本发明涉及微生物菌剂防治领域，具体涉及一种具有降重金属作用的棘孢木霉胶丸菌剂的制备方法。
背景技术：
重金属污染土壤的方式通常有：矿石开采活动造成，如坑口周围土壤中矿床矿物在水、气、热等环境因素长期作用下形成；采矿废石堆放过程中因淋滤等原因造成。工业污水灌溉农田引发的重金属污染。
为治理土壤重金属污染，通常要加入各种改良剂以改善土壤的理化性质。改良剂本身可降低重金属在土壤中的活性，在植物稳定中起着重要作用，但是，也有不足之处，如治理面积小、生产效率低，制备过程中易造成二次污染。
近年来，国内外开展了大量利用能够富集重金属的生物来消除土壤重金属污染对植物影响的研究。该方法具有高效、经济、环保等优点，成为环境研究中的热点。
木霉菌属丝状真菌，腐生性强，适应性广，对18属29余种病原真菌及多种病原细菌有拮抗作用，被认为是最有前途的生物控制材料之一。
目前国际上已经有多种以木霉菌为主要成分的生物制剂，且效果显著。木霉菌的作用机制包括通过增强根系和植物的发育耐压力、无机盐的增溶和封存、诱导抗性等复杂过程。
本实验室分离出的一株具有降低植物吸收土壤中重金属的木霉菌-棘孢木霉zzy，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名：棘孢木霉trichodemaasperellum；保藏编号：cgmccno.12071；保藏日期：2016年01月14日。经研究，在降低植物吸收重金属方面具有很好的效果。
技术实现要素：
针对棘孢木霉菌是一种具有广泛应用前景的生防菌。本发明目的在于提供一种活性高、效果稳定、持效期长、环境影响小、使用方便、可抑制农作物吸收重金属的棘孢木霉胶丸菌剂。
本发明提供一种棘孢木霉胶丸制作方法，其中主要原料菌粉的制作需要以下过程，
(1)平板培养：1.将本发明使用的真菌棘孢木霉zzy接种在pda平板上，于26℃下恒温培养3d，长满平板后用无菌水制成菌悬液，待用。
所述pda平板培养基为马铃薯培养基，其具体制备方法为：去皮马铃薯200g切成小块，加水500ml煮沸30min，纱布过滤，在滤汁中加入葡萄糖20g，琼脂20g并加热，琼脂完全溶解后补足水分至1000ml，分装，灭菌，待用。
(2)液体培养：液体培养基的体积为100ml，装入500ml的三角瓶中，扎好口，经0.1mp，121℃，20min灭菌。按1-5％接入量接入平板菌种的菌悬液，摇匀，于26℃，160r/min恒温振荡培养箱中培养3d。
所述液体培养液为：葡萄糖3％，蛋白胨0.25％，kh2po40.3％，mgso40.15％，黄豆粉0.25％，起始ph为自然ph。
(3)冻干：将d-海藻糖15％和蔗糖5％与培养好的菌悬液混合，d-海藻糖和蔗糖作为复合保护剂，200r/min摇匀30min，抽滤，将抽滤出来的菌丝体在-20℃冰箱冷冻24h后，冻干，研磨得到菌粉。
(4)制作胶丸：菌粉和海藻酸钠，按照2∶5的比例混合，将海藻酸钠的浓度调至2.5％，再用2ml的无针头注射器吸取后滴入浓度1.5％的无水氯化钙溶液中，静置30min后放入-20℃冰箱中，冷冻24h，冻干，干燥完毕后取出，封存完毕，放入干燥器。
附图说明
图1液体培养基碳源的选择
图2葡萄糖最佳量的确定
图3液体培养基氮源的选择
图4蛋白胨最佳量的确定
图5液体培养基微量元素的选择
图6mg2+最佳量的选择
图7k+最佳量的选择
图8最佳ph值的确定
图9最佳培养基的选择
图10黄豆粉最佳量的选择
图11-12不同保护剂下的孢子数量
图13不同配比胶丸萌发情况
图14为本发明制得的胶丸实图
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1菌剂主要原料-冻干粉的制作
在本实施例中，通过以下方法对真菌菌种棘孢木霉zzy进行培养，包括以下步骤：
(a平板培养：将棘孢木霉zzy接种在pda平板上，于25℃下恒温培养3d，成熟后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。
所述pda平板培养基为马铃薯培养基，其具体制备方法为：去皮马铃薯200g切成小块，加水500ml煮沸30min，四层纱布过滤后，在滤汁中加入葡萄糖20g，琼脂20g并加热，琼脂完全溶解后补足水分至1000ml，分装，121℃高压灭菌20min，备用。
(b)液体培养：液体培养基的体积为100ml，装入250ml的三角瓶中，扎好口，经0.1mp，121℃，20min灭菌。按2-4％量接入平板菌种的孢子悬浮液，摇匀，于26℃，160r/min恒温振荡培养箱中培养3d。
所述液体培养液为：葡萄糖3％，蛋白胨0.25％，kh2po40.3％，mgso40.15％，黄豆粉0.25％，起始ph为自然ph。
所述液体培养基成分及浓度的选择，从图1-10可看出，在上述成分配比时，测得其培养的生物量最大，故使用该配比。
(c)冻干：将培养好的菌悬液添加10％的d-海藻糖和5％的蔗糖作为保护剂，在摇床上摇匀30min，然后进行抽滤，将抽滤出来的菌饼冻在-20℃冰箱，冷冻24h；再将菌饼放在冻干机进行冻干，研磨得到所需的菌粉。
不同冻干保护剂的效果从图11-12可看出。所述冻干保护剂加入后得到的孢子量如上表所示，单一保护剂中，d-海藻糖和蔗糖效果最好，将10％的d-海藻糖和5％的蔗糖复合时，达到最佳，故选用该比例进行复合作为冻干保护剂。
实施例2胶丸菌剂的制作
菌粉和海藻酸钠，按照2∶5的比例混合，将海藻酸钠的浓度调至2.5％，再用2ml的无针头注射器吸取后滴入浓度1.5％的无水氯化钙溶液中，静置30min后放入-20℃冰箱中，冷冻24h，冻干，干燥完毕后取出，封存完毕，放入干燥器。
菌粉与海藻酸钠的比例的确定：按1∶5，2∶5，3∶5，4∶5的比例进行配比，同时对黏度进行调节，以顺畅滴下且不过稀为宜，最终配比定为1g海藻酸钠约加入40ml水。固化剂选用无水氯化钙溶液，当浓度过大时，滴下的胶丸漂浮于溶液上，易形成凝结，最终将浓度定于1.5％，且不影响固化效果。
用同样的平板培养基对胶丸进行萌发，萌发效果从图13可看出，2号平板的萌发效果较理想，且所用菌粉比例较少，所以选用菌粉和海藻酸钠(sa)以2∶5的比例制作胶丸。