一种甘蔗糖转运蛋白ShSWEET1基因及其应用的制作方法

本发明生物技术领域，涉及一种甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因及其应用。

背景技术：

甘蔗(saccharumofficinaruml.)属于禾本科、蜀黍族、甘蔗亚族、甘蔗属，一年生或多年生宿根草本植物，与玉米和高粱同源，原产于新几内亚或印度的热带、亚热带地区，甘蔗作为c4植物是将太阳能转化为化学能最有效的植物之一。甘蔗植株光饱和点高，二氧化碳固定能力强，光合速率高，光合强度大，生物量高，含糖量十分丰富同时也可以作为生物燃料。在过去30多年，由于甘蔗可作为一种优越的潜在替代性可再生能源得到全球的重视。碳分配是植物光合作用能量和物质分配的关键过程。一般情况下，c4植物光合作用和碳同化发生在叶肉细胞的叶绿体和维管束鞘细胞。光合源细胞将光合作用固定的碳转换成糖或糖的衍生物然后沿着韧皮部长距离运输到远端库细胞中并在库细胞中消耗和储存(poorterandvillar,1997)。通常情况下活细胞消耗35％-40％的糖用于提供能量供细胞生长(hallandrao,1999)，包括细胞扩增、分裂、分化、养分吸收和维持的植物发育。有些作为细胞的代谢中间体，如单糖，氨基酸，有机酸等，多余的糖储存在液泡或者可再利用的多聚物上(如淀粉体)，或者构成生物结构物质(如纤维素，半纤维素和木质素)。

甘蔗的高能量转换能力使其成为一种前景很好的高产饲料作物；同时甘蔗制糖过程中产生的糖蜜更是优质的猪、牛等动物饲料，而蔗渣还可以作为造纸原料和食用菌栽培原料；甘蔗也是我国轻工业的重要原料，以蔗糖为原料和辅助材料的产品达56类2300多种(秦文信等，2006)；甘蔗中的果蔗以及甘蔗汁液也是上好的保健食品，甘蔗性凉，有清热、解酒、利尿、助脾健胃、滋养之效。甘蔗是高光效的c4植物，生物产量很高，在甘蔗高产地区平均每年每公顷甘蔗约可生产7000l酒精(matsuokaetal.,2009)，远比其它作物高出1-17倍，如玉米(4000l/hm2)和甜高粱(3000l/hm2)(teetoretal.,2011；hilletal.,2006)。在享有“绿色能源之国”美誉的巴西，甘蔗年产出的酒精近一千万吨，利用酒精和汽油混合的汽车新能源，足够巴西国内三成的汽车完全使用。此外，利用甘蔗以及甘蔗的副产品，通过一定的技术手段，还可以进行发电从而造福人类，而且，在巴西，用甘蔗类原料进行发电已经超过水利发电的总和，成为了巴西的重要的能源来源。

目前，国内甘蔗的种植和管理仍存在诸多问题，改善甘蔗栽培和管理方式提升甘蔗生物产量还存在很大空间。同时，我国甘蔗种植面临的最大瓶颈是品种的单一化趋势严重，生产中迫切需要培育新的广适、高产、高糖性品种用于生产，由于甘蔗的染色体数量多、基因组结构复杂加之生产用种的遗传基础的狭窄，使得常规选育种所需时间长并且难以提高总糖含量，基因工程方法也只是改变了碳物质的分配，并没有整体上提高甘蔗糖含量，因此还远不能满足生产生活的需要(赵婷婷，2012)。研究甘蔗体内糖积累和分配机制，找出糖分积累过程中的关键控制点，然后加以改良是实现甘蔗高产、高糖一条重要的途径。将为提高甘蔗品质，实现甘蔗高产、高糖、和高抗的育种目标提供科学参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蔗糖转运蛋白shsweet1及其编码基因和该基因的应用。本发明的另一个目的是提供甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因的克隆方法以及所用到的引物对。

本发明的第一个方面是提供一种甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种甘蔗糖转运蛋白shsweet1，其为本发明第一个方面所述的甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如seqidno:8所示。

本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从成熟甘蔗的根、茎和/或叶中提取总rna；(2)以总rna为模板进行反转录获得cdna；(3)设计shsweet1基因全长序列扩增引物对，进行pcr扩增，回收pcr产物，其中，shsweet1基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示；(4)pcr产物连接载体，转化，测序，获得shsweet1基因基因片段。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因在细胞内定位中的应用。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因在提高植物抗冷胁迫中的应用。

本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因在培育高糖高产高抗转基因甘蔗中的应用。

本发明的第七个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因。

本发明的第八个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。该引物对可用于shsweet1基因全长序列扩增。

本发明的第九个方面是提供另一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:4和seqidno:5所示。

本发明的第十个方面是提供又一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:6和seqidno:7所示。

本发明首次从甘蔗中克隆得到shsweet1基因，该基因具有糖转运蛋白的转运功能，能定位于细胞的细胞膜中，能提高植物抗冷胁迫能力，有利于甘蔗等植物在逆条件下生长，为揭示蔗糖转运机制对植物生长发育和品质改良的调节功能，为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供遗传学依据。

附图说明

图1为甘蔗不同部位的总rna提取电泳图。

图2为shsweet1基因cdna全长扩增的电泳图。

图3为shsweet1基因全长cdna的orf分析结果。

图4为shsweet1氨基酸跨膜区预测结果。

图5为sweet1氨基酸亚细胞定位预测结果。

图6为甘蔗不同组织shsweet1基因相对表达量。

图7为不同甘蔗病叶中shsweet1基因相对表达量。

图8为甘蔗中shsweet1基因冷胁迫下相对表达量。

图9为pshsweet1-gfp载体构建过程图。

图10为pshsweet1-gfp酶切电泳图。

图11为shsweet1基因在洋葱内表皮中的亚细胞定位，其中，a，c：gfp荧光(488nm蓝光激发)；d，f：白光观察：a/d：转有pshsweet1-gfp载体表皮细胞；c/f：转有pcambia1302空载体表皮细胞。

图12为植物表达载体pshsweet1酶切电泳图。

图13为转基因烟草shsweet1基因的pcr检测结果。

图14为烟草的冷胁迫的表型，其中，ck：野生型烟草；1：shsweet1转基因烟草。

图15为甘蔗转基因苗培育过程，其中，a:愈伤组织的诱导b：愈伤组织再分化出小苗c：ppt筛选d：生根筛选培养e：转shsweet1抗性植株炼苗f:转shsweet1抗性植株的定植。

图16为转化植株bar基因检测结果，其中，m：dl2000marker；ck⁺:载体质粒；ck^-：非转基因植株；1-5：转shsweet1抗性植株。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.)或酵母遗传法实验指南(methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual，adamsaetal编，coldspringharborlaboratory,1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1实验材料

1.1植物材料

以种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所临高试验基地和中国热带农业科学院海口院区甘蔗新台糖22号(roc22)为植物材料，甘蔗roc22组培苗和普通烟草为本实验室提供。

1.2菌株和质粒

大肠杆菌(escherichiacoli.dh5α)感受态购自富能公司(广州)；根癌农杆菌(agrobacteriumtumefacienseha105)为本实验室保存。pmd19-t、pmd19tsimple载体质粒购自takara公司；pcambia3300-gus、pcambia1302植物表达载体为本实验室保存。

1.3酶及其他试剂

reagentrna提取试剂盒购自invitrogen公司(美国)；pcr试剂、dna胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自omega公司(美国)；反转录试剂盒、sybrgreeniipremix、rtaq酶、la-taq酶、限制性内切酶购自takara公司(中国，大连)；t4dna连接酶购自fermentas公司；β-巯基乙醇、蔗糖、氨苄青霉素(amp)、链霉素(str)、羧变青霉素(car)、卡那霉素(kan)、利福平(rif)、草丁膦(phosphinothricin，ppt)、琼脂糖购自sigma公司；常用的化学试剂为国产分析纯。

1.4主要仪器设备

pcr扩增仪t1thermocycle(biometra)，梯度pcr仪(eppendorf5331)，多用途高速冷冻离心机(thermo)，常温离心机(hettichd-78532)，自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂sz-97)，恒温水浴锅，恒温摇床(n.jg-27ekiso)、恒温培养箱(sanyomrl-350)、紫外分光光度计(北京普析通用仪器公司t6)、电泳仪(labneteq2705)、凝胶成像系统(bio-rad)、实时荧光定量pcr仪(stratagenemx3005p)

1.5培养基的配制

lb培养基(1l)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，ph7.0，固体培养基1000ml加15g琼脂粉，121℃，25min高压灭菌。

yep培养基(1l)：蛋白胨10g，酵母提取物10g，nacl5g，ph7.0，固体培养基1000ml加15g琼脂粉，121℃，25min高压灭菌。

甘蔗愈伤组织诱导培养m1(1l)：ms+2.4-d1mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶8g/l，ph5.8。

甘蔗分化培养基m2(1l)：ms+6-ba1mg/l+kt0.5mg/l+蔗糖30g/l+卡拉胶8g/l，ph5.8。

甘蔗转化用液体培养基mr(1l)：1/5ms大量元素+ms其他成分+2.4d1mg/l+10mmol/l果糖+10mmol/l葡萄糖+30g/l庶糖(固体培养基应加入卡拉胶8g/l)，ph5.3。

甘蔗生根诱导培养基(1l)：ms(大量元素减半,其它成分不变)+naa2mg/l+蔗糖20g/l+椰水100ml/l+卡拉胶8g/l+活性炭0.2g/l，ph5.8。

2实验方法和实验结果

2.1甘蔗shsweet1基因的克隆

(1)甘蔗根、茎、叶总rna的提取

参照invitrogenreagent提取rna的方法步骤进行：取根、茎、叶各0.1g，切成小片，迅速转入液氮中，用研钵研磨成粉末。取1mltrizol加入1.5ml无酶离心管，标记。将液氮研磨好样品迅速转移到离心管中，迅速振荡2min。在室温条件下静置5min后，加入200μl氯仿。用力反复颠倒离心管混匀30s后，室温下静置10min后，4℃条件12000g离心15min。吸取上清转入新的1.5ml无酶离心管中(吸取时不要晃动中间层)。加入500μl的保存于-20℃冰箱内的异丙醇，彻底混匀后，-20℃下静置10min，4℃条件12000g离心15min。弃上清。加入1ml75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃条件7500g离心10min，弃上清，超净台吹5-10min，待离心管内液体干掉，加入40μlrnase-freeh2o，水浴锅55-60℃溶解10min。放冰上，加fermatasdnaseibuffer5μl，dnasei5μl，37℃温浴30min。加入5μl50mmedta，65℃温浴10min，放-70℃备用。

(2)rna完整性及纯度检测

取2μl的totalrna1.2％琼脂糖凝胶电泳检测和1μl的totalrna用经核酸蛋白分析仪测定rna的纯度。经核酸蛋白分析仪测定其纯度od260/280的比值在1.9～2.0，浓度在200-600ng/μl。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，各组织的总rna两条带清晰，条带完整，28srrna的亮度约为18srrna的2倍，符合后续试验的要求。

(3)反转录合成cdna链

a.将无酶的microtube管放在冰上按顺序依次加入以下列混合液：

模板rna(5μg以下)7.0μl(0.1ng-5μg)

oligo(dt)18primer(50μm)1.0μl

rnasefreeddh2oupto12.0μl

b.65℃保温5min后迅速移到冰上2min以上。

c.cdna合成反应液，按顺序加：

d.将cdna合成反应液加至rna/引物混合物中，轻轻混匀，简单离心，42℃温育1h。

e.70℃，10min终止反应。

f.反转录cdna保存于-70℃备用。

(4)shsweet1基因全长序列扩增

a.引物设计：根据玉米、高粱糖转运蛋白(sugareffluxtransporter)基因设计引物如下：

b.pcr扩增体系如下：

c.混合均匀后微离心，放入pcr仪进行pcr扩增，反应程序为：

(5)pcr扩增产物凝胶电泳

将pcr扩增产物加入5μl6×loadingbuffer混匀后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。电压95v，电泳35min，然后在凝胶成像系统中拍照记录，并切下疑似目的条带的凝胶。扩增片段大小约为800bp(如图2)。

(6)扩增片段凝胶回收

目的条带的回收参照omega公司的凝胶回收试剂盒说明书进行。

(7)回收片段与t载体连接反应

目的条带与pmd19-t载体连接体系如下：

16℃，连接过夜。

(8)连接载体转化及测序

将连接产物(10μl)，加入至含50μl感受态细胞(escherichiacoli.dh5α)的1.5ml的离心管中，用枪头轻轻混匀，放在冰上冰浴30min。42℃热激90s，立即转入冰上放置2min。

在以上混合液体系中加入900μllb液体培养基，37℃恒温培养箱振荡培养60min。10000rpm，离心45s，弃掉上清液500μl，再用枪头轻轻混匀沉淀，涂布于事先准备好的含有100μg/mlamp的lb培养基上，在超净台中静置30min，待菌液被平板吸收后，在37℃恒温培养箱倒置平板培养12～16h，直至形成单菌落。挑取约10个单菌落，分别放入1ml含有amp抗性的液体lb培养基的离心管中，37℃恒温培养箱振荡培养过夜。将菌液分装，各约200μl，一管用于测序，一管用于pcr确认载体中插入片段的长度大小，剩余的保存备用。取1μl菌液作为pcr模板，进行pcr扩增(方法同“shsweet1基因全长序列扩增”)，送上海生物工程有限公司测序，测序结果表明：克隆获得片段大小为868bp。

2.2甘蔗shsweet1基因生物信息学分析

在ncbi上对shsweet1氨基酸序列进行blastp搜索比对，发现它与sweet基因家族同源。根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html对shsweet1基因cdna全长序列进行orf分析发现，该序列具备完整的开放阅读框，长度为732bp，从98位起始密码子atg到829位tga终止密码子止，共编码243个氨基酸(图3)。运用在线软件ncbicds数据库进行编码蛋白的保守结构域分析，发现shsweet1含有pq-loopsuperfamily和mtn3/saliva的保守结构域。protparam预测该基因编码蛋白质的相对分子量为26.93kda，等电点8.87，总平均疏水指数为0.916，表明该蛋白为疏水性蛋白。

用tmhmmserverv.2.0软件进行shsweet1氨基酸序列进行跨膜结构预测发现(图4)，shsweet1蛋白具有7个跨膜区,跨膜区分别位于15-37，58-80，85-107，116-138，148-170，177-199，204-226共155个氨基酸。与之前报道的真核生物sweet蛋白跨膜结构相似，因此推断shsweet1具备真核生物sweet蛋白的结构特征。结合亚细胞定位软件分析发现shsweet1可能位于质膜上(图5)，推测shsweet1可能是一种质膜蛋白。

从ncbi数据库中选取已报道的50个不同植物sweet蛋白氨基酸序列，用mega5.1构建系统发育树。基于氨基酸同源分析表明shsweet1基因编码的氨基酸序列与玉米、谷子、小麦和二穗短柄草等单子叶植物shsweet家族成员的同源性地位接近，分别为91％、89％、85％和83％。说明甘蔗shsweet1是mtn3/saliva/shsweet家族成员。

2.3甘蔗不同组织中shsweet1基因表达分析

参照reagent提取rna方法提取甘蔗的未成熟叶、成熟叶、未成熟茎、成熟茎、根以及不同甘蔗病害的病叶和胁迫处理甘蔗幼苗rna，参照fermentas公司提供的反转录试剂盒合成cdna。均一化浓度之后在实时荧光定量pcr仪mx3005p上进行rt-qpcr检测shsweet1基因在不同组织及不同胁迫下的相对表达量。

a)rt-qpcr引物：

sw1f:5′-ccgctctccgtgatgaaa-3′

sw1r:5′-ggaagccagagacaggaa-3′

甘蔗gapdh内参引物(引自iskandaretal.,2004)：

p1：5′-cacggccactggaagca-3′

p2：5′-tcctcagggttcctgatgcc-3′

b)pcr扩增体系：采用takara公司premixextaqtmⅱ试剂盒。

rt-qpcr扩增程序：95℃，3min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环；每个样品设置3个重复，并且做溶解曲线。内参基因扩增体系及程序与目的基因相同。数据均采用2^-△△ct法分析相对定量值(kennethetal.,2001)。

(1)甘蔗不同组织中shsweet1基因表达分析

于甘蔗伸长期采集种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所临高甘蔗试验基地的甘蔗植株不同组织样品作为试验样品。样品采集时选取处于伸长期的健壮甘蔗植株9株，每3株为一个重复混合取样。分别采集未成熟叶、成熟叶、未成熟茎、成熟茎。未成熟叶为甘蔗未抽出心叶；成熟叶为甘蔗植株由上及下完全展开且可见肥厚带的+3叶。未成熟茎为植株上部茎顶端生长点以下第二节；成熟茎为甘蔗植株由下及上第3或4节。根为挖取植株后成熟根。

rt-qpcr结果如图6所示：shsweet1基因在甘蔗伸长期植株的根、未成熟茎、成熟茎、未成熟叶和成熟叶中均有表达，说明shsweet1基因在甘蔗中属于组成型表达。shsweet1基因在成熟叶和成熟茎中表达相对较高，各组织相对表达量依次为：成熟叶＞成熟茎＞未成熟叶＞根＞未成熟茎，分别相当于未成熟茎表达量的1～3.5倍。

(2)甘蔗不同病害下shsweet1基因表达分析

在种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所临高甘蔗试验基地的大田甘蔗中分别采集感染甘蔗褐条病、甘蔗赤条病和甘蔗黑穗病且处于发病中期的甘蔗植株叶片作为甘蔗褐条病病叶、甘蔗赤条病病叶、甘蔗黑穗病病叶；采样时每种病害分别选取典型且单一发病的发病中期植株，每个植株选取一片发病叶片，共选取9片，每3片一个重复，3次重复。以未发病的甘蔗健康植株叶片为对照。叶片样品采集完成后立即放入液氮中保存。

rt-qpcr结果如图7所示：甘蔗褐条病、甘蔗黑穗病、甘蔗赤条病三种病叶中shsweet1基因相对表达量都高于健康的甘蔗叶。其中甘蔗褐条病病叶中shsweet1基因表达量最高，相当健康的甘蔗叶的2.6倍。表明当病原菌侵入叶片时，可能激活和诱导shsweet1基因在叶肉细胞膜上表达，导致更多的糖通过其分泌到叶肉细胞间隙，为细菌的侵入和繁殖提供一个良好的环境。

(3)甘蔗幼苗低温处理

试验用甘蔗组培苗植株接种于ms培养基中在28℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为3000lx条件下预培养两周，选取叶龄相同且长势一致的甘蔗组培苗转入ms液体培养基中28℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为3000lx恢复培养两天，然后在4℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为3000lx条件下进行冷胁迫。冷胁迫0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h后进行取样，每次取样9株植株，3株为一个重复混合取样，3次重复。每次取样完成后立即放入液氮中保存。

qrt-pcr结果如图8所示：冷胁迫能够诱导shsweet1基因上调表达。4℃处理甘蔗组培苗时，在0-96h内，shsweet1随处理时间的增加表达量均持续的增加。shsweet1在处理48h时被快速诱导表达，表明shsweet1基因在甘蔗抵抗冷胁迫的过程中具有重要的作用，可能在甘蔗体内参与运输可溶性糖来降低甘蔗体内渗透压，将有助于维持甘蔗在非生物胁迫下的正常生长。

2.4shsweet1基因在洋葱内表皮中的亚细胞定位

(1)gfp融合载体的构建

a.对shsweet1基因序列分析，找到完整orf并在其两端设计带酶切位点的引物，下游引物去掉终止密码子，如下所示：

s2gf：5′-ggccatggattggggtgatc-3′ncoⅰ

s2gr：5′-ggagatcttgtatgtgtgactagtaatggca-3′bglⅱ

b.以shsweet1-pmd19-t质粒为模板，引物(s2gf，s2gr)进行pcr扩增，扩增体系及程序如下：

反应程序为：95℃5min，95℃1min，62℃1min，72℃1min，35个循环，72℃10min。pcr反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像系统中用手术刀切下目的带并回收，然后将其连入pmd19t-simple载体中，转化入感受态dh5α，挑取阳性克隆进行pcr鉴定，送上海生工测序。

c.对测序正确shsweet1-pmd19t的单克隆和含pcambia1302载体的菌株进行质粒提取。质粒提取参照omega公司的e.z.n.aplasmidminiprepprotocol质粒小规模提取试剂盒说明书进行。

d.用限制性内切酶ncoi，bglⅱ对质粒shsweet1-pmd19t和pcambia1302进行双酶切，酶切体系如下：

e.然后1％的琼脂糖凝胶电泳，回收载体大片段和目的基因片段，用t4dnaligase连接，转化进入感受态dh5α(pshsweet1-gfp载体构建过程如图9所示)，挑取阳性克隆，37℃振荡培养过夜提质粒，双酶切鉴定，电泳切除目的大小条带(图10)，正确载体命名为pshsweet1-gfp融合载体。

酶切体系如下：

(2)农杆菌感受态的制备

a.从-80超低温冰箱中取出农杆菌eha105菌株，冰上解冻，用接种环蘸一下农杆菌，在yep平板(含10mg/mlstr+20mg/mlrif)上划线，28培养2天。

b.挑去取单菌落接种于含有5mlyep液体培养基(含10mg/mlstr+20mg/mlrif)中，28℃振荡培养24～48h至菌液浑浊为止。

c.取1ml纯化的菌液接种到含有50ml无抗生素的yep液体培养基的三角瓶中，28℃振荡培养5～8h，测od＝0.5～0.6为止。

d.将菌液从三角瓶中倒入80ml的离心管中，冰上冷浴30min；

e.5000xg，4条件下离心5min，收集菌体；

f.在超净台上操作，弃上清，用20ml预冷50mmol/lcacl2重悬菌体；

g.重复e。

h.在超净台上操作，弃上清，用1ml50mmcacl2重新悬浮，取50μl菌液分装到1.5ml离心管中，液氮速冻，-80℃保存备用

(3)表达载体的转化

从-80℃超低温冰箱中取一支含有50μl的农杆菌感受态细胞，放置于冰上解冻；取4μl质粒加入到上述解冻的离心管中，冰浴静止15min，接着放入液氮中5min；28℃恒温箱中放置5min，加入500μlyep(不加抗生素)培养基，28℃条件下，震荡培养3h；吸取200μl的菌液涂布于yep三抗平板上(10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)，28℃恒温培养箱中倒置培养48h；挑取单菌落接种到含有5mlyep液体培养基(10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)中，28℃条件下，振荡培养36～48h；挑取农杆菌阳性克隆，摇菌，参照大肠杆菌质粒提取农杆菌质粒，酶切pcr鉴定。

(4)农杆菌介导转染洋葱表皮细胞

固体平板上分别挑取已带有重组质粒pshsweet1-gfp及空载质粒pcambia1302的阳性单克隆，至10mlyep液体培养基(10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)，28℃，振荡培养过夜。转接3-4ml过夜菌液至50mlyep液体培养基(10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)，28℃，振荡培养至od600＝0.6-0.7。4000g/min离心2min，收集菌体，用ms液体培养基(10mmol/lmgcl2,100μmol/las)悬浮菌体，使od600值在1.0左右。

洋葱表皮细胞预培养：选取新鲜的洋葱，除去外层鳞片约3-4层，75％乙醇浸泡10min，无菌纯水漂洗三次，每次5-8min。无菌解剖刀切开，将洋葱鳞片内表皮切成1cm²小块，靠近叶肉面平铺在ms固体培养基(100μmol/las)上。28℃光周期14/10h，预培养24h。共培养：预培养后的洋葱内表皮浸入ms液体培养基(10mmol/lmgcl2,100μmol/las)悬浮的菌液中，20-30min，期间摇动几下，夹起一角，在滤纸上滤干菌液，平铺于ms固体培养基(100μmol/las)上。28℃光周期16/8h，共培养24h。取出洋葱内表皮，用ms液体培养基晃动洗涤，除去表面附着的农杆菌，压片制片，在荧光显微镜下观察，拍照。

使用荧光显微镜在紫外光下观察含有gfp融合载体的农杆菌侵染后洋葱内表皮细胞中gfp的表达情况，结果如图11所示，在图11-c中空载体pcambia1302在细胞中的各个部位都可观察到绿色荧光，所以在细胞内没有具体的定位性，而图11-a是转化的pshsweet1-gfp载体的洋葱细胞，在细胞膜上有绿色荧光，有明显的定位特征，根据生物信息学分析shsweet1都为一种细胞膜蛋白，因此推测shsweet1定位于细胞膜上。

2.5shsweet1基因遗传转化烟草的研究

(1)植物表达载体pshsweet1构建

a.对shsweet1基因序列分析，分别找到其完整orf并在两端设计带酶切位点的引物，下游引物去掉终止密码子，如下所示：

s23f：5′-ggggatccgcaagtatcttccctcgacg-3′bamhi

s23r：5′-gggagctctggcatgctcatgtatgtgtg-3′saci

b.以shsweet1-pmd19-t质粒为模板，引物(s23f，s23r)进行pcr扩增，扩增体系及程序如下：

c.反应程序为：95℃5min，95℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃10min。pcr反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像系统中用手术刀切下目的带并回收，然后将其连入pmd19t-simple载体中，转化入感受态dh5α，挑取阳性克隆进行pcr鉴定，送上海生工测序。正确载体命名为pmd-shsweet1。

d.对测序正确pmd-shsweet1的单克隆和含pcambia3300-gus载体的菌株进行质粒提取，提取步骤同c。

e.用限制性内切酶bamhⅰ，sacⅰ对质粒pmd-shsweet1和pcambia3300-gus进行双酶切，酶切体系如下：

f.然后用1％的琼脂糖凝胶电泳，回收载体大片段和目的基因片段，用t4dnaligase连接，转化进入感受态dh5α，挑取阳性克隆，37℃振荡培养过夜提质粒，双酶切鉴定获得目的大小条带(结果如图12)，正确载体命名为pshsweet1载体。

酶切体系如下：

(2)烟草外植体旳培养

普通烟草(nicotiamtabacum)种子用95％酒精中浸泡5s后，然后用无菌镊子将其转移到50％(v/v)的次氯酸钠溶液(加一滴tween-20)中，持续搅拌20min。用无菌水漂洗五次，将种子置于无菌滤纸中晾干，播种于ms固体培养基上，每皿20粒种子，28℃光照培养。一周后将幼苗换到新鲜的ms培养基中，每瓶3株，待长成有3～4片大叶子小苗时，可以用来浸染。

(3)烟草的转化

将含有表达载体的eha105菌种在yep固体培养基(含有10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)中划线，28℃恒温培养2d。挑取单克隆于5ml含有同样抗生素的yep液体培养基中200rpm，28℃恒温培养过夜。

取2ml过夜培养液于100mlyep液体培养基(含有同样抗生素)中，200rpm,28℃恒温培养，直至od600达到0.5～0.7。转移到50ml无菌离心管中4℃，4000rpm，离心5min，弃掉上清，用无菌枪头吸出培养基残液，加入100mlmr液体培养基(含150μmol/las)重悬菌体，220rpm，28℃振荡培养2h，即可获得农杆菌转化侵染液。

浸染：将烟草嫩叶用无菌打孔器打成直径5mm的叶盘，约50个叶盘，放入转化浸染菌液中，用摇床轻摇30rpm3min，抽真空10min。室温静置5-l0min，用无菌小勺将叶盘捞出并用无菌滤纸吸干表面水分。最后将叶盘接种在ms固体培养基中28℃黑暗共培养3d。

共培养后，将叶盘转接到ms分化培养基(含1mg/l6-ba)上进行分化培养，每周换一次同样的培养基直至分化出幼苗。

将叶盘边沿的分化出的小苗切下然后置于ms培养基中培养一周。

一周后，将小苗转移到ms固体培养基(含2mg/lppt)中进行筛选培养，每周换一次相同的培养基，直至筛选出抗性苗。

将抗性幼苗放入生根培养中培养两周，炼苗一周，然后种植于花盆中。

(4)转基因烟草的分子检测

用ctab法小量提取烟草的基因组dna。对转基因烟草和野生型叶片rna的提取和反转录。对所获得转基因烟草进行目的基因的pcr检测，检测以(s2gf，s2gr)为引物，以转基因烟草叶片的总dna作为模板，扩增程序为：95℃5min，95℃40s，60℃40s，72℃50s，34个循环，72℃10min。以植物表达载体pshsweet1质粒为阳性对照，野生型烟草和h2o作为阴性对照，以初筛得到20株转shsweet1抗性苗dna为模板进行pcr扩增，结果表明：在转基因抗性苗中，17株转shsweet1烟草均能扩增到与正对照一致的条带，条带大小都约为750bp(图13)，假阳性植株与非转基因烟草则无相应条带，回收测序证明是目的基因序列，说明目的基因已整合到烟草基因组中。

(5)转基因烟草冷胁迫处理

选择相同环境下发育健壮、长势一致的转基因烟草幼苗和野生型对照组幼苗，放入4℃恒温培养箱中，16h光照/8h黑暗，光照强度为3000lx条件下恒温培养50d，每隔一段时间观察植株的生长情况，拍照并记录生长情况。发现与野生型烟草相比转基因烟草生长快、叶片小且尖，根系发达，营养生长旺盛(图14)，表明在冷胁迫下，转shsweet1烟草可能更容易将可溶性糖运输到细胞间隙，维持细胞稳态来抵御冷刺激，使其的正常生长。

2.6shsweet1基因遗传转化甘蔗

(1)转基因甘蔗的获得

将甘蔗顶端分生组织生长点幼叶切成薄片在m1培养基上避光诱导20-30d，逐渐形成质地疏松，细胞分裂分化能力极强的胚性愈伤组织(图15a)，即可用于转化。用含pshsweet1农杆菌菌液浸泡愈伤组织后，黑暗共培养3-4d，在m2培养基上暗培养筛选15d，然后转移到继代培养基上光照分化筛选培养20d，愈伤组织开始长出小苗(图15b)。待小苗长至1cm左右，转移至含有ppt的生根培养基上筛选培养30d，ppt筛选浓度为2.5mg/l(图15c和15d)共获得10株转shsweet1的抗性植株。待转shsweet1抗性植株根系生长好后将幼苗洗净培养基、剪去老叶，移入水晶泥中炼苗(图15e)并进行pcr检测，2周后将抗性植株拔出种于花盆中(图15f)。

(2)shsweet1过表达抗性植株bar检测

用ctab法小量提取shsweet1过表达抗性植株和非转基因甘蔗的基因组dna，以植物表达载体携带的抗除草剂基因(bar)设计引物，表达载体质粒为阳性对照，非转基因甘蔗为阴性对照，进行pcr扩增检测，结果表明：在转基因抗性苗中，所有转基因植株均能扩增到与阳性质粒一致的条带，分别约为400bp的特异性条带(图16)，回收测序证明是bar基因序列，表明bar基因已整合到甘蔗基因组中。

参照envirologixquickstixtmkitfor(bar)cotton试剂盒的步骤对转基因甘蔗进行bar基因编码蛋白的检测，结果显示获得的转shsweet1甘蔗植株都能检测到bar基因的表达，与pcr检测bar基因结果一致。

(3)shsweet1过表达抗性植株目的基因检测

以ubi启动子序列设计上游引物和基因区设计下游引物分别设计shsweet1过表达抗性植株目的基因检测引物，通过对ppt筛选过的抗性植株进行pcr扩增，结果表明得到的10株过表达植株中，8株转shsweet1植株检测大小约750bp条带，经回收、连接转化及测序比对，发现序列与预期一致，表明shsweet1基因已整合到甘蔗基因组中。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

sequencelisting

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>一种甘蔗糖转运蛋白shsweet1基因及其应用

<130>170119-1

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>770

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>shsweet1基因

<400>1

gcaagtatcttccctcgacgtccaggcaccatggattggggtgatccggcattgacgagc60

ttcgtcgccgactcgtccttccgccacctctgctgctacggcgccggaatcgcaggaaac120

gtcttcgccttcgtgctcttcatctccccactccccacattcaagcggatcgtccggaac180

gggtccacggagcagttctcggccatgccgtacatctactcgctgctcaactgtctcatc240

tgcatgtggtacggccttcccttcgtctcctacggcgtcgtcctcgtcgccaccgtcaac300

tccatcggcgccgtcttccagctcgcatacaccgccgtcttcatcgccttcgccgacgcc360

aagcagaggctcaaggtctctgctctcctggccgccgtctttgtggtgttcggactgatt420

gtgtttgttagtttggctttgttggatcaccaaacccggcagatgttcgtcggatatctc480

agcgtcgcatccctcatattcatgttcgcgtcccccttgtcaatcatcaatctggtcatc540

aggacgaagagcgtggaatacatgccattctacttgtcattatctatgtttctgatgagt600

gcatcattcttcggatacggagtgctgctgcgtgatttcttcatatatattccaaatggt660

attggaaccatactgggtatcgtgcagttgatgctgtatgcctacttcagaaaaggatca720

agcgaggaagccaagctgccattactagtcacacatacatgagcatgcca770

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>s5s

<400>2

ctacttgcttgcatcagttgtct23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>s5as

<400>3

tggttccaaatacagttcgtg21

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>sw1f

<400>4

ccgctctccgtgatgaaa18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>sw1r

<400>5

ggaagccagagacaggaa18

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>s23f

<400>6

ggggatccgcaagtatcttccctcgacg28

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>s23r

<400>7

gggagctctggcatgctcatgtatgtgtg29

<210>8

<211>243

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>shsweet1蛋白

<400>8

metasptrpglyaspproalaleuthrserphevalalaaspserser

151015

phearghisleucyscystyrglyalaglyilealaglyasnvalphe

202530

alaphevalleupheileserproleuprothrphelysargileval

354045

argasnglyserthrgluglnpheseralametprotyriletyrser

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65707580

tyrglyvalvalleuvalalathrvalasnserileglyalavalphe

859095

glnleualatyrthralavalpheilealaphealaaspalalysgln

100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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210215220

tyrphearglysglysersergluglualalysleuproleuleuval

225230235240

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