本发明涉及医药领域，特别是涉及一种老鹳草多糖及低聚糖的制备方法及应用。
背景技术：
老鹳草为牻牛儿苗科植物牻牛儿苗Erodium stephanianum Willd.、老鹤草Geranium wilfordii Maxim.或野老鹳草Geranium carolinianum L.的干燥地上部分。具有祛风湿、通经络、止泻痢、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、降糖、保肝等作用。临床主要用于风湿痹痛，麻木拘挛，筋骨酸痛，泄泻痢疾。现对其有效成分的研究主要涉及鞣质、黄酮、有机酸、挥发油、三萜类、甾醇类、木质素类等成分，对其中的多糖和低聚糖的研究尚未见报道，特别是如何解决一体化制备老鹳草多糖及低聚糖也未见报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为了克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种老鹳草多糖及低聚糖的制备方法，可有效解决老鹳草多糖及低聚糖的制备及老鹳草多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用和老鹳草低聚糖在制备抗疲劳的药物和保健品中的应用。
本发明解决的技术方案是，一种老鹳草多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：取老鹳草干燥，粉碎成粗粉；取老鹳草粗粉，向老鹳草粗粉中加入蒸馏水，老鹳草粗粉与蒸馏水的重量比为1：11-22，浸泡23-46min，84℃-98℃超声提取41-97min，过滤，滤液浓缩至比重为1.11-1.20的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为66％-79％，4℃静置8-15h，6000r/min离心45min，得上清液A和离心沉淀B，上清液A备用，离心沉淀B冷冻干燥，得老鹳草粗多糖粉末C，取老鹳草粗多糖粉末C加入10倍重量的蒸馏水使溶解得老鹳草粗多糖溶液D，向老鹳草粗多糖溶液D中加入其1％重量的酵母，于室温下转速150-195r/min摇床培养发酵，发酵时间26-74h，过滤，于滤液中加入Ca(OH)2至滤液pH值为8.1，88℃水浴加热66min同时通入CO2气体，放至室温，过滤，滤液浓缩至比重为1.11-1.20的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为80％，4℃静置12h，6000r/min离心35min，取下层沉淀冷冻干燥即得老鹳草多糖E；取上清液A减压回收乙醇浓缩至比重为1.11-1.21的浸膏，乙醚萃取，收集下层萃取液，50℃挥去乙醚，依次通过大孔吸附树脂柱、凝胶树脂柱，得洗脱液，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得老鹳草低聚糖F；实现以老鹳草为原料制备老鹳草多糖及低聚糖，并将老鹳草多糖有效用于制备增强免疫力的药物和保健品及将老鹳草低聚糖用于制备抗疲劳的药物和保健品中的应用。
所述的大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂,凝胶树脂为Sephadex LH-20。
本发明制备方法简单，易于操作，应用范围广泛，可有效用于制备老鹳草多糖及低聚糖，老鹳草多糖可用于制备增强免疫力的药物和保健品；老鹳草低聚糖可用于制备抗疲劳的药物和保健品，开拓了老鹳草药材及老鹳草多糖、低聚糖的应用价值，具有良好的经济和社会效益，是中药上的巨大创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，取老鹳草干燥，粉碎成粗粉；取老鹳草粗粉，向老鹳草粗粉中加入蒸馏水，老鹳草粗粉与蒸馏水的重量比为1：22，浸泡46min，98℃超声提取97min，过滤，滤液浓缩至比重为1.20的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为79％，4℃静置15h，6000r/min离心45min，得上清液A和离心沉淀B，上清液A备用，离心沉淀B冷冻干燥，得老鹳草粗多糖粉末C，取老鹳草粗多糖粉末C加入10倍重量的蒸馏水使溶解得老鹳草粗多糖溶液D，向老鹳草粗多糖溶液D中加入其1％重量的酵母，于室温下转速195r/min摇床培养发酵，发酵时间74h，过滤，于滤液中加入Ca(OH)2至滤液pH值为8.1，88℃水浴加热66min同时通入CO2气体，放至室温，过滤，滤液浓缩至比重为1.20的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为80％，4℃静置12h，6000r/min离心35min，取下层沉淀冷冻干燥即得老鹳草多糖E；取上清液A减压回收乙醇浓缩至比重为1.21的浸膏，乙醚萃取，收集下层萃取液，50℃挥去乙醚，依次通过AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶树脂柱，得洗脱液，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得老鹳草低聚糖F。
实施例2
本发明还可是取老鹳草干燥，粉碎成粗粉；取老鹳草粗粉，向老鹳草粗粉中加入蒸馏水，老鹳草粗粉与蒸馏水的重量比为1：11，浸泡23min，84℃超声提取41min，过滤，滤液浓缩至比重为1.11的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为66％，4℃静置8h，6000r/min离心45min，得上清液A和离心沉淀B，上清液A备用，离心沉淀B冷冻干燥，得老鹳草粗多糖粉末C，取老鹳草粗多糖粉末C加入10倍重量的蒸馏水使溶解得老鹳草粗多糖溶液D，向老鹳草粗多糖溶液D中加入其1％重量的酵母，于室温下转速150r/min摇床培养发酵，发酵时间26h，过滤，于滤液中加入Ca(OH)2至滤液pH值为8.1，88℃水浴加热66min同时通入CO2气体，放至室温，过滤，滤液浓缩至比重为1.11的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为80％，4℃静置12h，6000r/min离心35min，取下层沉淀冷冻干燥即得老鹳草多糖E；取上清液A减压回收乙醇浓缩至比重为1.11的浸膏，乙醚萃取，收集下层萃取液，50℃挥去乙醚，依次通过为AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶树脂柱，得洗脱液，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得老鹳草低聚糖F。
实施例3
取老鹳草干燥，粉碎成粗粉；取老鹳草粗粉，向老鹳草粗粉中加入蒸馏水，老鹳草粗粉与蒸馏水的重量比为1：16，浸泡35min，91℃超声提取69min，过滤，滤液浓缩至比重为1.15的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为72.5％，4℃静置11h，6000r/min离心45min，得上清液A和离心沉淀B，上清液A备用，离心沉淀B冷冻干燥，得老鹳草粗多糖粉末C，取老鹳草粗多糖粉末C加入10倍重量的蒸馏水使溶解得老鹳草粗多糖溶液D，向老鹳草粗多糖溶液D中加入其1％重量的酵母，于室温下转速173r/min摇床培养发酵，发酵时间50h，过滤，于滤液中加入Ca(OH)2至滤液pH值为8.1，88℃水浴加热66min同时通入CO2气体，放至室温，过滤，滤液浓缩至比重为1.15的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为80％，4℃静置12h，6000r/min离心35min，取下层沉淀冷冻干燥即得老鹳草多糖E；取上清液A减压回收乙醇浓缩至比重为1.16的浸膏，乙醚萃取，收集下层萃取液，50℃挥去乙醚，依次通过AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶树脂柱，得洗脱液，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得老鹳草低聚糖F。
实施例4
取老鹳草干燥，粉碎成粗粉；取老鹳草粗粉11kg，向老鹳草粗粉中加入蒸馏水121kg，浸泡46min，91℃超声提取97min，过滤，滤液浓缩至比重为1.11的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为66％，4℃静置11h，6000r/min离心45min，得上清液A和离心沉淀B，上清液A备用，离心沉淀B冷冻干燥，得老鹳草粗多糖粉末C，取老鹳草粗多糖粉末C加入10倍重量的蒸馏水使溶解得老鹳草粗多糖溶液D，向老鹳草粗多糖溶液D中加入其1％重量的酵母，于室温下转速173r/min摇床培养发酵，发酵时间26h，过滤，于滤液中加入Ca(OH)2至滤液pH值为8.1，88℃水浴加热66min同时通入CO2气体，放至室温，过滤，滤液浓缩至比重为1.16的浸膏，加入乙醇使乙醇含量达到体积浓度为80％，4℃静置12h，6000r/min离心35min，取下层沉淀冷冻干燥即得老鹳草多糖E；取上清液A减压回收乙醇浓缩至比重为1.21的浸膏，乙醚萃取，收集下层萃取液，50℃挥去乙醚，依次通过AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶树脂柱，得洗脱液，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥得老鹳草低聚糖F。
上述制备的老鹳草多糖及老鹳草低聚糖经蒽酮-硫酸法(常规测定方法，是公知技术)测定，其糖含量均不低于82％。经HPGPC法测定，老鹳草低聚糖的分子量在300-2000之间。
上述仅是给出的几个实施例，在研制中，发明人经反复多次实验均取得了相同或相近似的结果，制备方法科学合理有效，原料丰富，价格低廉，产品应用广泛，具有应用价值，对老鹳草多糖及低聚糖进行反复试验，均取得了满意的技术效果，有关试验资料如下：
老鹳草多糖的免疫活性实验
一.试验材料
1.试验动物：18.5-23g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由郑州大学实验动物中心提供。
2.实验试药：本发明方法制备的老鹳草多糖含量为86.71％，瑞士染液，香菇多糖(湖北广仁药业有限公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，枸橼酸钠，氯化钠，酒石酸钾钠，葡萄糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红等。
二.试验方法
1.老鹳草多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠50只，体重18.5-23g，雌雄各半，随机均匀分成5组。分别灌服小、中、大剂量的老鹳草多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于给药第7天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。于第7天灌胃给药2h后注射5％鸡红细胞，4h后脱颈椎处死，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干；显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表1腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表1可以看出，与空白对照组比，小剂量组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率，可提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P＜0.05)；大、中剂量组及香菇多糖组均能极显著提高吞噬百分率及吞噬指数(P＜0.01)，其中尤以中剂量老鹳草多糖组作用为最强。
2.老鹳草多糖对正常小鼠溶血素形成的影响
取小鼠50只，体重18.5-23g，雌雄各半，随机分为5组。分别灌服小、中、大剂量的老鹳草多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于第7天给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-T1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
3.老鹳草多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠50只，体重18.5-23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的老鹳草多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于第7天给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组两个小鼠脾脏为一例；匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-T1810型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
表2溶血素、溶血空斑形成结果
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表2可以看出，与空白对照组比，小剂量组溶血空斑有显著升高(P＜0.05)，大、中剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血空斑均极显著提高(P＜0.01)。其中尤以中剂量老鹳草多糖组作用为最优。
4.老鹳草多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠60只，体重18.5-23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)，模型组建立完成后，分别灌服老鹳草多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用移液枪吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表3腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
**表示与模型组比P＜0.01
从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，大、中、小剂量多糖组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P＜0.01)，尤以中剂量组效果最好。
5.老鹳草多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
取小鼠60只，体重18.5-23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服老鹳草多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清；以生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀；37℃孵育30min，冰水中终止反应，另设不加补体的空白管作对照；吸取各管上清液于UV-T1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况，结果见表4。
6.老鹳草多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠60只，体重18.5-23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服老鹳草多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组中两个小鼠脾脏为一例，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-T1810型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况，结果见表4。
表4溶血素、溶血空斑形成结果
**表示与模型组比P＜0.01
从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑均显著降低(P＜0.01)，说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，各个剂量老鹳草多糖组及香菇多糖组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以0.2g/kg剂量老鹳草多糖组为最佳。
老鹳草低聚糖抗疲劳作用的实验：
一.试验材料
1.试验动物：18.5-23g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由郑州大学实验动物中心提供。
2.实验试药：本发明方法制备的老鹳草低聚糖含量为89.35％，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒等。
二.试验方法
取体重18.5-23g的昆明种小鼠40只，按体重随机分为4组：正常对照组、低(200mg/kg)、中(500mg/kg)、高剂量(800mg/kg)给药组；每天灌胃给药一次，正常对照组以等量的生理盐水灌胃，连续给药30天，于末次给药后30min，将小鼠放于游泳箱中，水温为25±5℃，鼠尾根部负重5％体重的铅皮，记录小鼠自游泳开始到头部没入水中8s不出水面的时间，即小鼠的负重游泳时间。小鼠在游泳结束恢复24h后，每组小鼠分别眼眶取血，分离血清，用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒分别测定小鼠血清中SOD，MDA值，见表5。
表5老鹳草低聚糖对小鼠负重游泳时间，血清中SOD及MDA的影响
*表示与空白组相比P<0.05；**表示与空白组相比P<0.01
从表5可以看出，老鹳草低聚糖高、低剂量均可显著提高机体SOD活力，降低MDA含量(P<0.05)，中剂量组可极显著提高机体SOD活力，降低MDA含量(P<0.01)，从而表现出老鹳草低聚糖有较好的抗疲劳作用。
以上所述的实施例，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，但并不是对本发明进行限定，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许改动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。