一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及其制备方法和含有该标记物的试剂盒与流程

本发明涉及用于诊断疾病的生物标记物及诊断试剂盒和标记物的制备方法。具体地说是一种可用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及含有该标记物的试剂盒以及该生物标记的制备方法。

背景技术：

冠状动脉狭窄属于冠状动脉病变，是导致冠心病的重要成因。准确评估冠状动脉狭窄程度对于早期发现和干预治疗冠心病具有极为重要的意义。目前，冠状动脉造影技术(CAG)是临床检查冠状动脉病变的金标准，但其检查具有创伤性、费用高、时间长的缺点。近年来，随着CT技术的发展，多排CT冠状动脉成像检查越来越多地应用于临床。多排CT冠状动脉成像技术可显示斑块成分、判断斑块的稳定性和冠状动脉官腔的狭窄程度，其作为一种无创检查方法，对于筛查、早期发现和干预治疗冠心病具有极为重要的意义。但该方法受患者个体体征影响较大。如256-MSCT受患者呼吸影响较大，且患者心率过快或心率变异较大，均可引起官腔周围血管显示粗糙、模糊、从而导致对血管狭窄程度评估不准确。(吴红丽等256层螺旋CT对冠状动脉狭窄的评价)。另外，运动伪影、冠状动脉钙化等难以克服的因素，也常常影响了该评估方法的准确度。

因此，寻找易于操作应用、准确度高且不易受干扰的评估冠状动脉闭塞狭窄的方法成为科研人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的之一是要提供一种准确度高、不受干扰、且检测速度快、使用方便的可检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物。

本发明的目的之二是提供一种制备上述生物标记物的方法。

本发明的目的之三是提供一种新的用于评估冠状动脉闭塞狭窄的生物试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

本发明所提供的用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物，其名称为circ-Sirt1，它包括如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因。

本发明人通过对冠状动脉闭塞狭窄患者的血浆研究，发现了此类患者血浆中的SIRT1基因表达量异常，且其表达量与冠状动脉闭塞狭窄的程度呈负相关性，由此完成了本发明。

本发明所提供的SIRT1基因的制备方法包括以下步骤：

通过设计扩增环状RNA的特异性引物扩增出SIRT1生物标记的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法获得如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因(即circ-Sirt1)及其准确的环化位点；

其具体制备方法如下：

1)提取人血浆中总RNA；

2)在上述提取的总RNA中加入反应液，通过消化、灭活去除总RNA中残留的DNA；

3)将除去残留DNA后的RNA，采用随机引物逆转录成cDNA；

4)引物设计及PCR扩增克隆测序；

设计PCR扩增引物：引物序列circ-Sirt1-F：CTGATGAACCGCTTGCTAT；circ-Sirt1-R：CATGTGAGGCTCTATCCTCC；选取GAPDH为内参基因，作为荧光定量PCR结果的矫正基因，上下游引物序列GAPDH-F：ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC；GAPDH-R：TGAGTCCTTCCACGATACCAA；用上述引物进行PCR扩增反应，反应完后取PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物切胶回收，胶回收试剂盒纯化，后使用T4连接酶将PCR产物连接入pMD18-T载体中，再将连接产物转化进大肠杆菌Top10感受态细胞中，过夜培养，挑取阳性克隆进行DNA测序，测序结果显示SIRT1基因的2-7外显子首尾连接环化，cDNA的核酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因(即circ-Sirt1)。

上述制备方法步骤1)更为具体的方法是：按照以下步骤提取总RNA：

(a)采用EDTA-K₂抗凝管采集外周静脉血样本。采集的血液样本2小时内，4℃2000g离心20min，收集上清液再次4℃10000g离心20min，收集上清分装-80℃保存。

(b)300μl血浆加入900μlTrizol LS，室温下混匀充分裂解5min。

(c)加入0.2ml氯仿:异戊醇(24:2)，振荡15s，室温静置2min。

(d)4℃12000g离心15min，取上清。

(e)加入0.6ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，-20℃静置2h。

(f)4℃12000g离心15min，取上清。

(g)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃12000g离心5min，弃上清。

(h)短暂晾干，加入10μl DEPC处理过的H₂O溶解。

(i)2μl RNA溶液使用Nano Drop2000记录A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩余样品-80℃保存待进行逆转录反应。

上述制备方法步骤2)中，反应总体积为20μl，组分和反应体系如下；

上述制备方法步骤3)中，20μl逆转录反应体系和条件如下：

上述制备方法步骤4)中，20μlPCR扩增circ-Sirt1的反应体系为：

反应条件：95℃2min，95℃15s，61℃1min，40个循环。PCR产物4℃保存。

上述制备方法步骤4)中，用T4连接酶将胶回收纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体上，连接体系如下：

反应条件：16℃连接4h。

本发明所提供的用于评估冠状动脉闭塞狭窄的生物试剂盒，包括有：

血浆总RNA提取试剂组、RNA逆转录试剂组、实时荧光定量PCR试剂组、实时荧光定量PCR引物组、

(a)用于检测SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因的探针；该探针具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因杂交的DNA或反义DNA。

(b)用于检测SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因的扩增引物；该扩增引物上游序列SEQ ID NO：2所示和下游序列SEQ ID NO：3所示。

(c)内参基因扩增引物，该扩增引物上游序列SEQ ID NO：4所示和下游序列SEQ ID NO：5所示。

本发明荧光定量PCR试剂盒适用于目前市场上所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。

本发明的创新性体现在：

1)本发明提供了一种可用于评估患者冠状动脉狭窄程度的生物标记物及检测试剂盒，并由此也为临床提供了一种检测冠状动脉狭窄的新方法。

2)本发明所提供的circ-Sirt1生物标记物及检测试剂盒在用于检测、评估患者冠状动脉狭窄程度时具有灵敏度高、特异性强的突出效果。

3)本发明所设计出的circ-Sirt1基因扩增引物能够灵敏地、特异性地检测冠状动脉狭窄患者血浆中circ-Sirt1表达量，其可准确地评估患者冠状动脉狭窄程度。它为临床冠心病的早期诊断、治疗提供了有效依据。

4)本发明所提供的circ-Sirt1基因还可作为冠状动脉狭窄患者潜在治疗靶点

5)本发明所提供的生物标记物、试剂盒及其检测方法，不受人体体征影响，其准确度更为理想。

附图说明

图1为本发明所制备出circ-Sirt1生物标记物的琼脂糖凝胶电泳图，其中Marker为DM2000，扩增的circ-Sirt1序列长度240bp。

图2为circ-Sirt1环化位点和PCR产物测序结果图。

图3为使用circ-Sirt1引物对受试者血液样本中circ-Sirt1的表达量筛查结果图，其中Nor为健康对照组，AS为实验病例组；

图4为circ-Sirt1简易结构示意图。

具体实施方式

下述实施例仅用于具体阐述实验方法，不应理解为对本发明的限制。本领域的技术人员在本发明的基础上进行的非实质性修改和替换均属于本发明所保护的范围。

试剂：实验中所用的试剂均为市售产品。其中提取血浆或血清样本的试剂盒为Life Technologies公司Trizol LS Reagent试剂盒；逆转录试剂盒为Life Technologies公司qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统；荧光定量反应试剂盒为Life Technologies公司SYBR Green qPCRSuperMix-UDG；pMD18-T载体为TAKARA公司；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1circ-Sirt1基因的制备

1)提取人血浆中总RNA：使用基于Life Technologies公司Trizol LS Reagent试剂抽提。

(a)采用EDTA-K₂抗凝管采集外周静脉血样本。采集的血液样本2小时内，4℃2000g离心20min，收集上清液再次4℃10000g离心20min，收集上清分装-80℃保存。

(b)300μl血浆加入900μlTrizol LS，室温下混匀充分裂解5min。

(c)加入0.2ml氯仿:异戊醇(24:2)，振荡15s，室温静置2min。

(d)4℃12000g离心15min，取上清。

(e)加入0.6ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，-20℃静置2h。

(f)4℃12000g离心15min，取上清。

(g)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃12000g离心5min，弃上清。

(h)短暂晾干，加入10μl DEPC处理过的H₂O溶解。

(i)2μl RNA溶液使用Nano Drop2000记录A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩余样品-80℃保存待进行逆转录反应。

2)总RNA中基因组DNA的去除：使用ThermoFisher公司DNA酶消化。

反应总体积为20μl，组分和反应条件如下；

3)总RNA逆转录：使用Life Technologies公司M-MLV第一链合成试剂。

20μl逆转录体系和反应条件为：

4)引物设计及PCR扩增克隆测序：使用Life Technologies公司SYBR Green qPCRSuperMix-UDG荧光定量PCR反应试剂，在ABI公司7300型PCR仪上进行扩增。

设计PCR扩增引物。引物序列如SEQ ID NO：2所示(即circ-Sirt1-F：CTGATGAACCGCTTGCTAT)或如SEQ ID NO：3所示(circ-Sirt1-R：CATGTGAGGCTCTATCCTCC)；选取GAPDH为内参基因，作为荧光定量PCR结果的矫正基因，上下游引物序列GAPDH-F：ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC(SEQ ID NO：4)；GAPDH-R：TGAGTCCTTCCACGATACCAA(SEQ ID NO：5)；用上述引物进行PCR扩增反应，20μl PCR扩增体系为：2×SYBRGreenqPCRSuperMix-UDG 10μl，cDNA 1μl，上下游引物各0.5μl，补dH₂O至20μl。反应条件：95℃2min；95℃15s，61℃1min，40个循环。取5μl PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳结果见图1；将PCR产物进行割胶回收纯化，后使用T4连接酶将PCR产物连接入pMD18-T载体中，10μl连接体系：纯化的PCR产物7，10×T4Buffer 1μl，pMD18-T载体1μl，T4连接酶1μl，16℃连接4h。连接产物转化进大肠杆菌Top10感受态细胞中，过夜培养，挑取阳性克隆进行DNA测序，测序结果见图2。测序结果显示SIRT1基因的2-7外显子首尾连接环化(circ-Sirt1基因结构如图4所示)，cDNA的核酸序列如SEQ ID NO：1所示的环状RNA(circ-Sirt1)基因。

实施例2采用本发明所述生物标记物对患者冠状动脉的狭窄程度进行检测、评估

血液样本：20例冠状动脉粥样硬化患者血浆受试样本来自河北医科大学第二附属医院心内科住院病例。20例健康者血浆样本来自河北医科大学第二附属医院体检中心。

1)纳入标准

经冠状动脉造影获得影像学证据的初次或再次发生冠状动脉硬化闭塞狭窄的患者。

2)排除标准

健康者：年龄相仿的健康者，无冠心病史，无手术史，血脂、血糖、血压正常，无家族遗传病，无肝肾功能不全；

3)采集的标本分组

(a)实验组n＝5：冠状动脉狭窄程度分级达到Ⅱ级，管腔面积缩小26％～50％；；

(b)实验组n＝10：冠状动脉狭窄程度分级达到Ⅲ级，管腔面积缩小51％～75％；

(c)实验组n＝5：冠状动脉狭窄程度分级达到Ⅳ级，管腔面积缩小76％～100％；

(d)空白对照组n＝20：健康者；

4)血液标本和临床资料的采集

(a)采用EDTA-K₂抗凝管采集外周静脉血样本。采集的血液样本2小时内，4℃2000g离心20min，收集上清液再次4℃10000g离心20min，收集上清分装-80℃保存。

(b)收集样本来源者的性别、年龄、现病史、既往病史、吸烟饮酒史、合并症(高血脂、高血压、糖尿病等)、临床分期、冠状动脉造影各项影像学指标(狭窄段、狭窄程度和长度、远端供血情况等)；

5)提取血浆中总RNA：使用生工生物工程公司TotalRNAExtractor试剂进行提取。

(a)300μl血浆加入900μlTrizol LS，室温下混匀充分裂解5min。

(b)加入0.2ml氯仿:异戊醇(24:2)，振荡15s，室温静置2min。

(c)4℃12000g离心15min，取上清。

(d)加入0.6ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，-20℃静置2h。

(e)4℃12000g离心15min，取上清。

(f)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃12000g离心5min，弃上清。

(g)短暂晾干，加入10μl DEPC处理过的H₂O溶解。

(h)2μl RNA溶液使用Nano Drop2000记录A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩余样品-80℃保存待进行逆转录反应。

6)总RNA中基因组DNA的去除：使用宝生物公司DNA酶消化。

反应总体积为20μl，组分和反应条件如下；

7)总RNA逆转录：使用Promega公司Reverse Transcriptase Kit(M-MLV)进行cDNA第一链合成。

20μl逆转录体系和反应条件为：

8)circ-Sirt1表达量：按照Life Technologies公司实时荧光定量PCR试剂盒配置反应体系，在Rotor Gene 3000Real-Time PCR仪上检测。

20μl反应体系如下：

其中上下游引物分别为：

上游引物：5’-CTGATGAACCGCTTGCTAT-3’

下游引物：5’-CATGTGAGGCTCTATCCTCC-3’

扩增条件：扩增条件：95℃2min；95℃15s，63℃30s，72℃34s，5个循环；95℃15s，61℃1min，40个循环。

根据荧光定量PCR相对定量公式：计算出circ-Sirt1在健康人血浆(Nor)和动脉粥样硬化患者(AS)血浆中表达水平。

结果如图3所示，circ-Sirt1表达水平在0.7～1.3为健康人血浆；circ-Sirt1表达水平在0.7～1.3为冠状动脉狭窄Ⅱ级患者；circ-Sirt1表达水平在0.03～0.09为冠状动脉狭窄Ⅲ级患者；circ-Sirt1表达水平小于0.03为冠状动脉狭窄Ⅳ级患者。

上述检测结果与患者冠状动脉造影结果相比较其结论一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学

<120> 一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及其制备方法和含有该标记物

的试剂盒

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 927

<212> DNA

<213> circ-Sirt1

<400> 1

acaacctcct gttggctgat gagatcatca ctaatggttt tcattcctgt gaaagtgatg 60

aggaggatag agcctcacat gcaagctcta gtgactggac tccaaggcca cggataggtc 120

catatacttt tgttcagcaa catcttatga ttggcacaga tcctcgaaca attcttaaag 180

atttattgcc ggaaacaata cctccacctg agttggatga tatgacactg tggcagattg 240

ttattaatat cctttcagaa ccaccaaaaa ggaaaaaaag aaaagatatt aatacaattg 300

aagatgctgt gaaattactg caagagtgca aaaaaattat agttctaact ggagctgggg 360

tgtctgtttc atgtggaata cctgacttca ggtcaaggga tggtatttat gctcgccttg 420

ctgtagactt cccagatctt ccagatcctc aagcgatgtt tgatattgaa tatttcagaa 480

aagatccaag accattcttc aagtttgcaa aggaaatata tcctggacaa ttccagccat 540

ctctctgtca caaattcata gccttgtcag ataaggaagg aaaactactt cgcaactata 600

cccagaacat agacacgctg gaacaggttg cgggaatcca aaggataatt cagtgtcatg 660

gttcctttgc aacagcatct tgcctgattt gtaaatacaa agttgactgt gaagctgtac 720

gaggagatat ttttaatcag gtagttcctc gatgtcctag gtgcccagct gatgaaccgc 780

ttgctatcat gaaaccagag attgtgtttt ttggtgaaaa tttaccagaa cagtttcata 840

gagccatgaa gtatgacaaa gatgaagttg acctcctcat tgttattggg tcttccctca 900

aagtaagacc agtagcacta attccaa 927

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> circ-Sirt1-F

<400> 2

ctgatgaacc gcttgctat 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> circ-Sirt1-R

<400> 3

catgtgaggc tctatcctcc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH-F

<400> 4

atcttccagg agcgagatcc c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH-R

<400> 5

tgagtccttc cacgatacca a 21