CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒与流程

文档序号:15457519发布日期:2018-09-15 01:32

本发明涉及生物大分子检测领域,更具体地说,涉及CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。



背景技术:

嵌合抗原受体(CAR)是单链抗体的可变区和T细胞信号分子的融合蛋白,它使T细胞可以通过非MHC 限制性的方式识别特异性抗原,发挥杀伤作用。目前,CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域(第二、三代),在体内的存在时间及杀伤能力明显增强。利用靶向 CD19和CD20的CAR修饰的T细胞进行过继输注,治疗血液系统恶性肿瘤是目前临床研究的热点。由于CAR-T 细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞,利用抗原抗体结合的机制,能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸,让肿瘤细胞无所逃遁;多靶向更精准。CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原,又可利用糖脂类非蛋白质抗原,扩大了肿瘤抗原靶点范围,CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制;杀瘤范围更广。CAR技术也正研究用于骨髓移植后的过继免疫治疗等领域。在治疗安全性方面,目前临床试验中大部分患者对CAR治疗耐受性良好。目前大部分的CRA-T技术都处于研发状态,因为细胞毒性和脱靶问题的存在给治疗带来不确定性,所以实时监控检测治疗过程中人体内基因表达水平显得尤为重要。

实时定量PCR检测方法(real-time PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。实时定量PCR在常规PCR基础上把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起,能提高灵敏度,且在整个实验中,所有反应物在同一溶液中进行,不需要任何后处理过程,被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关。

随着自体细胞回输技术的不断成熟与完善,对CD22三代嵌合抗原受体的含量检测要求更加精准,CD22三代嵌合抗原受体含量直接关系是否能够产生疗效。目前没有一种针对CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒,该方法能够有效的追踪人体内或培养过程中CD22三代嵌合抗原受体含量,提示治疗情况并为治疗剂量提供参考,效果准确迅速。

为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法,所述方法包括:

第一步:提取待测样品DNA;

第二步:PCR反应:取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶,加入待测样品DNA配成PCR反应液;

第三步:进行PCR扩增反应,于每个循环结束时测定吸光值;

第二步中所述特异性扩增引物为:

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

如上所述的检测方法,优选地,第三步中所述的PCR扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

如上所述的检测方法,优选地,第三步结束后,取5μLPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据PCR扩增产物长度检验扩增准确率。

如上所述的检测方法,优选地,所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量之比为1∶1∶1∶1的混合物。

如上所述的检测方法,优选地,所述DNA染料为SYBR染料。

如上所述的检测方法,优选地,PCR反应液终浓度组成如下:10×扩增缓冲液 10μL;dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200umol/L;特异引物上下游各20-30pmol;模板DNA 0.6~1.6μg;Taq DNA聚合酶 2.0- 2.5u;Mg2+ 1.5mmol/L;溶剂为ddH2O加水至100μL。

CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测试剂盒,主要包括特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和TaqDNA聚合酶,所述特异性扩增引物如下:上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

如上所述的 CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测试剂盒,优选地,包括10×扩增缓冲液10μL脱氧三磷酸核苷混合物为 dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量之比为各200μmol/L;特异引物上下游各20-30pmol;模板DNA 0.6~1.6μg;Taq DNA聚合酶 2.0- 2.5u;Mg2+ 1.5mmol/L;溶剂为ddH2O加水至100μL。

如上所述的 CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测试剂盒,优选地,所述DNA染料为SYBR GreenI。

发明提供的一种CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒,能够有效的追踪人体内或培养过程中CD22三代嵌合抗原受体含量,提示治疗情况并为治疗剂量提供参考,效果准确迅速。

采用本发明的试剂盒进行检测时具有如下优点:

1. 人身毒害小,安全环保。减少了电泳、银染等步骤,避免聚丙烯酰胺、溴化乙锭等致癌试剂的使用,,避免了试验过程中对环境的污染。

2. 低污染,低误差。封闭体系内完成扩增和实时测定,大大降低了污染的可能性,也降低了结果偏差的几率。

附图说明

图1是实施例1中CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测曲线图。

其中,横坐标代表定量PCR扩增循环数,纵坐标代表荧光信号强度,A代表阈值线,C代表典型的扩增曲线,B代表阈值线A与扩增曲线C的交点(B所对应的定量PCR循环数,即为Ct值),D代表阴性对照样品扩增曲线,E代表阴性对照样品扩增曲线的最高点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:

实施例1:

CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法,所述方法包括:

第一步:提取待测样品DNA;

第二步:PCR反应:取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶,加入待测样品DNA配成PCR反应液;

第三步:进行PCR扩增反应,于每个循环结束时测定吸光值;

其中,第二步中所述特异性扩增引物如下:

上游引物(SEQ ID NO.1)为:5′AGAGGGGAGCGCAAACTGA 3′;下游引物(SEQ ID NO.2)为5′GGAATCTAAGATTGACTTAATT 3′;

PCR反应液组成如下(按终浓度计):10×扩增缓冲液 10μL;dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μmol/L;特异引物上下游各20pmol;模板DNA 0.6μg;Taq DNA聚合酶 2.0u;Mg2+ 1.5mmol/L;溶剂为ddH2O加水至100μL;DNA染料为SYBR染料。

第三步中所述的PCR扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟;

第三步结束后,取5μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据PCR扩增产物长度检验扩增准确率。

采用荧光定量PCR仪的检测结果如图1所示。

实施例2

CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法,所述方法包括:

第一步:提取待测样品DNA;

第二步:PCR反应:取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶,加入待测样品DNA配成PCR反应液;

第三步:进行PCR扩增反应,于每个循环结束时测定吸光值;

第二步中所述特异性扩增引物如下:

上游引物为SEQ ID NO.1:5′AGGACGGAGCGCAAACTGA3′;下游引物为SEQ ID NO.2:5′GGTATCTAAGATTGACTCTATT 3′。

PCR反应液中各组分的终浓度如下:10×扩增缓冲液10μL;dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μmol/L;特异引物上下游各25pmol;模板DNA 1.1μg;Taq DNA聚合酶 2.3u;Mg2+1.5mmol/L;溶剂为ddH2O加水至100μL, DNA染料为SYBR染料。

第三步中所述的PCR扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

第三步结束后,取5μLPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据PCR扩增产物长度检验扩增准确率。

实施例3

CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法,所述方法包括:

第一步:提取待测样品DNA;

第二步:PCR反应:取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶,加入待测样品DNA配成PCR反应液;

第三步:进行PCR扩增反应,于每个循环结束时测定吸光值;

第二步中所述特异性扩增引物如下:

上游引物为SEQ ID NO.1:5′AGGACGGAGCGCAAACTGA3′;下游引物为SEQ ID NO.2:5′GGTATCTAAGATTGACTCTATT 3′。

PCR反应液中各组分的终浓度如下:10×扩增缓冲液10μL;dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μmol/L;特异引物上下游各30pmol;模板DNA1.6μg ;Taq DNA聚合酶2.5u;Mg2+ 1.5mmol/L;溶剂为ddH2O加水至100μL。

第三步中所述的PCR扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

第三步结束后,取5μLPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,PCR扩增产物长410-430bp。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉波睿达生物科技有限公司

<120> CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ggaatctaag attgacttaa tt 22

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