微小RNA及其在制备抗日本血吸虫感染制剂中的应用的制作方法

文档序号:15457441发布日期:2018-09-15 01:29
本发明涉及生物医药,具体地,涉及微小RNA及其在制备抗日本血吸虫感染制剂中的应用。
背景技术
:血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病。目前血吸虫病治疗仍以吡喹酮为主,但完全依赖单一药物治疗难以控制血吸虫病重复感染,且近年来研究发现吡喹酮化疗有诱导抗药性产生的潜在风险,因此开展血吸虫病新型疫苗和新药研发对血吸虫病有效控制乃至消除有重要的战略意义。非编码小核糖核酸广泛存在于真核生物中,长度一般为18-30个核苷酸(nucleotide,nt),主要包含微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)、小干扰核糖核酸(smallinterferingRNA,siRNA)、Piwi-相互作用核糖核酸(piRNA)等3类,是生物基因表达、基因组稳定和抵御外来遗传因子的关键调节因子。近年来研究者发现血吸虫不同发育阶段存在其特异性非编码RNA,这为深入研究血吸虫发育和寄生以及致病机制提供新的思路。微小RNA的鉴定及发现将有利于发现潜在抗日本血吸虫药物靶标,为更深入了解日本血吸虫的生物学特征以及进一步发展日本血吸虫新药物研发提供新线索。因此,本领域迫切需要开发一种可以有效杀灭或抑制血吸虫(尤其是日本血吸虫,)且副作用小的微小RNA药物。技术实现要素:本发明的目的在于开发一种可以有效杀灭或抑制血吸虫(尤其是日本血吸虫)且副作用小的微小RNA药物。本发明第一方面提供了一种核酸抑制分子,所述核酸抑制分子为单链或双链amiRNA,所述核酸抑制分子的正义链的5'至3'端具有式I所示的结构:Z0-Z1-Z2(I)其中,Z0=A、T、C、G或无;Z1是如SEQIDNO.:1、3、或5所示的核苷酸序列;和Z2=A、T、C、G或无。在另一优选例中,所述式I结构选自下组:SEQIDNO.:1、3、5、或其组合。在另一优选例中,所述的核酸抑制分子包括siRNA。在另一优选例中,所述的核酸抑制分子的长度为16-50nt,较佳地16-30nt,更佳地16-25nt。在另一优选例中,所述的核酸抑制分子为分离的、重组的、或人工合成的核酸分子。本发明第二方面提供了一种产生本发明第一方面所述的核酸抑制分子的前体序列,所述前体序列正义链的5'至3'端具有式II所示的结构:式中,B1为所需要的第一核糖核苷酸序列,其中所述的第一核糖核苷酸序列包括amiRNA序列形式;B2为与B1基本互补或完全互补的序列,且B2与C不互补;C为茎环结构。在另一优选例中,所述的B1或所述的amiRNA具有式I结构,或如式I所示。在另一优选例中,所述B1的序列选自下组:SEQIDNO.:1、3、5、或其组合。本发明第三方面提供了一种核酸分子,所述核酸分子的序列如SEQIDNO.:1、3、5中任一所示。在另一优选例中,所述的核酸分子为单链或双链。本发明第四方面提供了一种多核苷酸,所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第二方面所述的前体序列。本发明第五方面提供了一种表达载体,所述的表达载体含有本发明第二方面所述的前体序列或本发明第四方面所述的多核苷酸。在另一优选例中,所述表达载体为病毒载体或非病毒载体。在另一优选例中,所述病毒载体选自下组:慢病毒载体、腺病毒载体、或其组合。本发明第六方面提供了一种用于杀灭或抑制血吸虫的组合物,所述的组合物包括;(a)本发明第一方面所述的核酸抑制分子、和/或本发明第二方面所述的前体序列;和(b)药学上可接受的载体。在另一优选例中,所述组合物还包括病毒载体。在另一优选例中,所述组合物还包括(c)其他杀灭或抑制血吸虫的药物。在另一优选例中,所述血吸虫选自下组:日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。在另一优选例中,所述血吸虫包括日本血吸虫。在另一优选例中,所述的药学上可接受的载体选自下组:水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。在另一优选例中,所示组合物的剂型选自下组:片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂。在另一优选例中,所述的组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、含漱剂。在另一优选例中,所述的剂型为注射剂,较佳地为静脉注射剂、腹腔注射剂。在另一优选例中,所述剂型为口服剂型。在另一优选例中,所述组合物选自下组:药物组合物、疫苗组合物、或其组合。本发明第七方面提供了本发明第一方面所述核酸抑制分子或本发明第二方面所述前体序列的用途,用于制备组合物或制剂,所述组合物或制剂用于(i)预防或治疗血吸虫感染;和/或(ii)杀灭或抑制血吸虫。在另一优选例中,所述组合物或制剂还用于杀灭或抑制血吸虫童虫。在另一优选例中,所述组合物或制剂还包括其他杀灭或抑制血吸虫的药物。本发明第八方面提供了一种抑体外杀灭或抑制血吸虫的方法,包括步骤:在本发明第一方面所述的核酸抑制分子或本发明第二方面所述的前体序列或本发明第六方面所述的组合物存在的情况下,培养血吸虫,从而杀灭或抑制血吸虫。在另有一优选例中,所述血吸虫选自下组:日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。在另一优选例中,所述血吸虫包括日本血吸虫。在另一优选例中,所述步骤为在培养体系中,将所述血吸虫与表达本发明第一方面所述的核酸抑制分子或本发明第二方面所述的前体序列的病毒载体接触,从而杀灭或抑制血吸虫。在另一优选例中,所述培养体系中,所述病毒载体的浓度为104-1010个/ml,较佳地,104-107个/ml。本发明第九方面提供了一种筛选抑制或杀灭血吸虫的候选化合物的方法,包括步骤:(a)在测试组中,在培养体系中,在测试化合物存在的条件下,培养表达FTL蛋白和/或SJCL蛋白的细胞一段时间T1,检测测试组所述培养体系中FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E1和/或活性A1;并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中,测试对照组所述培养体系中FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E2和/或活性A2;(b)将上一步骤所检测到的FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E1和/或活性A1与FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E2和/或活性A2进行比较,从而确定所述测试化合物是否是抑制或杀灭血吸虫的候选化合物,其中,如果E1显著低于E2、和/或A1显著低于A2,则表示所述测试化合物为抑制或杀灭血吸虫的候选化合物。在另一优选例中,所述“显著低于”指E1/E2≤1/2,较佳地≤1/3,更佳地,≤1/4。在另一优选例中,所述“显著低于”指A1/A2≤1/2,较佳地≤1/3,更佳地,≤1/4。在另一优选例中,所述方法包括步骤(c),将步骤(b)确定的候选化合物施用于血吸虫,并测定其对血吸虫的杀灭或抑制作用。在另一优选例中,所述的方法是非诊断和治疗性的。本发明第十方面提供了一种预防和/或治疗血吸虫疾病的方法,向所需要的对象施用本发明第一方面所述的核酸抑制分子或本发明第二方面所述的前体序列或本发明第六方面所述的组合物。在另一优选例中,所述的需要的对象包括哺乳动物,较佳地,为人、小鼠、大鼠、兔。本发明第十一方面提供了一种amiRNA、或其前体、或其表达载体的用途,用于制备药物,所述药物用于(i)预防或治疗血吸虫感染;和/或(ii)杀灭或抑制血吸虫;并且所述amiRNA是特异性抑制FTL基因和/或SJCL基因的核酸分子。在另一优选例中,所述amiRNA为单链、双链。在另一优选例中,所述amiRNA为本发明第一方面所述的核酸抑制分子。在另一优选例中,所述的amiRNA特异性抑制FTL基因和/或SJCL基因的转录和/或翻译。应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。附图说明图1显示了pSIF重组载体鉴定结果。图2显示了qRT-PCR结果。其中,A:发现pSIF-SJCL4-miR和pSIF-SJCL4-trans可有效抑制pCMV-sjcl的表达;B:pSIF-SJFTL4-trans可有效抑制pCMV-ftl的表达。图3显示了pCMV6-SjCL分别和pSIF-SjCL4-miR、pSIF-SjCL4-trans共转染293T细胞48小时和72小时,Werternblot检测DDKtag的表达,β-actin作为对照。图4显示了重组慢病毒介导miRNA杀伤日本血吸虫童虫的体外效果。其中,A:对照组;B:pSIF-FTL4-trans慢病毒处理组;C:pSIF-SjCL4-miR慢病毒处理组;D:pSIF-SjCL4-trans慢病毒处理组。具体实施方式经过广泛而深入的研究,筛选了大量核苷酸序列,首次发现,某些特定的核酸抑制分子(amiRNA)居然对日本血吸虫(尤其是童虫)具有一定或很高的杀灭或抑制能力。因此,导入本发明的这些特异性血吸虫的amiRNA,可以有效地抑制或杀灭日本血吸虫(尤其是童虫)。在此基础上,发明人完成了本发明。实验表明,针对血吸虫的FTL和/或SJCL基因设计了许多amiRNA,意外地发现针对上述靶基因设计的amiRNA可高效的杀灭或抑制血吸虫,并且抑制率可高达26%。FTL、SJCL基因或其蛋白阀结构蛋白FTL,是一种血吸虫表膜蛋白。在本发明中,经定量蛋白质组学分析,FTL蛋白可以作为血吸虫疫苗的靶蛋白。分泌蛋白SJCL3是日本血吸虫的一种肠道酶蛋白,本发明的研究发现,其与日本血吸虫在人体内的生存及生殖有着密切的关系,也可作为日本血吸虫潜在的疫苗靶标蛋白。血吸虫FTL基因的genebank登录号:FN318171.1,血吸虫SJCL基因的genebank登录号:FN319073.1。amiRNA及其前体本发明提供了一类有效地抑制或杀灭日本血吸虫(尤其是童虫)的amiRNA。在本发明中,提供了一种核酸抑制分子,所述核酸抑制分子为单链或双链amiRNA,其正义链的5'至3'端具有式I所示的结构:Z0-Z1-Z2(式I)其中,Z0=A、T、C、G或无;Z1是如SEQIDNO.:1、3、或5所示的核苷酸序列;和Z2=A、T、C、G或无。在一优选实施方式中,所述式I所示的amiRNA序列选自下组:SEQIDNO.:1、3、5、或其组合。本发明还提供了一种单链的核酸分子,所述核酸分子的序列如SEQIDNO.:1、3、5中任一所示的序列或与其完全互补的序列。如本文所用,所述的“amiRNA”、“miRNA”可互换使用,是指一类人工小分子RNA(artificialmicroRNA,amiRNA),是利用天然miRNA生成和作用原理设计的,以一个或多个特定基因为靶标的小RNAs分子,它能够高效、特异地抑制基因的表达,从可形成amiRNA前体的转录物加工而来。成熟的amiRNA通常具有16-50核苷酸(nt),较佳地,16-30nt,更佳地,16-25nt,也不排除具有其它数目核苷酸的amiRNA分子。amiRNA通常可被Northern印迹检测到。RNA沉默的功效不仅取决于amiRNA的性质,而且还取决于靶mRNA的局部结构。因此本发明针对日本血吸虫表膜蛋白FTL和肠道酶蛋白SJCL,各设计了4条amiRNA,筛选得到抑制效果最好的amiRNA。如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。值得说明的是,amiRNA一般通过模拟miRNA产生机制来产生的,这样的amiRNA就可从前体RNA(PrecursorRNA,Pre-RNA)加工而来。所述的前体RNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构,所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体RNA可折叠成稳定的茎环结构,茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体RNA可以是天然的或是人工合成的。前体RNA可被剪切生成amiRNA,所述的amiRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用,“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的,可以以一种可预见的方式发生相互作用,如形成二级结构(如茎环结构)。通常,两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的;优选的,至少有80%的核苷酸是互补的;更优选的,至少有90%的核苷酸是互补的;进一步优选的,至少有95%的核苷酸是互补的;如98%、99%或100%。一般地,两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸;优选的,具有最多30个不匹配的核苷酸;更优选的,具有最多20个不匹配的核苷酸;进一步优选的,具有最多10个不匹配的核苷酸,如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。如本文所用,“茎环”结构也被称作“发夹”结构,是指一种核苷酸分子,其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构,所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成,两个区域分列双链部分的两侧;其还包括至少一个“环”结构,包括非互补的核苷酸分子,即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的,核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如,插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构,然而,该两个区域仍可基本上互补,并在可预见的方式中发生相互作用,形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的,通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后,本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。本发明所述的amiRNA是指:抑制或杀灭血吸虫的amiRNA家族的微小RNA,所述抑制或杀灭血吸虫的amiRNA家族的微小RNA包括:抑制或杀灭血吸虫的amiRNA或经修饰的抑制或杀灭血吸虫的amiRNA衍生物。在本发明的一个优选例中,抑制或杀灭血吸虫的双链amiRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.:1-6所示。特别优选的是SEQIDNO.:1、3、5中任一序列或其组合。本发明还包括amiRNA变体和衍生物。此外,广义上的amiRNA衍生物也可包括amiRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对本发明的amiRNA进行修饰,修饰方式包括(但不限于):甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。多核苷酸构建物根据本发明所提供的amiRNA序列,可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的amiRNA的多核苷酸构建物,也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的amiRNA的量。因此,本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物),所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体amiRNA,所述的前体amiRNA可被人细胞剪切且表达成所述的amiRNA。作为本发明的一种优选方式,所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构:Seq正向-X-Seq反向式II式II中,Seq正向为可在细胞中表达成所述的amiRNA的核苷酸序列,Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列;或者,Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列,Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列;X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列,并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补;式I所示的结构在转入细胞后,形成式III所示的二级结构:式III中,Seq正向、Seq反向和X的定义如上述;||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。通常,所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此,本发明还包括一种载体,它含有所述的amiRNA,或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。药物组合物及施用方法本发明提供了一种杀灭或抑制血吸虫的组合物,所述的组合物包括药物组合物或免疫组合物。以药物组合物为例对组合物作进一步的说明,所述药物组合物包括;(a)本发明第一方面所述的核酸抑制分子、和/或本发明第二方面所述的前体序列;和(b)药学上可接受的载体。在一优选实施方式中,所述组合物还包括(c)其他杀灭或抑制血吸虫的药物。在一优选实施方式中,所述组合物还包括病毒载体。如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用,术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常,当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配,这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。典型地,在本发明中,本发明的核酸抑制分子或其前体可被用于制备一种药物组合物,所述药物组合物用于(i)预防或治疗血吸虫感染;和/或(ii)杀灭或抑制血吸虫(优选血吸虫童虫)。此外,本发明的药物组合物还可以含有其他杀灭或抑制血吸虫的药物。筛选抑制或杀灭血吸虫的候选化合物的方法在本发明中,还提供了一种筛选抑制或杀灭血吸虫的候选化合物的方法,包括步骤:(a)在测试组中,在培养体系中,在测试化合物存在的条件下,培养表达FTL蛋白和/或SJCL蛋白的细胞一段时间T1,检测测试组所述培养体系中FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E1和/或活性A1;并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中,测试对照组所述培养体系中FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E2和/或活性A2;和(b)将上一步骤所检测到的FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E1和/或活性A1与FTL蛋白和/或SJCL蛋白的表达量E2和/或活性A2进行比较,从而确定所述测试化合物是否是抑制或杀灭血吸虫的候选化合物,其中,如果E1显著低于E2、和/或A1显著低于A2,则表示所述测试化合物为抑制或杀灭血吸虫的候选化合物。本发明的主要优点包括:(1)在本发明之前,从未发现杀灭或抑制血吸虫的核酸类物质。本发明首次发现针对血吸虫的FTL和/或SJCL基因设计的amiRNA可高效抑制或杀灭血吸虫,血吸虫的抑制率可高达26%。(2)本发明首次发现FTL和/或SJCL在日本血吸虫的生长、发育等生理过程中可能扮演重要的作用。(3)本发明首次以FTL和/或SJCL为靶标,筛选与鉴定出这2个基因相关的若干miRNAs,并探讨其可能的生物学功能。下面结合具体实施,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器,若非特别说明,均市售可得。实施例1血吸虫amiRNA的设计通过对大量基因进行筛选,发现SjCL基因、FTL基因在日本血吸虫的生长、发育等生理过程中可能扮演重要的作用,因此本发明针对血吸虫SjCL基因(登录号:FN319073.1)、FTL基因(登录号:FN318171.1)各设计了四条amiRNA,SjCL基因四条amiRNA分别命名为amiSJCL1、amiSJCL2、amiSJCL3、amiSJCL4,并且amiSJCL1、amiSJCL2、amiSJCL3、amiSJCL4分别位于SJCL基因的123bp、283bp、455bp、674bp区段。FTL基因四条amiRNA分别命名为amiFTL1、amiFTL2、amiFTL3、amiFTL4,并且amiFTL1、amiFTL2、amiFTL3、amiFTL4分别位于FTL基因的211bp、276bp、354bp、454bp区段。amiRNA是由top链和bottom链两条单链退火形成双链。退火体系如下试剂混匀后95℃处理4min,室温冷却10min。成功得到退火形成的双链。经过大量筛选,意外地获得了有优异抑制效果的amiRNA。SjCL基因筛选得到抑制效果较好的SJCL2和SJCL4。qPCR和Werternblot结果显示,在SJCL1-4四条amiRNA中,SJCL2和SJCL4能导致SJCL的mRNA和蛋白水平下降,结果有统计学意义。SJCL2分别由SJCL2-TOP,SJCL2-bottom两条链退火合成。SJCL4分别由SJCL4-TOP,SJCL4-Bottom两条链退火合成。此外,qPCR结果显示FTL1-4只有FTL4能导致FTL基因的mRNA水平下降,结果有统计学意义。Werternblot检测FTL4重组质粒对于FTL在蛋白水平上表达的影响,FTL的表达明显也受到抑制。FTL4由FTL4-TOP,FTL4-bottom两条链退火合成。上述筛选到的amiRNA的具体信息如表1所示。表1amiRNA名称序列信息(5'-3')SEQIDNO.:FTL4-Top(正义链)TAGGACGAGGGAATTGAAA1FTL4-Bottom(反义链)TTTCAATTCCCTCGTCCTA2SJCL2-Top(正义链)GAGCATAAGTGCCTATCAA3SJCL2-Bottom(反义链)TTGATAGGCACTTATGCTC4SJCL4–Top(正义链)ATGTTCGTCAACAAGGGTA5SJCL4-Bottom(反义链)TACCCTTGTTGACGAACAT6实施例2日本血吸虫ftl及sjcl基因对应amiRNA的重组慢病毒载体pSIF-H1的构建因为只设计一条片段,可能会出现重组载体不起作用的情况,所以amiFTL4及amiSJCL2、amiSJCL4各设计长短不同的两条片段。amiFTL4两条片段中的短片段FTL4-miR只含amiRNA短片段,长片段除了含有amiRNA,还额外含有一个trans元件命名为FTL4-trans,其中trans代表还包含上游增加一个转录起始元件(以便驱动转录),miR代表只含amiRNA短片段,同理amiSJCL2短片段为SJCL2-miR,长片段为SJCL2-trans,SJCL4短片段为SJCL4-miR,长片段为SJCL4-trans,FTL4及SJCL2、SJCL4长短片段上游含BamHⅠ酶切位点,下游含EcoRⅠ酶切位点。经PCR扩增后,在1%琼脂糖凝胶中回收目的条带,纯化后双酶切,得到5'末和3'末端分别含有BamHⅠ和EcoRⅠ的目的片段,同时将常规的载体pSIF1-H1(市售)经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后得到线性化的载体,使用T4DNA连接酶对上述产物的粘端进行连接。按照常规方法将连接产物转化。小提质粒DNA后,采用酶切、PCR等方法进行鉴定,得到六个阳性重组质粒,分别命名为pSIF-SjCL2-miR、pSIF-SjCL2-trans、pSIF-SjCL4-miR、pSIF-SjCL4-trans、pSIF-FTL4-miR、pSIF-FTL4-trans,利用BamHI和XhoI双酶切鉴定,结果如图1所示。酶切及测序鉴定结果表明成功构建pSIF-SjCL2-miR、pSIF-SjCL2-trans、pSIF-SjCL4-miR、pSIF-SjCL4-trans、pSIF-FTL4-miR、pSIF-FTL4-trans重组慢病毒载体。实施例3有效pSIF-重组载体的筛选3.1方法293T细胞培养:先前构建的SJCL基因过表达载体pCMV6-SJCL(购自Origene公司)分别和pSIF-SjCL4-miR、pSIF-SjCL4-trans共转染293T细胞,分别培养48小时和72小时;先前构建的FTL基因过表达载体pCMV-FTL(购自Origene公司)、pSIF-SJCL4-miR和pSIF-SJCL4-trans共转染293T细胞,分别培养48小时和72小时。3.2转录水平和蛋白水平鉴定3.2.1实时荧光定量PCR(qPCR)的结果qPCR验证选择效果较好的片段,利用Graphad-prism5软件统计PCR结果,发现pSIF-SJCL4-miR和pSIF-SJCL4-trans可有效干扰pCMV-SjCL的表达,如图2A,P值为0.0005,结果有统计学意义。并且,pSIF-FTL4-trans可有效干扰pCMV-FTL的表达,P值<0.0001,结果有统计学意义;然而pSIF-FTL4-miRNA可能是因为片段较短,缺少了某些必要元件,从而影响了其干扰效果。(图2B)。3.2.2Werternblot检测结果分别检测pSIF-FTL4-trans慢病毒对于FTL在蛋白水平上表达的影响和pSIF-SJCL4-miR和pSIF-SJCL4-trans慢病毒对于SJCL在蛋白水平上表达的影响,Werternblot检测DDKtag的表达,β-actin作为对照。结果显示,48h后,pSIF-FTL4-trans慢病毒对于FTL蛋白表达有抑制,pSIF-SJCL4-miR和pSIF-SJCL4-trans慢病毒对于SJCL蛋白表达有抑制,如图3所示。Westernblot实验的结果表明,pSIF-FTL4-trans慢病毒对于日本血吸虫表膜FTL蛋白表达有显著抑制作用,pSIF-SJCL4-miR和pSIF-SJCL4-trans慢病毒对于日本血吸虫SJCL蛋白表达有明显抑制作用。实施例4体外杀伤日本血吸虫童虫的效果4.1重组慢病毒体外制备pSIF1慢病毒包装:a.10cm平板培养细胞至50%-70%汇合度。b.将20uL(10ug)的包装质粒与2ug(2-25uL取决于浓度)混合,然后将稀释液质粒混合物加入进400uLDMEM。c.加入40uL的X-treme,室温下放置20-30mind.用无抗DMEM洗293T细胞平板,然后加入9mL含2%血清的无抗DMEM培养基。e.加入第2,3步混合好的复合物,过夜培养。f.更换含有新鲜的含2%血清和抗生素的培养基,并在37℃的二氧化碳培养箱中孵育48小时。g.转染24、48、以及62小时收集上清液。也可以只在转染48小时后征收一次。h.收集全部的10ml含假病毒的培养基于一个15mL无菌培养基中,在室温下以3000rpm离心5min,离心后,将上清液用0.45um的PVDF膜过滤,分装到1.5mL的离心管中。4.2体外杀伤效果分别以pSIF-FTL4-trans低剂量组(200uL)、高剂量组(400uL),pSIF-SJCL4-miR、pSIF-SJCL4-trans低剂量组(200uL)、高剂量组(400uL),200uLpSIF-H1空载体阴性对照组(200uL),空白对照组加到新鲜制备的日本血吸虫童虫共培养48小时后,显微镜观察日本血吸虫童虫。结果如图4A-4D和表2所示,与血吸虫童虫空白对照组以及阴性对照组相比,pSIF-FTL4-trans,pSIF-SjCL4-miR,pSIF-SjCL4-trans处理组的日本血吸虫童虫死亡数明显上升,且呈剂量依赖性。此外,无论是否增加转录起始元件(trans),对于校正死亡率无明显影响。表2重组慢病毒48h体外日本血吸虫童虫校正死亡率(%)pSIF-FTL4-trans(低剂量组)9.4pSIF-FTL4-trans(高剂量组)26pSIF-SjCL4-miR(低剂量组)11.5pSIF-SjCL4-miR(高剂量组)22.8pSIF-SjCL4-trans(低剂量组)8.8pSIF-SjCL4-trans(高剂量组)21.5空白对照组0阴性对照组5.8在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所<120>微小RNA及其在制备抗日本血吸虫感染制剂中的应用<130>P2017-0109<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1taggacgagggaattgaaa19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2tttcaattccctcgtccta19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3gagcataagtgcctatcaa19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4ttgataggcacttatgctc19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5atgttcgtcaacaagggta19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6tacccttgttgacgaacat19当前第1页1 2 3 
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