大豆类枯草杆菌蛋白酶基因及应用的制作方法

本发明属分子生物学领域，具体涉及大豆类枯草杆菌蛋白酶基因（Gmsbt1.6-3）及应用。

背景技术：

丝氨酸蛋白酶(Serine protease)是一类功能域以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，通过对蛋白酶原的激活或抑制起调节因子的作用。丝氨酸蛋白酶是重要的蛋白水解酶，约有30个家族，分属于六大类：糜蛋白酶、类枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Ｃ、丙氨酸蛋白酶、阻遏蛋白LexA、三磷酸腺苷依赖型丝氨酸蛋白酶。其中，类枯草杆菌蛋白酶家族，是丝氨酸蛋白酶中最大的家族之一。

类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)广泛存在于细菌、真菌和寄生虫等生物中。这类蛋白酶在结构上具有典型的 Asp/Ser/His 催化结构域，具有广泛的生理学功能。研究表明，类枯草杆菌蛋白酶与病原性细菌、真菌的致病性相关，在真菌孢子形成过程中的蛋白质充分降解及细胞自噬过程等方面起非常重要的作用。木麻黄中的cg12基因在根瘤形成早期受弗兰克氏菌（Frankia）诱导表达，参与粗枝木麻黄和弗兰克氏菌的共生过程。番茄P69B和P69C在丁香假单胞菌（Pseudomonas syrin-gae）感染和水杨酸（Salicylic acid）诱导下表达，P69E和P69F也参与对病原入侵的抵御。钟云等以黄龙病（HLB）侵染的红橘根系为材料，通过转录组测序发现一个类枯草杆菌蛋白酶基因（CICLE-v10027863mg, CcSubtilisin）的表达上调达5.53倍，通过iTRAQ分析发现该基因编码的蛋白水平上调3.9倍，研究表明该基因及其蛋白受 HLB侵染诱导，可能在柑橘宿主与黄龙病菌的互作中起重要作用。但关于大豆中类枯草杆菌蛋白酶基因的功能研究及与疫霉根腐病相互关系方面的研究目前还未有报道。

本研究通过基因工程技术，从大豆中分离克隆了大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，并构建该基因的植物过表达载体和RNAi表达载体，通过对大豆植株的转化，验证新基因Gmsbt1.6-3的功能，为该基因的利用奠定了基础，为抗大豆疫霉根腐病新品种的培育提供基因资源和基础材料。

技术实现要素：

本发明的目的是为提高植物的抗病性，而提供一种大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3。

大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，它的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

它来源于大豆根系突变体材料M18；

大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3在培育抗疫霉根腐病植物品种的应用；

所述的疫霉根腐病为大豆疫霉根腐病；

本发明提供了大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，它是从大豆根系突变体材料M18中分离克隆的大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，并构建该基因的植物过表达载体和RNAi表达载体，通过对大豆植株的转化，转化植株具有抗疫霉根腐病的功能，为抗大豆疫霉根腐病新品种的培育提供基因资源和基础材料。

附图说明

图 1 Gmsbt1.6-3基因核心片段的 PCR 扩增电泳图； M: DNA 标准分子量； 1：PCR 产物；

图2 Gmsbt1.6-3蛋白三维结构模拟；

图3 Gmsbt1.6-3蛋白系统进化树；

图4 植物过表达载体的构建；A.植物表达载体pCAMBIA3301的双酶切；B. 目标片段的PCR扩增；

图5 植物过表达载体的构建及验证，A.双酶切验证；B. PCR验证；

图6 植物过表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的T-DNA区结构；

图7 植物干扰表达载体的构建；A. 植物表达载体pCAMBIA3301的双酶切；B. 目标片段的PCR扩增；

图8 植物干扰表达载体的构建及验证；A. 双酶切验证；B. PCR验证；

图9 植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的T-DNA区结构；

图 10 农杆菌介导的大豆遗传转化；A：萌发阶段； B：浸染后共培养阶段；C：浸染后筛选培养阶段；D：伸长培养阶段；E：生根培养阶段；F-G：移栽培养阶段；

图11 T0代转化植株的PCR检测；A.筛选标记基因bar；B. 35S启动子；C. NOS终止子；

图12 T1代转化植株的PCR检测；A.筛选标记基因bar；B. 35S启动子；C. NOS终止子

M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-3：转基因阳性植株OEA1-OEA3；4-7：转基因阳性植株IEA1-IEA4；

图13 T2代转化植株的PCR检测；A.筛选标记基因bar；B. 35S启动子；C. NOS终止子

M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-3：转基因阳性植株OEA1-OEA3；4-7：转基因阳性植株IEA1-IEA4；

图14 T2代Southern blot检测；M：DNA分子量标准；P:阳性对照;CK:阴性对照(未经转化的大豆植株);1-3：转基因阳性植株OEA1-OEA3；4-7：转基因阳性植株IEA1-IEA4；

图15 Gmsbt1.6-3基因在转植物过表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的植株中的相对表达量；

图16 Gmsbt1.6-3基因在转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的植株中的相对表达量。

具体实施方式

实施例1基因Gmsbt1.6-3的 cDNA 序列的克隆

大豆（Glycine max）品种吉农18，大豆根系突变体材料M18，由吉林农业大学植物生物技术中心提供。

基因Gmsbt1.6-3的 cDNA 序列的克隆

使用TAKARA公司生产的RNAiso试剂盒从大豆M18苗期根系组织提取总RNA，以反转录的cDNA为模板，根据RNA-seq测序结果序列，设计特异引物sbt，采用RT-PCR方法扩增目的片段并测序，试验所需PCR扩增引物见表1。

表1 PCR引物序列

根据前期筛选得到的Gmsbt1.6-3序列片段设计扩增长度为764bp 的特异引物sbt，经PCR 扩增后，得到一条与预期大小相同的核酸条带（图1），将 PCR 产物克隆至 PMD18-T 载体后进行测序。测序结果与 NCBI中数据进行比对，未找到与目的基因相一致的已知序列，初步判断克隆得到的基因为未知的新基因。通过比对发现，目标基因与序列号为XM_003553760.3的序列相比同源性最高，在98%覆盖度水平上的一致性达到 98%，且与其他的Glycine max subtilisin-like protease SBT1.6基因序列比对相似性较高，推测目标基因是Glycine max subtilisin-like protease SBT1.6家族的成员之一，因此为该目标基因命名为Gmsbt1.6-3。

实施例2Gmsbt1.6-3基因的生物信息学分析及系统进化树的构建

将Gmsbt1.6-3基因全序列连入克隆载体pMD18-T Vector，对重组载体进行测序后进行生物信息学分析，测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。

利用在线分析程序ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对新基因序列进行可能的开放阅读框分析，通过 DNAMAN 软件将新基因ORF翻译成氨基酸序列；利用ProtParam软件(http//www. web. expasy. org / protparam/ ) 预测蛋白质序列理论参数；利用SWISS-MODEL在线软件构建Gmsbt1.6-3基因的蛋白质立体结构；利用Protscale软件( http: / /web. expasy. org / /protscale /预测蛋白的亲疏水性。

在 NCBI 网站中下载所有已知sbt基因序列，通过 DNAMAN 软件对蛋白质进行多重比对，分析同源性，构建系统进化树。

通过在线分析程序 ORF FINDER对新基因Gmsbt1.6-3的核酸序列进行分析，并预测理论上的编码区的位置。分析结果表明，Gmsbt1.6-3基因理论上的开放阅读框为591可编码197个氨基酸残基。

ProtParam软件分析其相对分子量为19731.98，理论等电点(PI) 为4.64，正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys) 为11，负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为17，分子式为C₈₅₉H₁₃₂₆N₂₃₄O₂₈₀S₁₀。氨基酸组分析表明: 甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）含量较高分别占14.3%、12.2%、11.2%。总平均疏水指数Grand average of hydropathicity (GRAVY)为0.002。

利用ProMod version 3.70 软件构建Gmsbt1.6-3蛋白3D 立体结构图，其中含有类枯草杆菌蛋白酶家族典型的 Asp/Ser/His 催化结构域（图2）。

搜索NCBI网站上植物已知的全部大豆sbt基因的氨基酸序列，利用DNAMAN软件建立Gmsbt1.6-3蛋白系统进化树（见图2）。使用 Neighbor-Joining 统计法，根据各Gmsbt1.6-3蛋白的序列同源性将进化分析结果分为三组，蛋白Gmsbt1.6-3与大豆Gmsbt1.6-1、Gmsbt1.6-2的同源性最高，遗传距离最近，推测Gmsbt1.6-3有可能是大豆Gmsbt1.6基因家族中还未发现的新基因成员。

实施例3植物表达载体的构建及遗传转化

利用限制性内切酶BglII和PmlI对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，利用Seamless Assembly Clonng Kit试剂盒，将克隆得到的Gmsbt1.6-3全长基因替换3301上原有的GUS基因。构建以Bar为筛选标记，CaMV35S启动子启动目标基因Gmsbt1.6-3的pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3植物过表达载体。

利用BglII和PmlI限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和2029bp的GUS基因片段；利用引物sbt-over对克隆载体Pmd18-T- Gmsbt1.6-3进行PCR扩增，得到大小591bp的Gmsbt1.6-3基因ORF全长片段（图4），利用T4连接酶将Gmsbt1.6-3基因ORF全长片段连入植物表达载体pCAMBIA3301。

对构建成功的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3进行PCR和双酶切鉴定，均得到与预期大小相符的Gmsbt1.6-3基因ORF全长片段591bp（图5），对其进行测序，测序结果正确，说明植物过表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3构建成功（图6）。

采用同样方法，将3301上原有的GUS基因替换为Gmsbt1.6-3正义+内含子+Gmsbt1.6-3反义片段，构建pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植物干扰表达载体。

利用BglII和PmlI限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和2029bp的GUS基因片段；利用引物sbtZ、SSR、sbtF分别对克隆载体Pmd18-T-Gmsbt1.6-3和Pmd18-T-SSR进行PCR扩增，得到大小为591bp的目的基因正义片段、205bp的SSR内含子片段、和591bp的目的基因反义片段（图7），利用无缝克隆连接酶将Gmsbt1.6-3正义片段、内含子SSR和Gmsbt1.6-3反义片段同时连入植物表达载体pCAMBIA3301，得到植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi。

对构建成功的植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi进行双酶切和PCR鉴定。用BglII和PmlI双酶切该质粒，得到一条大小约为1387bp的sbtZ-SSR-sbtF干扰片段；分别对Gmsbt1.6-3正义片段、反义片段、SSR内含子、进行特异性扩增，得到的扩增条带都与预期大小相符，得到大小为591bp的Gmsbt1.6-3正义片段、205bp的SSR内含子片段、591bp的Gmsbt1.6-3反义片段（图8）。对其进行测序，测序结果正确，说明植物干扰表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3-RNAi构建成功（图9）。

将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3和植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi，采用农杆菌介导的方法转化大豆材料M18。

实施例4转化植株的分子检测

采用改良的CTAB法，从大豆叶片中提取基因组DNA，将其作为模板，以载体质粒为阳性对照，以未转化植株为阴性对照，分别以筛选标记基因bar、35S启动子和NOS终止子的特异性引物（表1）进行PCR扩增。

对PCR检测为阳性的转基因植株，进行Southern杂交检测。以纯化的筛选标记基因bar为模板制备探针，采用随机引物标记法进行标记，杂交及检测的其他步骤均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitII试剂盒的说明书操作。

以大豆突变体材料M18作为受体，将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3和植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi采用农杆菌介导的方法转化大豆子叶节，经萌发培养、恢复培养、共培养、选择培养、伸长培养、生根、炼苗、移栽培养，获得抗性转化植株，并在温室内进行培养和加代。

通过遗传转化，共获得抗性苗10株，其中4株为转植物过表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的转化植株，对筛选标记Bar基因、35S启动子、NOS终止子三个外源片段进行PCR检测，均检测为阳性的有3株，分别标号OEA1-OEA3（OEA，over expression- agrobacterium-mediated method）。6株转植物干扰表达载体pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3-RNAi的抗性植株中，均检测为阳性的有4株，分别标号IEA1-IEA4（IEA，interference expression- agrobacterium-mediated method）（图11）。

将检测为阳性的植株在人工气候室内培养至成熟，收获籽粒，在温室内进行加代，对T1代植株进行PCR检测，Gmsbt1.6-3基因过表达植株OEA1-OEA3、干扰表达植株IEA1-IEA4的T1代植株均检测到了筛选标记基因bar、35S启动子和NOS终止子（图12）。

将检测为阳性的T1代植株在人工气候室内培养至成熟，收获籽粒，在温室内进行加代，对T2代植株进行PCR检测，Gmsbt1.6-3基因过表达植株OEA1-OEA3、干扰表达植株IEA1-IEA4的T2代植株均检测到了筛选标记基因bar、35S启动子和NOS终止子（图13）。

对T2代转基因阳性植株进行southern杂交检测，选用HindⅢ限制性内切酶，对外源筛选标记基因bar进行Southern杂交分析，检测外源基因在大豆M18的整合情况，进一步验证转化事件的准确性。杂交结果显示PCR检测为阳性的7株转基因植株均有明显的杂交信号，且杂交带的大小、位置互不相同（图14），说明外源基因bar已经整合到大豆的基因组中，且整合形式均为单拷贝。

实施例5接菌处理后对大豆Gmsbt1.6-3基因相对表达量的影响

采用“下胚轴侵染法”对转化阳性材料进行疫霉根腐病的接菌处理，鉴定标准依据大豆种质资源数据质量标准进行。选择生长初期的大豆植株，对生真叶长出至完全平展后，接种大豆疫霉根腐病病原菌，接种后对伤口进行保湿处理7天，温度控制在20-25℃、湿度保持在90%以上。接种后5天，提取大豆的根部组织总 RNA，对目的基因Gmsbt1.6-3进行相对表达水平的检测。

温室内种植T2代转基因阳性株系OEA1-OEA3和IEA1-IEA4，幼苗期通过“下胚轴侵染法”接种大豆疫霉根腐病病菌。接菌后进行保湿处理，环境温度控制在20-25℃，湿度保持在90%以上，接菌处理5天后，提取根部组织总RNA，对目的基因Gmsbt1.6-3进行Real-time PCR测定。采用2^-ΔΔCT法计算数据，分析目的基因的相对表达量。

在大豆根部中，设定对照植株M18未侵染疫霉根腐病菌的Gmsbt1.6-3表达量为1，其他转化材料及其他处理的表达水平都对比于这个设定值。如图15所示，未接菌条件下，转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的阳性植株OEA1-OEA3的Gmsbt1.6-3基因相对表达量分别为2.56、3.0467、2.81，都明显高于对照M18。接种大豆疫霉根腐病病原菌5天后，各植株的Gmsbt1.6-3基因相对表达量有显著增加，Gmsbt1.6-3基因在对照M18植株中的相对表达量上升到了2.8867，在转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的阳性植株OEA1-OEA3中，分别为5.2、6.123、5.243。说明Gmsbt1.6-3基因受大豆疫霉根腐病病原菌侵染诱导表达。

未接菌条件下，与对照植株M18相比，转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的阳性植株Gmsbt1.6-3基因的相对表达量都受到了明显的抑制，IEA1-IEA4植株中Gmsbt1.6-3基因分别被抑制了37.33%、57.67%、50.67%、33.67%。接种大豆疫霉根腐病病原菌5天后，各植株的Gmsbt1.6-3基因相对表达量有显著增加，对照M18植株中该基因的相对表达量上升到了2.563，转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植株的干扰效果受病原菌侵染影响有所下降，Gmsbt1.6-3基因在阳性植株IEA1-IEA4中分别被抑制了23%、37%、22.667%、16%，进一步说明Gmsbt1.6-3基因受大豆疫霉根腐病病原菌侵染诱导表达（图16）。

实施例6转化植株的抗病性鉴定

采用“下胚轴侵染法”对转化阳性材料进行疫霉根腐病的接菌处理，鉴定标准依据大豆种质资源数据质量标准进行。选择生长初期的大豆植株，对生真叶长出至完全平展后，接种大豆疫霉根腐病病原菌，接种后对伤口进行保湿处理7天，温度控制在20-25℃、湿度保持在90%以上。接种后5天，调查转基因株系和对照受体品种的死亡率。株系或品种有 70%或以上的植株死亡则为感病(susceptible，S)；70%或以上植株正常生长则为抗病(resistant，R)；31%-69%植株死亡的株系或品种为中抗 (moderately resistant，MR)。

使用假设测验对 T2代转基因阳性株系OEA1-OEA3和IEA1-IEA4疫霉根腐病抗病性鉴定所得数据进行分析，统计死亡率鉴定结果表明，转基因阳性株系OEA1-OEA3对疫霉菌 1 号生理小种抗性水平较受体对照品种显著提高，其中OEA2株系的接种死亡率最低，为30%，达到了抗性水平；OEA1、OEA3株系的抗性水平同对照CK都一样，都是中感水平，但接种死亡率分别为36.67%和40%，显著低于对照，说明转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的阳性植株OEA1-OEA3对大豆疫霉根腐病根腐病的抗性得到了显著的提高（表2）。

相反的，转基因阳性株系IEA1-IEA4对疫霉菌 1 号生理小种抗性水平较受体对照品种显著降低，其中IEA3株系的接种死亡率最高，为76.67%，其次是IEA2为73.33%，都达到了感病水平；IEA1、IEA4株系的抗性水平同对照CK都一样，都是中感水平，但接种死亡率分别为63.33%和66.67%，显著高于对照，说明转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植株IEA1-IEA4对大豆疫霉根腐病根腐病的抗性受到了明显的抑制。

本试验采用RT-PCR的方法，从大豆苗期根系的cDNA中成功分离克隆了一个新的大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，该基因在结构上具有类枯草杆菌蛋白酶家族典型的 Asp/Ser/His 催化结构。研究表明，类枯草杆菌蛋白酶在结构上虽然有相似性，但在其表达和功能上存在差异。在拟南芥中，SDD1在气孔前体细胞中强烈表达，与调节气孔密度的信号传导有关；ALE1基因在种子萌发过程中特异表达，与拟南芥胚发育过程中的角质层形成和表皮分化时信号肽的产生有关；AIR3在侧根形成过程中表达，参与调控侧根原基数量；Ara12在角果、茎及叶片中表达，参与植株形态建成。在番茄中，P69A 在除根和花之外的所有植物器官中表达且与细胞延伸相关；P69D除不在根中表达外，在其他器官中都有表达，与细胞分裂、延伸相关。大豆中，SCS1在种皮中表达量最高，与厚壁组织的分化有关；SLP-1在处于发育期种子的种皮中表达，而SLP-2主要在发芽种子的子叶中表达，这两个基因都参与种子萌发。粗枝木麻黄中，cg12在根瘤形成早期受弗兰克氏菌（Frankia）诱导表达，参与粗枝木麻黄和弗兰克氏菌的共生过程。

本研究通过在大豆植株中对Gmsbt1.6-3基因进行过量表达和干扰表达，鉴定新基因功能。接种大豆疫霉根腐病病原菌，进行荧光定量PCR分析结果表明，大豆类枯草杆菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3受大豆疫霉根腐病病原菌侵染诱导表达，该基因在大豆抗病反应中的作用及调控机制有待于进一步研究与验证。

<110> 吉林农业大学

<120> 大豆类枯草杆菌蛋白酶基因及应用

<160> 1

<210> 1

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

aagtggaagg gccactgcgt tgctgctaaa gactttcccc ccacctcctg caaccggaaa 60

ctcatcggag ctcgctactt ctgcgctggc tacgaagcca ccaacggcaa aatgaacgac 120

actttggagt cccgttcccc gagagactcc gacggtcacg gcacccacac ggcttccatc 180

gccgccggca ggtacgtctt cccggcctcc accatgggct acgccaaagg aatgggcgcc 240

gggatggctc ccaaggctcg cctcgccgtc tacaaggtct gctggaacgc cggctgctac 300

gactccgaca tcctcgccgc gttcgacgcc gccgtggccg acggcgtcga cgtggtcacc 360

tcagcgtcgg gggcgtggtg gtgccctacc acctcgacgt catcgccgtc ggggccttcg 420

gagcctccga ggctggcgtc ttcgtgtctg gcctcggcgg gtaacggcgg tcccggcggc 480

ctcacggtga ccaatgtggc accctgggtc accactgtgg gcgccggaac cttagacaga 540

gatttcccgg cggatgttgt gctggggaac ggcaaggtga ttggcgggat gagtgtgtac 600

ggtggaccgg gtctgactcc aggtcggctc tatcctctgg tgtatgcggg ttcggatggt 660

tactcttcct ctctttgctt ggaagattcg ttggatccct agtctgtgtc aaaaaagatt 720

aatgtttgtg gtcgaggcgt caattcaaga gcagccgctt aaaa 764