2‑吲哚酮衍生物及其开环衍生物及合成方法与用途与流程

文档序号:11720485

本发明属药物技术领域,涉及结构新颖的2-吲哚酮衍生物及其开环衍生物及合成方法和在医学上的应用。



背景技术:

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种病程冗长、进行性退化性致死性中枢神经系统紊乱症。其病理特征主要为出现大面积大脑皮质萎缩,神经元之间形成由不溶性的Aβ构成的老年斑(senile plaques,SP),脑神经细胞内tau蛋白异常聚集、神经元死亡等。主要临床表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、行为异常和社交障碍等。国际阿尔茨海默症协会在2015年发布的《2015年全球阿尔茨海默症报告》显示,到2050年,全球各地患老年痴呆症的人数,将从当前的4700万人增加两倍多,达到1.32亿人。目前它已成为继肿瘤、心血管疾病之后居第3位的致死性疾病,因此研究新型高效的抗AD药物具有重大的医学和社会意义。

AD的发病机制复杂,随着分子生物学的不断发展及AD相关研究的不断深入,许多认可度高的AD发病机制已经被提出,这也为抗AD药物的设计和研发奠定了基础。目前认可比较高的AD发病假说有:胆碱能假说、自由基假说、Tau蛋白假说、基因假说、炎症假说、氧化不平衡假说、Aβ淀粉样蛋白假说等。近年研究发现磷酸二酯酶5与AD患者脑内Aβ沉积、Tau蛋白高度磷酸化及学习记忆功能障碍等密切相关,其抑制剂能明显提高AD患者学习记忆能力,其机制与改善脑血管功能失调、促进神经递质释放、促进神经再生等有关。目前在临床上有四个可用的乙酰胆碱酯酶抑制剂类抗AD药物,分别是他克林、多奈哌齐、加兰他敏及利斯的明。乙酰胆碱酯酶抑制剂通过抑制乙酰胆碱酯酶的水解能力,进而间接地提高中枢神经系统的胆碱能水平。另一个非常新颖的乙酰胆碱酯酶抑制剂分子石杉碱甲(Huperizine A),它是从中国苔藓灌木蛇足石杉中分离得到的天然生物碱,具有一定程度的神经保护作用及抑制淀粉样前体蛋白(APP)水解的作用,是于1996年中国政府唯一批准的抗老年痴呆药物。美金刚是临床上市的NMDA(N-甲基-D-门冬氨酸)受体拮抗剂类药物。

2015年中国专利CN 104529866 A、CN 105367472 A公开了吲哚衍生物、吲哚啉衍生物及其在医学上的用途,所发明的化合物及其组合物对5-HT6有较好的亲和能力,可以作为与5-HT6有关的中枢神经系统疾病、胃肠道病症或肥胖症,特别是阿尔茨海默症的治疗药物,但没有公开对乙酰胆碱酯酶或磷酸二酯酶5的抑制活性。2002年专利CN 1309641 A公开了一类N-(吲哚羰基)哌嗪衍生物,所发明化合物及其药剂作为强效5-HT2A拮抗剂,适用于治疗精神病、精神分裂症、抑郁症、帕金森病、阿尔茨海默病等,但也没有公开对乙酰胆碱酯酶或磷酸二酯酶5的抑制活性。2015年专利CN 104774193 A公开了一类吲哚酮类化合物、其制备方法及医药用途。所发明的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐对蛋白激酶的活性具有调节作用,可以抑制多种蛋白络氨酸激酶的活性,对多种肿瘤的增殖具有抑制作用,但并未公开其作为阿尔茨海默症的治疗作用。以上提到的相关化合物结构不包括在本发明的内容中。

AD的发生和发展具有多机制、多因素作用的特点,上述提到的单一靶点药物只能减轻AD症状,且持续单一用药会带来疗效下降及副作用增加的诸多问题,因此研究人员提出了“多靶点导向药物”(Multitarget-directed ligands,MTDLs)策略来研究抗神经退行性疾病药物。

本发明提供了一系列2-吲哚酮衍生物及其开环衍生物,具有三段式芳香结构,结构新颖多样化,具有良好的乙酰胆碱酯酶及磷酸二酯酶5抑制剂活性,可进一步开发为阿尔茨海默症新型高效的双靶点治疗药物。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一系列具有良好的乙酰胆碱酯酶及磷酸二酯酶5抑制活性的新型2-吲哚酮衍生物及其开环衍生物,可作为治疗阿尔茨海默症的双靶点治疗药物,具体涉及一类三段式芳香结构的2-吲哚酮衍生物及其开环衍生物。

本发明的另一目的是为提供上述具有三段式芳香结构特点的2-吲哚酮衍生物及及其开环衍生物的制备方法。

本发明合成了具有通式(Ⅰ)的化合物。

X为CO(CH2)n-1,n=1-10或者CO(CH2)n-1NH,n=1-10。

Y为CO、CH2

R1,R2,R3,R4,R5为各自独立的选自H、F、Cl、Br、I、CN、NO2、CF3、OCF3、SCF3、OH、SH、NH2、COOR、R、OR、SR、NHR、CH2NHR、NR2、OCOR、SCOR、NHCOR,其中R为C1-6的直链烷基、脂环烷基或杂环烷基或含有取代基的苯基。

R6选自NHR、CH2NHR、NR2、OCOR、SCOR、NHCOR,其中R为C1-6的直链烷基、脂环烷基或杂环烷基或含有取代基的苯基。

本发明合成了具有通式Ⅱ的化合物

R1,R2,R3,R4,R5,R8为各自独立的选自H、F、Cl、Br、I、CN、NO2、CF3、OCF3、SCF3、OH、SH、NH2、COOR、R、OR、SR、NHR、CH2NHR、NR2、OCOR、SCOR、NHCOR,其中R为C1-6的直链烷基、脂环烷基或杂环烷基或含有取代基的苯基。

R7选自NH2、NHR、CH2NHR、NR2、OH、SH、OR、SR,其中R为C1-6的直链烷基、脂环烷基或杂环烷基或含有取代基的苯基。

式(Ⅰ)、式(Ⅱ)中的各类基团可以用生物电子等排体或者同系列基团进行替换。

本发明的新型2-吲哚酮衍生物的制备方法,其特征是采用苯胺的衍生物为原料,经过Sandmeyer反应,分子内脱水环合,形成2-吲哚酮衍生物,再与酰氯反应成相应酰胺化合物,或者与苄溴反应,产物再经过酯化或者用NBS进行溴代后与胺反应得到相应的产物。

本发明的新型2-吲哚酮开环衍生物的制备方法,依照本发明中2-吲哚酮酰胺衍生物的制备方法,将所合成的2-吲哚酮酰胺衍生物与胺、酰氯、醇作用下在1,2-二氯乙烷中,0℃-80℃不同条件下反应即可得到相应产物。

式(Ⅰ)结构具体反应步骤为:

式(Ⅱ)结构化合物反应步骤为:

本发明所涉及的新型化合物通过体外乙酰胆碱酯酶及磷酸二酯酶5抑制剂活性实验的药效学研究,结果显示所述化合物具有良好的乙酰胆碱酯酶及磷酸二酯酶5抑制活性,可进一步研制开发成为治疗阿尔茨海默症的新型药物。

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

1-苯甲酰基-5-甲基吲哚-2,3-二酮(I1)的制备

5-甲基吲哚-2,3-二酮的制备(Ⅲ)

在圆底烧瓶中加入水合三氯乙醛8.27g和无水硫酸钠39g,加入84mL蒸馏水,搅拌溶解。称取4.95g对甲基苯胺,加入4mL浓盐酸与28mL水溶液,搅拌使之溶解,缓慢滴加至体系中,称取盐酸羟胺10g用46mL水溶解,快速加入反应体系,在80-90℃水浴下反应2h。经约一个小时冷却后,过滤,滤饼用水洗涤,干燥得棕黄色固体(无需提纯直接进行下一步反应)。在圆底烧瓶中加入浓硫酸20mL,于50℃分批加入完全干燥的上步产物(采用外部冷却控制反应温度在60-70℃,约30min加入完成),加入完成后升温至80℃反应15min。冷却至室温后加入120mL冰水,静置1h后出现大量红色固体粉末,抽滤、冰水洗涤、烘干得到红色固体5-甲基吲哚-2,3-二酮,用氢氧化钠溶液溶解,在搅拌同时用盐酸溶液调节pH至大量红色固体出现,过滤得到5-甲基吲哚-2,3-二酮(Ⅲ),熔点178-180℃。

在干燥的圆底烧瓶中加入5-甲基吲哚-2,3-二酮(Ⅲ)500mg,加入无水吡啶10mL使之溶解,常温下,加入4.36g苯甲酰氯,搅拌反应5-30min,加入50mL冰水,搅拌均匀后密封静置1h,出现大量黄色固体,过滤、水洗至中性、干燥。得到黄褐色固体,完全干燥后的固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶,得到亮黄色产品I1

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),7.75(dd,J=8.3,1.2Hz,Ar-H),7.67–7.59(m,2H,Ar-H),7.56(dt,J=8.6,4.3Hz,1H,Ar-H),7.50(t,J=7.8Hz,2H,Ar-H),2.43(s,3H,-CH3).

实施例2

1-苯甲酰基-5-甲基吲哚-2-酮(I2)的制备

取产品I1 500mg置于装有10mL乙二醇的100ml圆底烧瓶中,加入1.4mL水合肼,搅拌,加入十倍量的氢氧化钾于烧瓶中,加热至110-130℃搅拌反应2-3h,薄层色谱板监控反应完全后,将混合物冷却至室温,倒入20ml冰水中,用6N HCl调节pH=2,用乙酸乙酯萃取三次,萃取液用盐水洗,无水硫酸钠干燥,真空干燥箱干燥。得到产品I2

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(d,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.70(t,J=10.1Hz,1H,Ar-H),7.53(q,J=7.4Hz,1H,Ar-H),7.46(t,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.14(t,J=8.9Hz,1H,Ar-H),7.10(d,J=8.8Hz,1H,Ar-H),3.64(s,2H,-CH2),2.33(s,3H,Ar-CH3).

实施例3

1-(2-硝基苄基苯)5-甲基吲哚-2,3-二酮(I3)的制备

2-硝基苄基溴的制备

取2-硝基甲苯1g,溶于四氯化碳中,加热至50℃后分批加入1.01倍摩尔比的N-溴代丁二酰亚胺,10%的偶氮二异丁腈作为引发剂。升温至回流反应3-4h,薄层色谱分析严密监控,反应完成后及时停止,防止副产物二溴代物的生成。冷却后过滤除去不溶物琥珀酰亚胺,减压蒸馏除去有机溶剂四氯化碳。得到邻硝基苄基溴,稍冷后形成无色针状结晶。

取红色的5-甲基吲哚-2,3-二酮(I1)500mg,加入10mLDMF溶解,加入当量的NaH,冰浴下搅拌反应30min,加入1.2倍量的2-硝基苄基溴,室温下搅拌反应3-6h,TLC监控体系中5-甲基吲哚-2,3-二酮反应完全后冷却至室温,加入10mL冰水,有暗红色固体出现,抽滤,干燥,得到粗品。柱层析分离纯化得到纯净的产品I3

1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.21(dd,J=8.2,1.2Hz,1H,Ar-H),7.63–7.56(m,1H,Ar-H),7.56–7.48(m,2H,Ar-H),7.39–7.31(m,2H,Ar-H),6.60(d,J=8.0Hz,1H,Ar-H),5.37(s,2H,-CH2),2.36(s,3H,Ar-CH3).

实施例4

1-(4-溴苄基苯)-5-甲基吲哚-2,3-二酮(I4)的制备

4-溴苄基溴的制备

取4-溴甲苯1g,溶于四氯化碳中,加热至50℃后分批加入1.01倍量的N-溴代琥珀酰亚胺,与10%的引发剂偶氮二异丁腈。升温至回流反应3-4h,TLC跟踪,反应完成后及时停止,防止副产物二溴代物的生成,冷却后过滤不溶物琥珀酰亚胺,减压蒸馏除去有机溶剂四氯化碳,得到4-溴苄基溴,稍冷后形成无色针状结晶。

取红色的5-甲基吲哚-2,3-二酮500mg,加入10mLDMF溶解,加入当量的NaH,冰浴下搅拌反应30min,加入1.2倍量的4-溴苄基溴,室温下搅拌反应4h,TLC监控体系中5-甲基吲哚-2,3-二酮反应完全后冷却至室温,加入30mL冰水,有暗红色固体出现,抽滤,干燥,得到粗品。柱层析分离纯化得到纯净的1-(4-溴苄基苯)-5-甲基吲哚-2,3-二酮。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50–7.45(m,2H,Ar-H),7.43(s,1H,Ar-H),7.29(dt,J=5.6,2.8Hz,1H,Ar-H),7.20(d,J=8.5Hz,2H,Ar-H),6.62(d,J=8.0Hz,1H,Ar-H),4.86(s,2H,-CH2),2.31(s,3H,Ar-CH3).

实施例5

1-(4-溴苄基苯)-5-溴吲哚-2,3-二酮(I5)的制备

5-溴吲哚-2,3-二酮(Ⅳ)

取在圆底烧瓶中加入水合三氯乙醛8.27g和无水硫酸钠39g,加入84mL蒸馏水,搅拌溶解。称取4-溴苯胺8.02g,加入4mL浓盐酸与28mL水溶液,搅拌使之溶解,缓慢滴加至体系中,称取盐酸羟胺10g用46mL水溶解,快速加入反应体系,在80-90℃水浴下反应2h。约一个小时冷却后,过滤,滤饼用水洗涤,干燥得棕色固体(无需提纯直接进行下一步反应)。在圆底烧瓶中加入浓硫酸20mL,于50℃分批加入完全干燥的上步产物(采用外部冷却控制反应温度在60-70℃,约30min加入完成),加入完成后升温至80℃反应15min。冷却至室温后加入120mL冰水,静止1h后出现大量黄色固体粉末,抽滤、冰水水洗、烘干得到黄色固体5-溴吲哚-2,3-二酮(Ⅳ),产率70%。

取5-溴吲哚-2,3-二酮(Ⅳ)500mg,置于圆底烧瓶中,加入10mLDMF溶解,加入当量的NaH,冰浴下搅拌反应30min,加入1.2倍量的对溴苄基溴,室温搅拌反应4h-6h,TLC监控体系中5-溴吲哚-2,3-二酮反应完全后冷却至室温,加入30mL冰水,有暗红色固体出现,抽滤,干燥,得到粗品。柱层析分离得到1-(4-溴苄基苯)-5-溴吲哚-2,3-二酮。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J=2.0Hz,1H,Ar-H),7.61(dd,J=8.4,2.1Hz,1H,Ar-H),7.51–7.45(m,2H,Ar-H),7.19(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),6.64(d,J=8.4Hz,1H,Ar-H),4.87(s,2H,-CH2),1.58(s,10H,H2O).

实施例6

1-(2-硝基苄基苯)-5-溴-吲哚-2,3-二酮(I6)的制备

取5-溴吲哚-2,3-二酮(Ⅳ)500mg,置于圆底烧瓶中,加入10mLDMF溶解,加入当量的氢化钠固体,冰浴下搅拌反应30min,加入1.2倍量的邻硝基苄基溴,室温搅拌4-6h,TLC监控体系中5-溴吲哚-2,3-二酮反应完全后冷却至室温,加入30mL冰水,有暗红色固体出现,抽滤,干燥,得到粗品。柱层析分离得到纯净的1-(2-硝基苄基苯)-5-溴-吲哚-2,3-二酮。

1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.30(d,J=2.2Hz,1H,Ar-H),7.76(dt,J=9.5,4.8Hz,1H,Ar-H),7.68(d,J=8.6Hz,2H,Ar-H),7.22–7.12(m,2H,Ar-H),6.99(dd,J=9.7,6.0Hz,1H,Ar-H),1.44(s,3H,-CH3).

实施例7

1-苯甲酰基-5-(((4-甲氧基苯基)氨基)甲基)吲哚-2,3-二酮(I7)的制备

1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚-2,3-二酮的制备

取1g产品(I1)于100mL圆底烧瓶中,加入1,2-二氯乙烷作为溶剂溶解,体系加热至50℃,,加入0.23g N-溴代丁二酰亚胺以及0.06g的偶氮二异丁腈,升温回流反应;反应1h后,加入0.23g N-溴代丁二酰亚胺以及0.06g的偶氮二异丁腈;继续回流反应1h后,加入0.23g N-溴代丁二酰亚胺以及0.06g的偶氮二异丁腈;继续反应1h。薄层色谱分析紧密监控反应,反应停止后立即停止加热。减压蒸去溶剂后水洗产品,得到亮黄色颗粒,采用柱层析法纯化产品得到亮黄色结晶产品1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚-2,3-二酮,产率50%,避光保存。

取1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚啉-2,3-二酮500mg于干燥的100mL圆底烧瓶中,加入1,2-二氯乙烷溶解固体,加入0.24g碳酸钾固体,在冰浴下缓慢滴加当量的4-甲氧基苯胺,搅拌反应2-3h,TLC监控苄溴反应完全后停止反应,过滤除去碳酸钾等无机盐,水洗3次,用无水硫酸镁干燥,用旋转蒸发仪除去溶剂,对最终体系纯化,得到产品I7

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(d,J=8.8Hz,1H,Ar-H),8.77(d,J=2.2Hz,2H,Ar-H),8.04(d,J=7.3Hz,2H,Ar-H),7.76(dd,J=8.8,2.1Hz,1H,Ar-H),7.65–7.61(m,2H,Ar-H),7.55(t,J=7.3Hz,2H,Ar-H),6.97(t,J=11.2Hz,2H,Ar-H),4.54(s,2H,-CH2),3.84(s,3H,-OCH3).

实施例8

1-苯甲酰基-5(((4-溴基苯)氨基)甲基)吲哚-2,3-二酮(I8)的制备

取1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚啉-2,3-二酮500mg加入1,2-二氯乙烷中,加入0.24g碳酸钾固体,冰浴下缓慢加入当量的4-溴苯胺,常温搅拌2-3h,TLC监控苄溴反应完全后停止反应,过滤除去无机盐,加入大约等量体积的水,水洗3次,无水硫酸镁干燥,旋转蒸发仪除去溶剂,对最终体系柱层析纯化。

1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.63(d,J=8.5Hz,1H,Ar-H),8.03(d,J=2.0Hz,1H,Ar-H),7.97–7.93(m,2H,Ar-H),7.62(t,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.57(t,J=7.4Hz,3H,Ar-H),7.16(t,J=6.0Hz,2H,Ar-H),6.52(d,J=8.9Hz,2H,Ar-H),4.23(d,J=20.0Hz,2H,-CH2)

实施例9

1-苯甲酰基-5(哌啶-1-甲基)吲哚-2,3-二酮(I9)的制备

取1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚-2,3-二酮500mg加入1,2-二氯乙烷中,加入0.24g碳酸钾固体,冰浴下缓慢滴加当量的哌啶,搅拌反应2-3h,体系逐渐由黄色变为棕黑色液体,TLC监控苄溴反应完全后停止反应,过滤除去碳酸钾等无机盐,加入大约等量体积的水,水洗3次,用无水硫酸镁干燥,用旋转蒸发仪除去溶剂,对最终体系纯化,分离得到产品I9

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(d,J=8.6Hz,1H,Ar-H),8.13–8.02(m,2H,Ar-H),7.71(s,1H,Ar-H),7.65(dd,J=8.7,1.9Hz,1H,Ar-H),7.60–7.49(m,3H,Ar-H),3.79–3.68(m,2H,-CH2),3.50(d,J=16.1Hz,2H,-CH2),3.36–3.24(m,2H,-CH2),1.78–1.69(m,4H,-CH2),1.42(dd,J=8.8,6.4Hz,2H,-CH2).

实施例10

1-苯甲酰基-5((苯基氨基)甲基)吲哚-2,3-二酮(I10)的制备

取1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚-2,3-二酮500mg加入1,2-二氯乙烷中,加入0.24g碳酸钾固体,冰浴下缓慢滴加当量的苯胺,常温搅拌2-3h,TLC监控苄溴反应完全后停止反应,过滤除去碳酸钾等无机盐,加入大约等量体积的水,水洗3次,无水硫酸镁干燥,旋转蒸发仪除去溶剂,对最终体系纯化,分离得到产品I10

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(dt,J=88.0,53.6Hz,2H,Ar-H),8.45(dd,J=39.6,26.3Hz,1H,Ar-H),8.22(s,1H,Ar-H),7.96–7.15(m,9H,Ar-H),2.82–1.79(m,2H,-CH2).

实施例11

化合物1-苯甲酰基-5-((4-甲基哌嗪-1-甲基)甲基)吲哚-2,3-二酮(I11)的制备

取1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚-2,3-二酮500mg置于100mL圆底烧瓶中,加入1,2-二氯乙烷使之溶解,加入0.24g碳酸钾固体,冰浴下缓慢滴加当量的N-甲基哌嗪,常温搅拌2-3h,TLC监控苄溴反应完全后停止反应,过滤除去碳酸钾等无机盐,加入大约等量体积的水,水洗3次,无水硫酸镁干燥,用旋转蒸发仪除去溶剂,对最终体系纯化,分离得到产品I11

1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.92(d,J=8.6Hz,1H,Ar-H),8.05(dd,J=10.4,8.9Hz,2H,Ar-H),7.60–7.47(m,5H,Ar-H),3.84(s,2H,-CH2-),3.44–3.37(m,2H,-CH2-),2.57(s,2H,-CH2-),2.51–2.40(m,2H,-CH2-),2.37(d,J=5.6Hz,3H,-CH3),2.36(s,2H,-CH2-).

实施例12

4-((1-苯甲酰基-2-氧代吲哚-5-甲基)氨基)-4-氧代丁酸(I12)的制备

1-苯甲酰基-5-甲基吲哚啉-2-酮(I2)500mg加入1,2-二氯乙烷中溶解,升温至50℃时加入1.01倍量N-溴代丁二酰亚胺,10%AIBN,回流反应3h,TLC监测反应完全后冷却,加入过量的K2CO3或者当量的NaH室温搅拌反应,搅拌反应3-6h后,体系用水洗、干燥、旋蒸除去溶剂,对最终反应体系柱层析纯化,得到产品I12

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.44(s,1H,-COOH),9.97(s,1H,-NHCO),9.22(d,J=8.8Hz,1H,Ar-H),8.26(d,J=1.9Hz,1H,Ar-H),8.20(dd,J=8.8,1.9Hz,1H,Ar-H),8.12–8.01(m,2H,Ar-H),7.66–7.53(m,3H,Ar-H),3.85(s,4H,-CH2),3.75–3.65(m,2H,-CH2),3.43(dd,J=6.3,3.3Hz,-CH2).

MS:m/z 365(M-H)

实施例13

(1-苯甲酰基-2-氧代吲哚-5-甲基)甲基-4-氨基-4-氧代丁酸(I13)的制备

同实施例12制备方法,对最终体系柱层析分离得到产品I13

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.22(d,J=35.0Hz,1H,-NH),9.03(dd,J=51.0,8.6Hz,1H,Ar-H),8.03(dd,J=63.0,61.5Hz,2H,Ar-H),7.77–7.37(m,5H,Ar-H),3.87(s,4H,-CH2),3.83–3.63(m,2H,-CH2),3.60–3.36(m,2H,-CH2).

实施例14

2-(2-苯甲酰基氨基)苯基-2-乙酮酸甲酯(Ⅱ1)的制备

取靛红1g于100mL干燥圆底烧瓶中,加入无水吡啶20mL溶解,冰浴下加入3倍量苯甲酰氯,搅拌反应5-10min,靛红反应完全后,加入冰水淬灭反应,静置、过滤得到黄色固体,水洗,干燥。将干燥后的产品置于100mL圆底烧瓶中,加入少量甲醇,在回流下搅拌反应并逐渐增加甲醇,直至固体不再溶解,继续反应1h,热过滤除去不溶物,滤液冷却结晶,得到黄色晶体Ⅱ1

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.07(s,1H,-NHCO),9.03(dd,J=8.6,0.8Hz,1H,Ar-H),8.14–7.97(m,2H,Ar-H),7.84–7.67(m,2H,Ar-H),7.62–7.47(m,3H,Ar-H),7.23–7.11(m,1H,Ar-H),4.01(s,3H,-CH3).

实施例15

2-(2-苯甲酰基氨基-5-甲基)苯基-2-乙酮酸甲酯(Ⅱ2)的制备

取5-甲基靛红1g于100mL干燥圆底烧瓶中,加入吡啶、苯甲酰氯等,依例14(Ⅱ1)合成方法,得到纯净的黄色针状晶体Ⅱ2

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.00(s,1H,-NHCO),8.95(d,J=8.5Hz,1H,Ar-H),8.25–7.92(m,2H,Ar-H),7.71–7.43(m,5H,Ar-H),4.05(s,3H,-OCH3),2.40(s,3H,-CH3).

实施例16

N,N-二乙基-2-((2-苯甲酰基氨基-5-(N,N-二乙基)甲基)苯基乙酮酸(Ⅱ3)的制备

取1-苯甲酰基-5-苄基溴吲哚-2,3-二酮500mg置于100mL圆底烧瓶中,加入1,2-二氯乙烷使之溶解,加入0.24g碳酸钾固体,加入5倍量的二乙胺,升温至80℃反应2-3h,薄层色谱监控反应完全后,过滤除去碳酸钾等无机盐,加入大约等量体积的水,水洗3次,用无水硫酸镁干燥,旋转蒸发仪除去溶剂,对最终体系纯化,分离得到产品Ⅱ3

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.24(s,1H,-NHCO),8.94(d,J=8.6Hz,1H,Ar-H),8.17–7.98(m,2H,Ar-H),7.69(t,J=6.7Hz,1H,Ar-H),7.64(dt,J=7.2,3.6Hz,1H,Ar-H),7.59–7.46(m,3H,Ar-H),3.63–3.56(m,2H,-CH2),3.55(s,2H,-CH2),3.27(q,J=7.1Hz,2H,-CH2),2.49(q,J=7.1Hz,4H,-CH2),1.32(t,J=7.2Hz,3H,

-CH3),1.17(t,J=7.1Hz,3H,-CH3),1.01(t,J=7.1Hz,6H,-CH3).

实施例17

苯甲酸-2-氧代-2-(2-苯甲酰基氨基-5-甲氧基)苯基苯乙酸酐(Ⅱ4)的制备

取在圆底烧瓶中加入水合三氯乙醛8.27g和无水硫酸钠39g,加入84mL蒸馏水,搅拌溶解。称取5.69g对甲氧基苯胺,加入4mL浓盐酸与28mL水溶液,搅拌使之溶解,缓慢滴加至体系中,称取盐酸羟胺10g用46mL水溶解,快速加入反应体系,在80-90℃水浴下反应2h。经约一个小时冷却后,过滤,滤饼用水洗涤,干燥得棕黄色固体(无需提纯直接进行下一步反应)。在圆底烧瓶中加入浓硫酸与水以1:3稀释的酸性溶液20mL,加入上步反应所得产物,升温至92℃剧烈搅拌反应2min。冷却至室温后加入120mL冰水,静止1h后出现大量红色固体粉末,抽滤、冰水水洗、烘干得到暗红色色固体柱层析纯化得到纯净的5-甲氧基-2,3-二酮吲哚。称取5-甲氧基-2,3-二酮吲哚1g置于100mL圆底烧瓶中,冰浴下加入吡啶使之溶解,滴加缓慢加入过量十倍的苯甲酰氯,0℃搅拌反应1h-3h,待5-甲氧基-2,3-二酮吲哚反应完全后,加入100mL冰水,静置1h后,抽滤、水洗,干燥。所得固体粗品置于100mL圆底烧瓶中,加入少量乙酸乙酯,加热至回流状态下,逐渐补加乙酸乙酯,回流下发应1-2h,至固体不再减少,体系热过滤,滤液冷却,滴加石油醚析出晶体,得到产品Ⅱ4

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23–8.17(m,2H,Ar-H),7.98(d,J=9.0Hz,1H,Ar-H),7.83(d,J=2.7Hz,1H,Ar-H),7.80–7.76(m,2H,Ar-H),7.74–7.67(m,1H,Ar-H),7.65–7.55(m,3H,Ar-H),7.53–7.45(m,2H, Ar-H),7.19(dd,J=9.0,2.8Hz,1H,Ar-H),3.88(s,3H,-OCH3).

实施例18

1-(吡咯烷-2,5-二酮)-2-(2-苯甲酰基氨基-5-吗啡啉甲基)苯基乙酮酸(Ⅱ5)的制备

取1-苯甲酰-5-甲基吲哚啉-2-酮(I2)1g加入1,2-二氯乙烷中溶解,升温至50℃时加入1.01倍N-溴代丁二酰亚胺,10%AIBN,分批加入,回流反应3h,TLC监测反应完全后冷却,水洗反应体系,用无水硫酸镁干燥、旋蒸除去溶剂,干燥所得固体。取固体产品500mg于干燥的圆底烧瓶中,加入经过除水干燥的1,2-二氯乙烷中,加入1.2倍量K2CO3,室温下缓慢滴加当量吗啡啉,吗啡啉用干燥的1,2-二氯乙烷稀释十倍。室温反应2-3h,TLC检测反应程度,待反应产物不在变化后,加入过量丁二酰亚胺,过量K2CO3,0-80℃反应约1-3h,TLC检测反应完全后冷却体系,过滤除去无机物,旋蒸除去溶剂,对体系进行柱层析纯化,得到产品Ⅱ5

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.16(s,1H,-NHCO),8.98(d,J=8.7Hz,1H,Ar-H),8.10–8.03(m,2H,Ar-H),7.76–7.67(m,2H,Ar-H),7.62–7.50(m,3H,Ar-H),3.84(s,4H,-CH2-),3.70(d,J=12.5Hz,4H,-CH2-),3.69–3.64(m,2H,-CH2-),3.52(s,2H,-CH2-),3.42–3.36(m,2H,-CH2-).

化合物乙酰胆碱酯酶活性测试结果

乙酰胆碱酯酶抑制活性的测试方法采用改良的Ellman法(Ellman G L,Courtney K D,Featherstone R M.Biochemical pharmacology,1961,7:88)。主要依据的原理如下:乙酰胆碱酯酶(AChE)能够将底物硫代乙酰胆碱迅速地分解为硫代胆碱及乙酸,硫代胆碱再与显色剂5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)定量结合产生黄色物质,该有色物质在405nm下有较强吸收。因黄色物质浓度的指数与对应的吸光度值有线性关系,进而由一定时间段内硫代胆碱产生的多少推算出相应AChE活力的高低,最后计算得到化合物对酶抑制活性的大小。乙酰胆碱酯酶活性测试所需果蝇乙酰胆碱酯酶酶源(200U/g)从山东京蓬生物药物有限公司购买,纯酶用缓冲液配制为0.5U/mL的纯酶稀释液备用。阳性对照物盐酸多奈哌齐从大连美伦生物技术有限公司购买。底物购买于上海麦克林生化科技有限公司,底物用pH=8的磷酸盐缓冲溶液配制成6mmol/L的溶液备用。显色剂购买于上海伊卡生物技术有限公司,显色剂用pH=7的磷酸盐缓冲溶液配制成6mmol/L的溶液备用。采用酶标仪测定405nm下吸光度值。

测定步骤:用微量移液枪精确移取50uL已知浓度的待测化合物溶液、50uL纯酶稀释液、50uL显色剂溶液于96孔酶标板中,在37℃水浴条件下孵育15min。之后快速加入底物50uL,测试405nm下加入底物之后0min至15min的吸光度值。同时设置纯酶对照组,加入50uL缓冲溶液,50uL酶、50uL显色剂、50uL底物,孵育及检测过程同实验组。选择化合物的六个浓度测定酶的抑制率,并以化合物浓度的负对数与酶抑制率进行线性回归,求得50%抑制时的摩尔浓度即为该化合物的IC50值,以盐酸多奈哌齐为阳性对照。

本发明中化合物的乙酰胆碱酯酶的抑制活性结果如下表(以盐酸多奈哌齐为阳性对照,单位nm)。

化合物磷酸二酯酶5抑制活性测试结果

化合物对磷酸二酯酶5的抑制活性测试方法采用试剂盒进行检测,磷酸二酯酶5检测试剂盒购买于上海酶联生物科技有限公司,试剂盒测试主要依据的原理是:采用双抗体夹心法测定样本磷酸二酯酶5水平。用纯化的人磷酸二酯酶5抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入磷酸二酯酶5,再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的磷酸二酯酶5抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色,TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色。颜色的深浅和样品中的磷酸二酯酶5活力呈正相关。用酶标仪检测在630nm波长下的吸光度值,设置纯酶对照组,通过计算获得抑制剂的半数抑制率。

测定步骤:准备试剂,选取待测化合物配制成六个不同浓度的稀溶液,将酶稀释至400U/L的稀溶液,取100uL的化合物与100uL酶稀释液加入于酶标板中,37℃孵育30min后,取50uL混合溶液置于试剂盒中,并设置空白孔和纯酶孔。添加完成后,用封板膜封板后置于37℃温育30min,小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,重复五次,拍干。每孔加入50uL的酶标试剂,用封板膜封板后置于37℃温育30min,重复洗涤过程。分别加入显色剂A50uL,显色剂B50uL,于630nm波长处用酶标仪检测其吸光度值。遮光显色10min后继续检测吸光度值。计算各样品的半数抑制率得到下表。

本发明中部分化合物的磷酸二酯酶5的抑制活性结果如下表(以西地那非为对照组,单位μm)。

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