人结肠癌细胞特异性结合多肽的筛选方法及其应用与流程

本发明涉及医学领域，尤其涉及一种结肠癌细胞表面特异性结合多肽筛选方法及其应用。

背景技术：

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于胃癌和食管癌，严重影响人类生命健康，目前我国每年新增结直肠癌确诊病例44万例，每年死亡患者多达23万人。早发现、及早切除癌前病变及局灶性癌变能够有效降低大肠癌病死率。但是由于结肠癌发展缓慢，早期症状多不明显，40岁以上无症状人群中6％患有早期肠癌，70％-80％结肠癌患者确诊时已经进入中晚期，超过25％的患者癌细胞已发生转移。转移性结肠癌手术根治效果差，术后复发率高，不能切除肿瘤的患者5年生存率几乎为0。药物靶向治疗虽然取得了很大的成功，但仍然存在许多不足如用于靶向的抗体分子量大，在肿瘤组织中穿透力低，对肝脏和骨髓产生毒性作用；免疫原性强；制备过程及周期较长，价格昂贵等。因此，探索早期诊断和治疗结肠癌的有效措施成为目前科研工作的热点问题。

肿瘤细胞与正常细胞的不同特性，为寻找特异性靶向结合肿瘤细胞的分子提供可能，噬菌体展示技术能够在肿瘤细胞表面分子未知的状态下，亲和筛选得到特异性结合肿瘤的多肽，有助于寻找新的靶向分子用于肿瘤的诊断和靶向治疗。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种结肠癌细胞表面特异性结合多肽及其在结肠癌诊断和治疗中的应用。

本发明提供的结肠癌细胞表面特异性结合多肽，其筛选步骤如下：

步骤(1)：利用全细胞筛选法，将随机十二肽库噬菌体克隆株与结肠癌细胞一同孵育，弃去未与所述的结肠癌细胞结合的克隆株，将与所述的结肠癌细胞结合的克隆株扩增；

步骤(2)：将步骤(1)循环4次，最大限度的富集与所述结肠癌细胞结合的噬菌体克隆株，得到与结肠癌细胞具有较高亲和力结合克隆株，进行扩增；

步骤(3)：将上述扩增后的克隆株与正常结肠上皮细胞孵育，进行负性筛选，去除与正常细胞结合的非特异性克隆株。

步骤(4)：将最终扩增后克隆株进行序列测定，分析出多肽序列。

较佳地，步骤(2)中采用在液相中进行筛选和验证，4轮筛选后多次重复试验比较各单克隆与结肠癌细胞结合前后的平均富集率，检测各个单克隆的细胞结合能力，以平均富集率高于阴性对照组的一个数量级以上的标准确定阳性噬菌体克隆株。

较佳地，所述的步骤(4)中，所述的多肽序列在结肠癌细胞和组织中均经过免疫荧光验证。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明开创性的采用了噬菌体展示技术，利用基因工程的手段将外源肽或蛋白基因插入噬菌体特定蛋白基因，外源基因编码的多肽或蛋白以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白能够保持相对的空间结构和生物活性。噬菌体库经过生物淘选，即噬菌体库与靶分子孵育，洗去未与靶分子结合的克隆株，收集，扩增，富集结合的克隆株，该过程反复循环3-5次，能够获得与靶分子特异性结合的噬菌体克隆株。通过基因测序获得相应多肽序列。该方法方便高效，筛选到的多肽，分子量较小，有效克服了传统单克隆抗体的免疫过敏反应，本发明通过噬菌体展示技术，筛选出1条与结肠癌细胞表面特异性结合的多肽。该多肽特异性结合在细胞表面，不与正常细胞结合，能够有效区分结肠癌细胞和正常细胞，有望成为靶向分子，用于肿瘤的诊断和靶向治疗。

附图说明：

图1a-c为本发明实施例中未移植及移植后糖尿病小鼠生存期结果图；

图2为本发明实施例中移植前与移植后糖耐量损伤小鼠ipgtt结果图；

图3为本发明实施例中流式细胞术检测尿液干细胞表面标记物的结果图

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。

实施例一：

一、筛选方法：

本实施例结肠癌细胞表面特异性结合多肽筛选方法，包括以下步骤：

步骤(1)：利用全细胞筛选法，将随机十二肽库噬菌体克隆株与结肠癌细胞一同孵育，弃去未与所述的结肠癌细胞结合的克隆株，将与所述的结肠癌细胞结合的克隆株扩增；

步骤(2)：将步骤(1)循环4次，最大限度的富集与所述结肠癌细胞结合的噬菌体克隆株，得到与结肠癌细胞具有较高亲和力结合克隆株，进行扩增；

步骤(3)：将上述扩增后的克隆株与正常结肠上皮细胞孵育，进行负性筛选，去除与正常细胞结合的非特异性克隆株。

步骤(4)：将最终扩增后克隆株进行序列测定，分析出多肽序列。

所述的多肽序列还经过免疫荧光验证。

二、噬菌体滴度测定(titration法)

灭菌后的无抗生素lb液体培养基对扩增后的噬菌体上清液进行100倍等稀释，然后从稀释好的每个滴度中各取100ul于离心管中，与500ul对数生长期的xl1blue菌液混匀，加入3ml于57℃恒温水浴锅中保温的lb顶层琼脂，混匀后迅速倾倒在四环素抗性的lb固体平板上，待稍凝固后，放在37℃培养箱中过夜培养，第二天计数噬菌斑的数量，噬菌体的滴度(pfu/100ul)＝噬菌体数目*稀释倍数，即每100ul的噬菌体上清液中包含的噬菌体的数量，按照这种方法测定扩增出的噬菌体上清的滴度，然后将其滴度稀释调整到固定滴度，用于检验细胞结合能力。

三、筛选出与所述的结肠癌细胞结合的克隆株的方法如下：

以结肠癌细colo320hsr细胞为靶细胞，人正常结肠黏膜上皮细胞ncm460为吸附细胞，进行4轮循环筛选，保持每一轮的噬菌体投入量。具体筛选程序如下：

步骤(1)：取1皿colo320hsr细胞，将其中悬浮的细胞3000rpm5min收集起来，用1mlpbs重悬，贴壁的细胞用2mlpbs吹打下来，放在两个ep管里，重悬的悬浮细胞也分成两份混匀在两个ep管的细胞中，6000rpm3min，洗1遍，弃去上清液，注意将上清去除干净，然后每管中加入500ul4％多聚甲醛，室温下固定20min。同样的方法处理正常结肠上皮细胞ncm460。

步骤(2)：用pbs10000rpm3min洗两遍，将上清去除干净，每管中加入0.5ml5％脱脂牛奶，封闭1h，10000rpm3min，离心去除牛奶，然后用0.5mlpbs将细胞重悬，混匀在一个ep管中。

步骤(3)：将上述titration滴度测定法中稀释后滴度为10¹²/100ul的噬菌体取50ul留样以备滴度测定，取1ml相同滴度的噬菌体加入固定好的colo320hsr细胞中，轻轻吹打将细胞与噬菌体混匀，然后将混悬液室温下低速震荡1h，待噬菌体和colo320hsr细胞充分结合后，8000rp，离心3min弃掉上清，然后加入1ml1％pbst(含1％tween-20)重悬后，8000rpm，离心3min，同样的方法沉淀重复洗涤4次，洗去沉淀中非特异性结合的或者未与细胞结合的噬菌体。

步骤(4)：用0.5ml的xl1blue菌液将沉淀重悬混匀，放在37℃摇床上培养1h，1000rpm，离心5min，收集上清，将其转移至上述固定并封闭后的正常结肠上皮细胞ncm460中，重悬混匀后室温下震荡1h，10000rpm，5min，离心收集上清共500ul。

步骤(5)：取出50ul用于滴度测定，剩余的部分加入1.5ml对数生长期的xl1blue菌液，混匀后37℃摇床过夜。

步骤(6)：取出过夜扩增的噬菌体-菌液混合液，8000rpm离心20min去除细菌沉淀，收集上清液，然后按着上清液的1/4体积加入peg8000/nacl,在冰上静置3小时，待液体中的噬菌体充分沉淀后13000rpm，30min，4℃恒温离心，去除上清液，用0.5mlpbs重悬沉淀。

步骤(7)：按着titration滴度测定法，在相同的实验条件下，分别测定每轮筛选前加入细胞中的噬菌体上清液，留样的筛选后的未过夜的噬菌体上清液，peg8000收集的筛选后过夜扩增的噬菌体上清液的滴度，计算每轮筛选后的噬菌体富集率＝(筛选后未过夜的噬菌体上清液的滴度*筛选后噬菌体上清液的体积)/(筛选前加入到细胞中的噬菌体滴度*加入的体积)。

步骤(8)：反复1-7过程3-5次，与结肠癌细胞结合的阳性克隆株不断富集(图1a)，挑选21个克隆株，进行与colo320hsr在液相多次重复验证其结合和能力，其中2#，5#，8#，19#号克隆株的平均富集率明显高于阴性对照组的一个数量级以上，因此确定阳性噬菌体克隆株(图1b)。

四、阳性噬菌体克隆的dna序列测定与分析

测序模板的快速纯化

本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行手工或自动双脱氧测序。

步骤(1)：噬菌斑扩增离心后，将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。

步骤(2)：加200μlpeg/nacl，颠倒混匀，室温放置10min。

步骤(3)：离心10min，弃上清。

步骤(4)：短暂离心，小心吸去残余上清。

步骤(5)：沉淀物重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温孵育10min。短时间的室温孵育使单链噬菌体dna(ssdna)沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。

步骤(6)：离心10min，弃上清。用70％的乙醇沉淀，短暂真空干燥。

步骤(7)：沉淀重悬于30μlte[10mmtris-hcl(ph8.0),1mmedta]中。

步骤(8)：5μl的上述模板溶液进行³⁵s或³³p标记的手工双脱氧测序,或染料标记的自动循环双脱氧测序。根据测序方法的不同，适当增减模板用量。

噬菌体单链dna序列测定：分别取上述阳性克隆相应的模板液5ul，测序分析多肽序列(图1c)。

五、免疫荧光在验证合成多肽的特异性

1、细胞上验证多肽特异性，步骤如下

步骤(1)：将预先清洗、高压灭菌的盖玻片放入24孔培养板。

步骤(2)：取生长状态良好的结肠癌细胞colo320hsr和人正常结肠黏膜上皮细胞ncm460，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基制成细胞悬液，细胞计数后，按个8000孔加入到24孔培养扳。

步骤(3)：将其置于温箱继续培养，待细胞融合达80％，取出孔板，吸弃培养液，用pbs清洗3次，每次5min。

步骤(4)：用冰甲醇固定细胞爬片，室温，10min。

步骤(5)：吸弃甲醇，室温下晾干至发白；

步骤(6)：用pbs洗3次，每次5min；

步骤(7)：加入10ug/ml的多肽200ul/孔，对照组为随机肽组cbp-r,实验组为筛选获得的多肽cbp-1：lpktvssdmsln，置入37℃孵箱15min；

步骤(8)：pbs洗涤3次，每次5min，避光。

步骤(9)：加入10ug/mldapi，室温孵育10-30min，pbs洗涤3次，每次5min，避光。

步骤(10)：甘油封片，置于共聚焦显微镜下观察并拍照记录(图2)。

2、组织上验证多肽特异性

步骤(1)：取新鲜结肠癌及癌旁组织oct包埋，切成4um厚的切片，；

步骤(2)：免疫染色洗涤液洗涤5min，加入冰冻切片快速抗原修复液进行修复，室温下5min；

步骤(3)：免疫染色洗涤液洗涤5次，每次10min；

步骤(4)：用3％bsa+0.05％titonx-100封闭，室温60min；

步骤(5)：0.1％titonx-100洗涤3次，每次5min；

步骤(6)：免疫组画笔小心圈出轮廓，每张切片加入10ug/ml的多肽对照组为随机肽组cbp-r,实验组筛选获得多肽cbp-1：lpktvssdmsln，200ul，4℃孵育30min；

步骤(7)：pbs洗涤3次，每次5min；

步骤(8)：每张切片加入10ug/mldapi，200ul，室温下10min

步骤(9)：pbs洗涤3次，每次5min；

步骤(10)：避光，置于荧光显微镜下观察并拍照(图3)。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明开创性的采用了噬菌体展示技术，利用基因工程的手段将外源肽或蛋白基因插入噬菌体特定蛋白基因，外源基因编码的多肽或蛋白以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白能够保持相对的空间结构和生物活性。噬菌体库经过生物淘选(biopanning)，即噬菌体库与结肠癌全细胞孵育，洗去未与癌细胞结合的克隆株，收集，扩增，富集结合的克隆株，该过程反复循环3-5次，能够获得与结肠癌特异性结合的噬菌体克隆株。在液相中进行筛选和验证，每次将整皿的结肠癌细胞完全收集起来放在液相状态下与噬菌体进行一定时间的充分结合，一方面保证了每次结合的细胞量一致，从而保证细胞表面的噬菌体结合位点数量一致，每次实验中细胞的状态都为新鲜生长的细胞；在液相中进行结合的筛选实验，其每次洗涤过程都要经过10次以上的吹打过程，而且要经过5分钟的低速离心，pbst相对pbs的洗涤能力大大增强，所以液相环境中的洗涤强度实际比固相表面筛选过程要大。可以更好的减轻非特异性结合作用的影响。需要再洗涤吹打和离心过程中应该注意尽量保证细胞结构的完整性，否则造成细胞膜破裂会造成一些目标噬菌体多肽的丢失，通过细胞结合前后的平均富集率的方法检测各个单克隆细胞的结合能力，以平均富集率高于阴性对照组的一个数量级以上的标准确定阳性噬菌体克隆株。最后，通过与正常结肠上皮细胞孵育去除与正常结肠上皮结合的非特异性结合克隆。利用正常细胞作为消减细胞目前仍存在较大争议，有学者认为这种负性筛选能够更好地去除非特异性结合的噬菌体多肽，但也有人认为，由于人类细胞表面分子结构和分布非常复杂，有可能在负性筛选过程中使特异性噬菌体多肽克隆丧失功能，本发明中为了避免后者，没有在四轮体外筛选过程中设计负性筛选，而是在四轮筛选过后进行一次负性筛选，旨在不影响目标噬菌体多肽功能的前提下尽量降低非特异性噬菌体多肽的影响。最后，通过基因测序获得相应多肽序列。

该方法方便高效，筛选到的多肽，分子量较小，有效克服了传统单克隆抗体的免疫过敏反应，本发明通过噬菌体展示技术，筛选出与结肠癌细胞表面特异性结合的多肽。该多肽特异性结合在细胞表面，不与正常细胞结合，有望成为靶向分子，用于结肠癌的诊断及靶向治疗。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。