一种全蝎酶解液超滤物制备工艺及其用途的制作方法

本发明涉及一种全蝎酶解超滤物(＞10kda,相对分子量)、制备工艺及其抗肺癌药物中的应用，属于中药提取工艺及其应用技术领域。

背景技术：

目前在全球范围内肺癌已成为最为棘手的一种恶性肿瘤。全世界近五十年，肺癌的发病率男性增加了10-30％，而女性增加了3-8倍。，全球每年新增肺癌患者120万人。在中国目前肺癌发病率年增26.9％，预计到2025年我国肺癌病人将达到100万人，成为全球第一肺癌大国。肺癌发病率逐年上升的一个很重要的原因是吸烟和环境污染，因此可以预见在全国城市空气质量没有明显改善的形势下肺癌的发病率很难降下来，因此研制预防和治疗肺癌的新药就成为了经济和社会和谐发展的紧迫任务。本研究根据全蝎所含有效成分的性质与特点研制成功了最适剂型，其酶解液冻干粉和超滤物(＞10kda)部分体内外药理实验均证实对肺腺癌有明显的抑制作用，对其进行完善，补充相关材料即可按新药申报，投入市场后按20％肺癌患者使用该药年全国销售额可达到60亿元左右，经济效益显著。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种全蝎酶解液超滤物(＞10kda,相对分子量)。本发明制得的全蝎酶解液超滤物(＞10kda,相对分子量)能显著地抑制体外肺腺癌a549细胞株和体内荷lewise肺癌小鼠种植瘤的生长。

本发明的目的在于提供一种全蝎酶解液超滤物(＞10kda)的制备工艺及制备的产品在抗癌药物中的应用。

本发明采用以下技术方案：

一种全蝎酶解液超滤物(＞10kda,相对分子量)，其特征在于，它是由以下步骤的方法制备得到：

(1)将活的野生全蝎用清水漂洗，沥干，然后放入冷冻室冷冻后匀浆，然后在冷阱温度-60℃，室温真空状态下冷冻干燥至粉末得全蝎冻干粉；

(2)取步骤(1)制得的全蝎冻干粉400克，加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶各2000u，在温度40℃，酶解时间3h，酶解ph8.5的条件下酶解，的酶解液。

(3)将步骤(2)所得的全蝎酶解液,用公称分子量截留值大于10kda的超滤组件进行超滤，得＞10kda的酶解超滤物。

上述步骤(1)中冷冻室温度为-18℃～-60℃，冷冻时间为2-72小时。

上述步骤(1)中冷冻干燥时间为12-24小时，真空度为10pa，冷阱温度为-60℃。

上述步骤(2)中胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶用量各2000u，酶解温度40℃，酶解时间3h，酶解ph8.5。

上述步骤(3)中超滤膜为公称分子量截留值大于10kda的超滤组件。

上述全蝎酶解液超滤物(＞10kda相对分子量)的制备工艺，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)将活的野生全蝎用清水漂洗，沥干，然后放入冷冻室冷冻后匀浆，然后在冷阱温度-60℃，室温真空状态下冷冻干燥至粉末得全蝎冻干粉；

(2)取步骤(1)制得的全蝎冻干粉400克，加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶各2000u，在温度40℃，酶解时间3h，酶解ph8.5的条件下酶解，的酶解液。

(3)将步骤(2)所得的全蝎酶解液，根据酶解液体积，加入4倍量无水乙醇，-20℃放置过夜；4℃，10000rpm，低温离心10min，得沉淀物，并对其冷冻干燥，并利用改良lowry法测定蛋白质含量。适量蒸馏水溶解冻干粉，8μm滤膜过滤，0.1-0.2mpa压力下过10kda超滤膜，得到分子量＞10kda段，冷冻干燥备用。

上述的全蝎酶解液超滤物(＞10kda相对分子量)在体内外抑制肺腺癌生长中的应用。实验结果表明，本发明制备的全蝎酶解液超滤物(＞10kda相对分子量)，对体外a549肺腺癌细胞株的生长有极显著的抑制作用；体内对荷lewise肺癌小鼠种植瘤的生长有极显著的抑制作用。

本发明所有实验中使用的冷冻干燥机型号为lgj-18a型(北京四环仪器设备有限公司)，超滤器型号wt6002g(上海膜速)，全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎buthusmartensiikarsch。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的全蝎发酵液超滤物(＞10kda)对体、内外肺腺癌的生长具有明显的抑制作用。酶解液超滤物蛋白类成分(相对分子质量﹥10kda的活性部分)具有显著的抑制作用，500μg/ml浓度的抑制率达到了87％，ic50为204.7μg/ml。体内对荷瘤小鼠(lewise肺癌)的抑制率达到63.01％(50mg/kg体重，高剂量组)，而阳性对照药顺铂达39.04％(2mg/kg)。从以往的研究经验来看中药粗提混合物的体内抗肿瘤活性能达到西药对照药的10％左右就是较好的结果了，而我们的研究远远突破了这一界限，这一结果充分地证明全蝎酶解物冻干粉蛋白类成分具有较强的抗肺腺癌的活性，而且主要物质基础是蛋白多肽类物质，可以吸入粉雾剂给药，可发挥更高的药理活性。

(2)本发明的全蝎酶解物液超滤物及制备工艺简单合理。

附图说明：

图1是各药物作用24h后肺腺癌a549细胞株的生存状态图。

标号1-1,1-2,1-3,1-4,1-5分别代表＜3kda段蛋白质浓度由低到高；

标号2-1,2-2,2-3,2-4,2-5分别代表3kda-10kda段蛋白质浓度由低到高；

标号3-1,3-2,3-3,3-4,3-5分别代表＞10kda段蛋白浓度由低到高。

图2是阳性药物和阴性药物作用24h后肺腺癌a549细胞株的生存状态图。

图3是各组小鼠lewis肺癌皮下移植瘤外观图，从左至右分别为模型组、ddp组、全蝎酶解液超滤物(＞10kda)高剂量组、中剂量组、低剂量组。

图4是各组小鼠肿瘤体积增长曲线图。

图5是各移植瘤形态学变化(he400×)图，从左至右分别为模型组、ddp组、全蝎酶解液超滤物(＞10kda)高剂量组、中剂量组、低剂量组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1全蝎酶解液超滤物及其制备工艺

采用以下方法制备一种全蝎酶解液超滤物(＞10kda，相对分子量)。

(1)将活的野生全蝎用清水漂洗，沥干，然后放入冷冻室冷冻后匀浆，在冷阱温度-60℃，室温真空状态下冷冻干燥至粉末得全蝎冻干粉；

(2)取步骤(1)全蝎冻干粉400克，加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶各2000u，在温度40℃，酶解时间3h，酶解ph8.5的条件下酶解，所得酶解液备用；

(3)蛋白质沉淀及超滤分段

根据酶解液体积，加入4倍量无水乙醇，-20℃放置过夜；4℃，10000rpm，低温离心10min，得沉淀物，并对其冷冻干燥，并利用改良lowry法测定蛋白质含量。适量蒸馏水溶解冻干粉，8μm滤膜过滤，0.1-0.2mpa压力下分别过hps-10超滤膜和hps-3超滤膜(上海摩速科学器材有限公司生产)，得到分子量＞10kda、3-10kda、＜3kda三段，冷冻干燥备用。

(4)蛋白质含量的测定

利用改良lowry法测定蛋白含量，按照文献以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得y＝1.6916x+0.0067(r＝0.9992)，按上述方法计算得醇沉冻干粉蛋白质含量为89.4％。

实施例2生物学试验

以下通过实验进一步阐述本发明全蝎酶解物液超滤物的有益效果。本发明全蝎酶解物液超滤物具有下列有益效果，但不应将此理解为本发明全蝎酶解物液超滤物仅具有下列有益效果。

实验一、各分子量段全蝎蛋白对a549抑制率测定

肺腺癌细胞株(a549)用含10％的新生牛血清、1％的青链霉素的rpmi-1640培养基于37℃，5％co2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔100μl，于5％co2，37℃贴壁24h，然后分别加入不同浓度(0,100,200,300,400,500μg/ml)的全蝎酶解多肽溶液，每个浓度设5个平行孔，然后细胞在37℃、5％co2培养箱中继续培养。24h后，每孔加入5mg/mlmtt溶液20μl于培养箱内避光反应4h。吸去上清液，加入100μldmso，用酶标仪于492nm测定od值，计算药物对细胞的抑制率。

mtt法测定抑制率，采用spss19.0统计软件计算ic50，并以p＝0.01、p＝0.05为检验水准，单因素方差分析比较组间差异的显著性。结果见表1。

表1.mtt法测定全蝎蛋白各分子量段对肺腺癌a549的抑制率

注：抑制率＞40％视为有效；与空白对照组比较**p＜0.01、*p＜0.05；阳性对照药物为100μg/ml的顺铂，抑制率为87.35％。

由表1可见，＜3kda部分全蝎蛋白对肺腺癌a549细胞无抑制作用；3kda-10kda部分抑制作用不明显；＞10kda部分具有显著的抑制作用，ic50为204.7μg/ml。

各药物作用24h后肺腺癌a549细胞株的生存状态图，见图1。

由图1可知，各药物作用24h后于镜下观察细胞状态，＞10kda段全蝎蛋白对肺腺癌a549细胞作用最为明显，各浓度下均有不同程度的细胞形态改变，包括细胞变圆脱落，且随着浓度的增加细胞形态改变越明显；＜3kda段无明显作用；3kda-10kda段较高浓度下细胞呈现部分变圆脱落，而较低浓度下无明显变化。

阳性药物和阴性药物作用24h后肺腺癌a549细胞株的生存状态，见图2。

由图2可见，阳性药物组细胞变圆脱落；阴性对照组细胞状态良好，无病变。

实验二、全蝎酶解液超滤物(＞10kda)的蛋白多肽体内抗肿瘤作用研究

体外研究表明全蝎酶解液超滤后各分子量段对肺腺癌细胞a549均具有一定的抑制作用，＞10kda段抑制作用最为显著，因此本次实验在小鼠体内实验的基础上进一步研究全蝎酶解液超滤物(＞10kda)对小鼠lewis肺癌移植瘤的生长抑制作用。

将小鼠lewis肺癌细胞置于高糖dmem培养基中(含10％胎牛血清，1％的青霉素和链霉素)，在37℃、5％co2培养箱中培养。当细胞汇合率达90％时，0.25％胰酶消化，收集细胞，离心去上清，加入适量pbs吹打，使细胞混悬于pbs中，用台盼蓝染色，活细胞数量大于95％，用细胞计数板进行计数，并调整细胞浓度为2×107个/ml。将保存于-20℃的matrigel基质胶放入4℃冰箱中过夜融化，将已融化的matrigel基质胶与2×107个/ml浓度的lewis细胞悬液按1:1比例混匀，这一操作在冰浴中进行。

将lewis肺癌细胞与matrigel基质胶混悬液按0.2ml/只接种于小鼠右腋下。接种11d左右后，将lewis肺癌荷瘤小鼠脱颈椎处死，置于75％酒精中浸泡2min消毒。在超净工作台中，从小鼠右腋下剥取肿瘤组织，去除表面的纤维包膜及脂肪组织，用生理盐水中清洗数次，并将肿瘤组织剪成1mm×1mm大小的肿瘤块，使用接种针，采用插块法接种于小鼠右腋下，一次性接种55只。接种第二天后，称重随机分为5组，每组11只，并给于药物治疗。荷瘤对照组：0.2ml生理盐水腹腔注射，1次/d；化疗(ddp)组：2mg/kg，于第2d进行腹腔注射药物，隔日1次；全蝎酶解液超滤物(＞10kda)高剂量组：50mg/kg，腹腔注射给0.2ml，1次/d；中剂量组：25mg/kg，腹腔给药0.2ml，1次/d；低剂量组：12.5mg/kg，腹腔给药0.2ml，1次/天。连续给药14d后，第15d处死全部小鼠，进行相关指标检测。

实验结果表明：

1、动物的一般情况

在接种lewis肺癌细胞后1-5天的小鼠饮食、活动等无明显异常，毛色鲜亮、活泼好动。第6天各组小鼠右腋下出现可触摸的较小硬结节，之后便快速生长，第9天后肉眼可见肿瘤块隆起，用手触摸比较柔软。小鼠先后出现毛发蓬乱、进食饮水减少、活动度下降、反应迟钝等状况。第9-14天ddp组和高剂量组小鼠右腋下肿瘤块较模型组稍小，毛色、活动状况也较模型组好，中剂量组和低剂量组右腋下肿瘤与模型组无明显差别，毛色和活动情况较模型组好。

2、各组小鼠移植瘤外在形态

各组小鼠lewis肺癌皮下移植瘤外观见图3。

由图3可见，小鼠腋下移植瘤大多为球型状、结节状，质地细腻脆弱，剖面呈白色鱼肉状，部分中间有液化坏死组织。对照组移植瘤表面血管网丰富，部分移植瘤侵袭至胸骨，与胸壁粘连，难分离；全蝎酶解液超滤物(＞10kda)高剂量组和ddp组移植瘤较模型组小，形状规则，表面血管较少，与周边组织粘连较轻，易与机体剥离，但中剂量和低剂量组与模型组差异不明显。

3、各组小鼠移植瘤生长的影响

各组小鼠肿瘤增长体积增长变化曲线，见图4。

由图4可见模型组小鼠肿瘤体积一直高于其他组别，低剂量组较模型组稍低，其次为中剂量组，阳性药物组和高剂量组肿瘤体积明显低于模型组，结果表明，全蝎酶解液超滤物(＞10kda)对lewis肺癌小鼠移植瘤生长具有抑制作用。

4、各组小鼠移植瘤的质量及抑瘤率

全蝎酶解液超滤物(＞10kda)高剂量组对小鼠lewis肺癌移植瘤具有显著的抑制作用，中剂量组和低剂量组抑制作用不明显，见表2。

表2全蝎酶解液超滤物(＞10kda)对移植瘤生长抑制作用

注：**：p＜0.01；*：p＜0.05，与模型组相比

5、各组小鼠脾脏指数及胸腺指数

实验结束时，ddp组的脾脏指数及胸腺指数均明显低于模型组，而全蝎酶解液超滤物(＞10kda)组的脾指数和胸腺指数无明显差异，说明其对本小鼠肿瘤模型的脾和胸腺的影响较小。

表2各组小鼠的胸腺指数和脾指数

注：**：p＜0.01；*：p＜0.05，与模型组相比

6、各组小鼠组织病理学检测

各组小鼠组织病理学检测情况，见图5。

由图5可见，组织病理学检测(he)结果显示，模型组瘤细胞排列紊乱，大小不一，核大深染，核分裂相多见，间质血管增生，瘤组织中有大量红色血管。给药各组瘤组织细胞形态结构得到一定程度改善，间质血管明显减少，瘤细胞出现不同程度的退变。

从以往的研究经验来看中药粗提混合物的体内抗肿瘤活性能达到西药对照药的10％左右就是较好的结果了，而我们的研究远远突破了这一界限，这一结果充分地证明全蝎酶解物冻干粉蛋白类成分具有较强的抗肺腺癌的活性，而且主要物质基础是蛋白多肽类物质，可以吸入粉雾剂给药，可发挥更高的药理活性。