加入N2添加剂(100×,Gibco,17502048),B27添加剂(50×,Gibco,17504044),2%牛血清蛋白(1000×,sigma,A8022),β-巯基乙醇(1000×,Gibco,21985023),Glutamax(200×,Gibco,35050-061),1μg/ml胰岛素(Roche,11376497001),双抗)。加入myosin抑制剂(-)-Blebbistatin(二甲基亚砜溶解(sigma,D2650)的100mM浓储,-20摄氏度避光保存1月),(-)-Blebbistatin在诱导培养基中的终浓度为15-30μM。培养3-7天,培养的细胞有明显神经元形态,大的胞体和长的轴突等及神经元命运标记物Tuj1染色,并统计Tuj1阳性率(Tuj1阳性细胞/细胞核比值)。将经过上述诱导培养基培养的细胞加入神经元成熟培养基(N2B27培养基,100μMN6,2′-O-二丁酰基腺苷3′,5′-环磷酸钠盐(sigma,D0627),20ng/mlRecombinantHumanNT-3(Peprotech,450-03),20ng/ml脑源性神经营养因子(peprotech,450-02),20ng/ml(peprotech,450-10)神经胶质细胞源性的神经营养因子)成熟培养7-14天。重复上述实验操作,分别处理来自21周、8岁、13岁人的包皮成纤维细胞,人21周背皮成纤维细胞,猴子尾尖成纤维细胞,鼠胎儿成纤维细胞及非增值细胞丝裂霉素C处理的鼠胎儿成纤维细胞,最终所得Tuj1阳性率和MAP2阳性率结果如表1所示。表1由表1所示,采用myosin抑制剂(-)-Blebbistatin诱导成纤维细胞向神经元细胞的转变情况,当其相对于神经元诱导培养基的浓度为15μM时,虽然取得了很好的神经元细胞转化效果,但并未达到最佳;而当采用浓度为20μM-30μM时,神经元细胞转化率达到最高。为了进一步说明myosin抑制剂(-)-Blebbistatin的效果,申请人提供了附图1A-图1H。图1A显示了成人包皮成纤维细胞(HFF20y,北京干细胞库)的细胞形态和Tuj1免疫荧光染色图片。图1B显示了针对图1A的成纤维细胞,采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后的细胞的显微照片(左)和Tuj1免疫荧光染色图片(右)。如该图所示,培养的细胞有明显神经元形态,大的胞体和长的轴突等及神经元命运标记物Tuj1染色,经统计Tuj1阳性率(Tuj1阳性细胞/细胞核比值),Tuj1阳性率接近100%。图1C显示了针对图1A的成纤维细胞采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后,再用神经元成熟培养基培养14天后的表达成熟神经元的Marker:Map2(santacruzbiotechnology,sc-20172)、Nf200(Abcam,ab4680)和NeuN(chemicon,MAB377)。图1D显示了针对图1A的成纤维细胞采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后,再用神经元成熟培养基培养14天后的成熟的神经元表达经典的突触前标记蛋白Syn1(millipore,AB1543P)和Syt1(abcam,ab133856)及突触后标记蛋白PSD95(abcam,ab18258)。图1E显示了针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的成熟的神经元膜片钳实验结果图。其显示细胞具有成熟神经元的钠电流、钾电流并有一定的动作电位的活性。图1F显示了针对图1A的成纤维细胞采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后,再用神经元成熟培养基培养14天后的神经元进行类型标记蛋白染色接近100%表达GABA能的标记蛋白GABA(sigma,SAB4501067),GAD65/67(santacruzbiotechnology,sc-7513)。图1G显示了针对图1A的成纤维细胞采用包含(-)-Blebbistatin的诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的神经元表达中脑多巴胺能的标记物TH(santacruzbiotechnology,sc-14007)和谷氨酸能标记物vGlut1(santacruzbiotechnology,sc-377425)。其显示了该诱导的神经元基本不表达中脑多巴胺能的标记物TH(santacruzbiotechnology,sc-14007)和谷氨酸能标记物vGlut1(santacruzbiotechnology,sc-377425)。图1H显示了超高效液相-超高分辨率质谱检测显示诱导GABA神经元响应高钾缓冲液处理释放γ氨基丁酸。图1B-图1H明显表明,经过本发明所用myosin抑制剂(-)-Blebbistatin处理后的成纤维细胞具有极高的神经元转化效率。实施例1-2采用实施例1-1的实验方法,不同之处在于采用的myosin抑制剂为肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7。分别处理来自20岁HFF(人包皮细胞)P15、21周/8岁/13岁人的包皮成纤维细胞,人21周背皮成纤维细胞,猴子尾尖成纤维细胞,鼠胎儿成纤维细胞及非增值细胞丝裂霉素C处理的鼠胎儿成纤维细胞,最终所得Tuj1阳性率和MAP2阳性率结果如表2所示。表2由表2所示,采用myosin抑制剂肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7诱导成纤维细胞向神经元细胞的转变情况,当其相对于神经元诱导培养基的浓度为15μM时,虽然取得了较好的神经元细胞转化效果,但并未达到最佳;而当采用浓度为20μM-30μM时,神经元细胞转化率达到最高。实施例1-3采用实施例1-1的实验方法,不同之处在于处理对象为小鼠尾尖成纤维细胞。图2A显示了小鼠尾尖成纤维细胞未处理前神经元标记蛋白Tuj1和Map2染色图片。图2B显示了针对小鼠尾尖成纤维细胞采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后表达神经元的Marker:Tuj1、Map2、NF200和NeuN。针对小鼠尾尖成纤维细胞采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后,测得表达Tuj1、Tuj1/Map2和Map2/NeuN阳性率分别为96%、96%、97%。图2C显示了实施例1-3中针对小鼠尾尖成纤维细胞采用包含20μM(-)-Blebbistatin的神经诱导培养基培养7天后,再用成熟培养基培养14天后的细胞具有神经元成熟展现的钠电流、钾电流并有一定的动作电位的活性。本实施例表明经过本发明所用myosin抑制剂(-)-Blebbistatin处理后的小鼠尾尖成纤维细胞能够以高转化率转化为神经元细胞。实施例2采用实施例1-1的实验方法,不同之处在于分别采用actin组装抑制剂2μM细胞松弛素B(CB,sigma,C6762)和0.2μMLatrunculinB(BioVision,2182-1)替换myosin抑制剂分别诱导来自人21周、8岁、13岁人的包皮成纤维细胞,人21周背皮成纤维细胞,猴子尾尖成纤维细胞,鼠胎儿成纤维细胞及非增值细胞丝裂霉素C处理的鼠胎儿成纤维细胞,最终所得Tuj1阳性率和Map2阳性率结果如表3和表4所示。表3由表3所示,采用actin组装抑制剂CytochalasinB诱导成纤维细胞向神经元细胞的转变情况,当其相对于神经元诱导培养基的浓度为1.5μM时,虽然取得了很好的神经元细胞转化效果,但并未达到最佳;而当采用浓度为2μM-3μM时,神经元细胞转化率达到最高。表4由表4所示,采用actin组装抑制剂LatrunculinB作为诱导成纤维细胞向神经元细胞的转变情况,当其相对于神经元诱导培养基的浓度为0.15μM时,虽然取得了很好的神经元细胞转化效果,但并未达到最佳;而当采用浓度为0.2μM和0.3μM时,神经元细胞转化率达到最高。为了进一步说明actin组装抑制剂的效果,申请人提供了附图3A-3E。图3B-3E显示了针对成人包皮成纤维细胞(HFF20y,北京干细胞库),采用包含CytochalasinB和LatrunculinB进行神经诱导的细胞形态。图3A显示了采用不含任何抑制剂的DMSO培养基培养7天后的细胞形态。其中显示被处理的成纤维细胞并未有任何神经元形态产生。图3B显示了采用含有0.4μMCytochalasinB的培养基培养7天后的细胞形态,其中显示被处理的成纤维细胞略有神经元形态的变化。图3C显示了采用含有2μMCytochalasinB的培养基培养3天后的细胞形态,其中显示被处理的成纤维细胞已经有明显神经元形态的变化。图3D显示了采用含有0.2μMLatrunculinB的培养基培养7天后的细胞形态,其中显示被处理的成纤维细胞几乎完全转化位神经元形态。图3E显示了采用含有2μMCytochalasinB的培养基培养7天后,又采用神经元成熟培养基培养10天后的细胞神经元表达神经元标记蛋白Map2,其中显示被处理的细胞明显神经命运形态的改变。实施例3本实施例提供了一种将细胞骨架蛋白抑制剂用于制备抗癌药物的具体实施方式,所述抗癌药物能够将神经胶质瘤细胞转分化为神经元细胞。采用如下试剂配置抗肿瘤药物I:DMEM/F12(gibco,10565018)与Neurobasal(Gibco,21103-049)1比1混合,加入N2添加剂(100×,Gibco,17502048),B27添加剂(50×,Gibco,17504044),2%牛血清蛋白(1000×,sigma,A8022),β-巯基乙醇(1000×,Gibco,21985023),Glutamax(200×,Gibco,35050-061),1μg/ml胰岛素(Roche,11376497001),双抗),以及(-)-Blebbistatin(二甲基亚砜溶解(sigma,D2650)的100mM浓储,-20摄氏度避光保存1月)。调节(-)-Blebbistatin浓度相对于整个药物I为20μM。采用如下试剂配置抗肿瘤药物II:基于抗肿瘤药物I配制100μMN6,2′-O-二丁酰基腺苷3′,5′-环磷酸钠盐(sigma,D0627),20ng/mlRecombinantHumanNT-3(Peprotech,450-03),20ng/ml脑源性神经营养因子(peprotech,450-02),20ng/ml神经胶质细胞源性的神经营养因子(peprotech,450-10)。上述抗肿瘤药物I和II先后配合施用,抗肿瘤药物II在抗肿瘤药物I施加后3-7天再进行施用。采用本实施例的抗肿瘤药物I和II配合分别处理人恶性胶质瘤细胞(U87)、星形胶质瘤细胞(U251)、人恶性胶质瘤细胞(LN229)和人胶质母细胞瘤细胞(T98G)。最终胶质瘤细胞的形态,生长曲线及转化结果相比于对照组(即药物试剂中不含有(-)-Blebbistatin)的对比情况如图4A和4B所示。其中,采用含有20μM的(-)-Blebbistatin及对照组DMSO分别处理人恶性胶质瘤细胞(U87)、星形胶质瘤细胞(U251)、人恶性胶质瘤细胞(LN229)和人胶质母细胞瘤细胞(T98G),各实验组起始细胞量相同。图4A显示,采用含有20μM的(-)-Blebbistatin相比于对照组DMSO在第3天有明显的神经元形态的变化,且细胞较对照组明显稀少。进一步研究(-)-Blebbistatin对胶质瘤细胞增殖速率的影响。分别任选两株胶质瘤细胞U87和U251分别种于48孔板,细胞计数每孔5000个细胞,分别采用含有20μM的(-)-Blebbistatin及DMSO处理,每样3个平行孔,每间隔24小时利用CellCountingKit(CCK-8)CCK-8试剂盒(sigma,96992)检测细胞活力(细胞增殖活力),总共测5天。具体步骤如:(1)在48孔板中接种细胞悬液(100μL/孔);(2)将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5%CO2);(3)向每孔加入10μlCCK溶液;(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。图4B显示了本实施例的抗肿瘤药物显著抑制胶质瘤细胞细胞的增殖,在前5天对任选的胶质瘤细胞U87和U251抑制效率分别为50%和99%。图4C显示了本实施例的抗肿瘤药物将任选的快速增殖胶质瘤细胞U87转分化为分化的神经元细胞,表达神经元标记蛋白Tuj1,其阳性率接近95%。实施例4(siRNA敲低细胞骨架系统蛋白成分的转化实验及效果)将人包皮成纤维细胞以1×105的密度接种于12孔板中,用1ml的成纤维细胞培养液(DMEM+10%FBS)培养。当细胞达到50–70%汇合度时利用RNAiMAX(13778150,invitrogen)试剂盒分别转染靶位rock1、rock2、mrlc1、mrlc2、mrlc3、myh9、myh10、mrckα、mrckβ、lamina/c、lmnb1、lbr、sun1、sun2、cbx1、cbx3、cbx5、banf1、syne1、syne2、β-actin。具体步骤如下:(1)分别稀释如序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21的siRNA:在无RNA酶的EP管,用100μL/每孔的无血清Opti-MEM培养基稀释12pmolsiRNA双链(2.5ul),温和混匀;(2)稀释转染试剂RNAiMAXReagent:在无RNA酶的EP管,用100μL/每孔of无血清Opti-MEM培养基稀释RNAiMAXReagent,温和混匀;(3)稀释好的RNAiMAXReagent经过2min的孵育后,与上述(2)稀释好的siRNA轻轻混和,室温培养20min以形成RNAiMAXReagent混和物,溶液可能会有浑浊,不过不会影响。(4)将上述(3)的混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中,轻轻摇晃,使之混和;(5)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养,转染隔6-8小时后换成神经元培养液。(6)转染48-72小时。表5显示了siRNA序列与其所敲低的基因表达的对应关系。表5基因名NCBIID序列表中编号序列rock16093SEQIDNO:1gguuagaacaagagguaaarock29475SEQIDNO:2ggaucgaacccauggaucamrlc110398SEQIDNO:3ucgcaaugguugaccagucmrlc2103910SEQIDNO:4gccucuucuuuuugauguamrlc310627SEQIDNO:5ggucuauacagagucaauamyh94627SEQIDNO:6ggguaucaaugugaccgaumyh104628SEQIDNO:7gggcaacucuacaaagaaumrckα8476SEQIDNO:8cgagaagacuuugaaauaamrckβ9578SEQIDNO:9cgagaagacuuugaaauaalamina/c4000SEQIDNO:10gaaggagggugaccugaualmnb14001SEQIDNO:11cgagcauccucaagucgualbr3930SEQIDNO:12ggccgacauuaaggaagcasun123353SEQIDNO:13cagcuuuuaguaucaaccasun225777SEQIDNO:14gacucagaagaccucuucacbx110951SEQIDNO:15ggaagggauucucagaugacbx311335SEQIDNO:16ugacaaaccaagaggauuucbx523468SEQIDNO:17uaaacccagggagaagucabanf18815SEQIDNO:18uggccaguuucuggugcuasyne123345SEQIDNO:19gguagaacgucaaccucaasyne223224SEQIDNO:20gaacgagucugauuugauaβ-actin60SEQIDNO:21gcauccacgaaacuaccuu任一靶点敲低后第7天有明显的神经形态的变化,其中部分靶点敲低后的细胞形态变化图如图5A所示。图5B免疫荧光染色结果显示诱导第7天表达神经元命运的特异蛋白Tuj1。神经元培养基(N2B27培养液:DMEM/F12(gibco,10565018)与Neurobasal(Gibco,21103-049)1比1混合,加入N2添加剂(100×,Gibco,17502048),B27添加剂(50×,Gibco,17504044),2%牛血清蛋白(1000×,sigma,A8022),β-巯基乙醇(1000×,Gibco,21985023),Glutamax(200×,Gibco,35050-061),1μg/ml胰岛素(Roche,11376497001),双抗)。实施例5(干扰胞外基质处理低黏附的转化实验及效果)首先用无菌双蒸水配置1%琼脂糖溶液,微波炉加热至沸腾,随后加入等体积的2×DMEM,(Gibco,12800-017)制成溶于DMEM中的0.5%的琼脂糖溶液,然后倒入6cm的培养皿中,冷却凝固后备用。将人包皮成纤维细胞以1×105的密度接种于上述培养皿中,用神经干细胞培养液悬浮培养7天,隔天半量换液。悬浮培养第7天后的光镜照片见图6A。其中已经显示了神经元形态。用含有1ug/ml的纤连蛋白(Millipore,FC010)的1×PBS处理置于四孔板中的圆玻片,并置于培养箱中过夜包被备用。悬浮培养第7天的人成纤维细胞离心后用Tryple(Gibco,A1285901)在37℃培养箱中消化3min,用PBS稀释后离心,弃上清后用神经干细胞培养液重悬后以每孔5×104接种于四孔板中,次日去掉培养液,进行免疫荧光染色,具体如下:于室温条件下,用含有4%多聚甲醛(Sigma,158127)的PBS溶液固定20min,PBS洗3次,每次5min。然后在含有0.3%TritonX-100(Solarbio,T8200)和0.2%BSA(Sigma,A3803)的PBS溶液中通透1h。接着在4℃下,在含有2%的BSA和一抗:鼠抗-Nestin(Millipore,MAB353,1:100)、羊抗-Sox2(Santa,sc-17320,1:100)、鼠抗-Nkx2.2(abcam,ab187375,)兔抗-En1(abcam,ab70993,1:50),兔抗-N-cadherin(abcam,ab12221,1:100)、兔抗-Pax6(abcam,ab5790,1:50)的PBS溶液中过夜孵育。然后,用PBS溶液洗涤细胞三次,并在室温条件下,用抗兔、抗鼠、或抗羊二抗,,AlexaFluor-488或AlexaFluor-561(1:500,Invitrogen)孵育1小时。然后用PBS溶液洗涤细胞三次,再用含有Hoechst(Inventgen,H3570,1:1000)的PBS溶液染细胞核5min。然后将圆玻片倒扣在滴有防荧光淬灭剂的载玻片上,指甲油封片。随后利用Leica双光子共聚焦显微镜观察细胞。检测结果见图6B,其中Merge表示重合图。图6B的结果表明,经过低黏附悬浮培养的人包皮成纤维细胞可转化为Nestin和Sox2双阳性的神经干细胞。进一步的,这些双阳性细胞对Nkx2,2、En1、N-cad和Pax6也呈阳性。上述鉴定的神经干细胞同样的在第7天按照上述方法接种于四孔板中,随机分化组用随机分化培养液培养,定向分化组用定向分化培养液培养,隔天半量换液,第14天进行免疫荧光染色。其中一抗为兔抗-Tuj1(abcam,ab18207,1:2000)、鼠抗-GFAP(sigma,G3893,1:100)、鸡抗-NF2000(abcam,ab4680,1:1000)。检测结果分别见6C和6D。图6C的结果表明,低黏附处理得到的神经干细胞经过随机分化可得到GFAP阳性的星型胶质细胞,进一步的这些细胞对Tuj1呈阴性。图6D的结果表明,低黏附处理得到的神经干细胞经过定向分化可得到Tuj1和NF2000双阳性的神经元。基础培养液由DMEM/F12(Gibco,12400-024)和Neurobasal(Gibco,21103-049)按体积比1:1制成,并添加100×N2(Gibco,17502-048),50×B27(Gibco,17504-044),100×GlutaMAX(Gibco,35050-079,1000×β-mercaptoethanol(Gibco,21985),1000×2%BSA(sigma,A7906-100G),1000×Insulin(Rocheappliedscience,11376497001,10mg/mL),100×SP(Gibco,15140-122)。神经干细胞培养液由基础培养液添加20ng/ml的bFGF(表皮生长因子,R&D,233-FB-001MG/CF)配制。随机分化培养液由基础培养液添加1%FBS(胎牛血清,Gibco,16000-044)配制。定向分化培养液基础培养液添加20ng/ml的GDNF(peprotech,450-10),20ng/ml的BDNF(peprotech,450-02),20ng/ml的NT3(peprotech,450-03),4ng/ml的Forskolin(stemgent,04-0025)配制。实施例6(原代星形胶质细胞转分化为神经元)以12孔板为例(corning,3335)每孔用20ug/ml纤连蛋白溶液(millipore,fc010)1×PBS配制,包被6小时,或先用0.1mg/ml多聚赖氨酸溶液(sigma,P6407)无菌水配制,包被培养皿2小时,无菌水洗三次,再用10μg/ml层粘连蛋白溶液(sigma,L6274)1×PBS配制,包被6小时。去掉包被液用1×PBS冲液洗一遍。去掉洗液,将成人原代星形胶质细胞(ScienCell,1800)或小鼠大脑皮层分离的原代神经胶质细胞均匀种于每一个孔,用基础培养液(高糖DMEM(Gibco,C12430500BT),1×丙酮酸钠(100×,gibco,11360-070),1×非必须氨基酸(100×,Gibco,11140-050),双抗)加10%胎牛血清(Gibco,16000-044)培养24小时。去除培养液,PBS洗一遍。选用本发明的细胞转化试剂盒,所述试剂盒包括如下的诱导培养基和成熟培养基。将经上述处理后的神经胶质细胞加入神经元诱导培养基(N2B27培养液:DMEM/F12(gibco,10565018)与Neurobasal(Gibco,21103-049)1比1混合,加入N2添加剂(100×,Gibco,17502048),B27添加剂(50×,Gibco,17504044),2%牛血清蛋白(1000×,sigma,A8022),β-巯基乙醇(1000×,Gibco,21985023),Glutamax(200×,Gibco,35050-061),1μg/ml胰岛素(Roche,11376497001),双抗)。加入myosin抑制剂(-)-Blebbistatin(二甲基亚砜溶解(sigma,D2650)的100mM浓储,-20摄氏度避光保存1月),(-)-Blebbistatin在诱导培养基中的终浓度为15-30μM。培养3-7天,培养的细胞有明显神经元形态,大的胞体和长的轴突等及神经元命运标记物Tuj1染色,并统计Tuj1阳性率(Tuj1阳性细胞/细胞核比值)。图7A显示了原代星形胶质细胞形态(左图)及表达星形胶质细胞的标记蛋白GFAP(右图)。如图7B所示,(-)-Blebbistatin诱导13天的星形胶质细胞表现为经典神经元形态。如图7C所示,(-)-Blebbistatin诱导星形胶质细胞20天,接近100%表达经典神经元标记蛋白Tuj1。序列表<110>中国科学院动物研究所<120>一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法<130>FCW0308<160>21<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>RNA<213>未知<400>1gguuagaacaagagguaaa19<210>2<211>19<212>RNA<213>未知<400>2ggaucgaacccauggauca19<210>3<211>19<212>RNA<213>未知<400>3ucgcaaugguugaccaguc19<210>4<211>19<212>RNA<213>未知<400>4gccucuucuuuuugaugua19<210>5<211>19<212>RNA<213>未知<400>5ggucuauacagagucaaua19<210>6<211>19<212>RNA<213>未知<400>6ggguaucaaugugaccgau19<210>7<211>19<212>RNA<213>未知<400>7gggcaacucuacaaagaau19<210>8<211>19<212>RNA<213>未知<400>8cgagaagacuuugaaauaa19<210>9<211>19<212>RNA<213>未知<400>9cgagaagacuuugaaauaa19<210>10<211>19<212>RNA<213>未知<400>10gaaggagggugaccugaua19<210>11<211>19<212>RNA<213>未知<400>11cgagcauccucaagucgua19<210>12<211>19<212>RNA<213>未知<400>12ggccgacauuaaggaagca19<210>13<211>19<212>RNA<213>未知<400>13cagcuuuuaguaucaacca19<210>14<211>19<212>RNA<213>未知<400>14gacucagaagaccucuuca19<210>15<211>19<212>RNA<213>未知<400>15ggaagggauucucagauga19<210>16<211>19<212>RNA<213>未知<400>16ugacaaaccaagaggauuu19<210>17<211>19<212>RNA<213>未知<400>17uaaacccagggagaaguca19<210>18<211>19<212>RNA<213>未知<400>18uggccaguuucuggugcua19<210>19<211>19<212>RNA<213>未知<400>19gguagaacgucaaccucaa19<210>20<211>19<212>RNA<213>未知<400>20gaacgagucugauuugaua19<210>21<211>19<212>RNA<213>未知<400>21gcauccacgaaacuaccuu19当前第1页1 2 3 
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