抗PD1和CD20双特异性抗体及其应用的制作方法

本发明属于抗体药物开发和生产领域，涉及抗pd-1和cd20的双特异性抗体及其应用。本发明提供了特异性识别和结合pd-1和cd20的双特异性抗体或其功能性片段，还提供了编码所述的双特异性抗体或其功能性片段的核酸分子、用于表达所述双特异性抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞和它们在制备治疗癌症的药物中的应用，以及所述双特异性抗体或其功能性片段的制备方法。
背景技术：
：cd20分子是b细胞表面特有的标志物，绝大多数非霍奇金淋巴瘤都是具有cd20的b细胞，但在干细胞、祖b细胞、正常浆细胞或其他正常组织中均不表达cd20分子。因此，cd20分子是用单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤的一个重要的药物靶点。抗cd20单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab，美罗华)是人鼠嵌合抗体，其广泛用于b细胞淋巴瘤的治疗。利妥昔单抗首先应用于nhl的治疗，单药治疗166例复发或难治的nhl患者，总有效率为48％，完全缓解率为6％，部分缓解率为42％。第三代抗cd20治疗性单抗目前还未上市，包括ocaratuzumab(ame-133v)、pro131921、obinutuzumab(ga101)等。在一项ⅱ期临床实验中，对44名接受初始利妥昔单抗治疗后复发的fl患者用ocaratuzumab治疗，每周4次，共注射375mg/m2，总体反应率仅为36％。同时，在肿瘤患者中，由于pd-1/pd-l1通路所造成免疫抑制等原因，机体对肿瘤细胞的免疫应答通常是无效的。阻断pd-1/pd-l1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，恢复t细胞的抗肿瘤活性，从而增强内源性抗肿瘤免疫效应。阻断抑制通路的pd-1及pd-l1的抗体可竞争性地与pd-1和pd-l1结合，进而阻断pd-1/pd-l1信号通路，使t细胞免疫应答增强，行使杀伤肿瘤细胞的功能。近几年来，研究人员已开发了多个抗pd-1和pd-l1单抗类免疫检查点抑制剂，这些药物有力地促进了癌症免疫治疗的进展。尽管抗pd-1抗体及抗pd-li抗体对某些癌症已经显现出了较好的临床效果，但令人遗憾的是，这些抗体并不是对所有的患者都有效。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是设计并构建一种抗pd-1和抗cd20的双特异性抗体，并使其具有足够的靶向性和生物活性。更重要的是，该双特异性抗体具有全人源序列，有效地避免了临床治疗应用中hama的发生，从而能够更有效地减少了耐药现象的发生，提高了药物的利用效率和治疗效果。本发明提供新的pd-1/cd20双特异性抗体融合蛋白具有针对第一目的抗原的第一特异性和针对第二目的抗原的第二特异性，其具有对于两种不同受体的结合特异性，同时本发明还涉及该双特异性抗体融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的药物用途和使用该融合蛋白的治疗方法。本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其包括：a.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其包括抗pd-1特异性抗体的重链可变区(抗pd-1vh)；以及b.特异性识别和结合cd20的结构域，其包括抗cd20特异性抗体的重链可变区(抗cd20vh)。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域由依次连接的抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)、重链可变区(抗pd-1vh)、铰链区和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)组成，或由一组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由两组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)和重链可变区(抗pd-1vh)组成。优选地，所述特异性识别和结合cd20的结构域由依次连接的抗cd20特异性抗体的轻链可变区(抗cd20vl)、重链可变区(抗cd20vh)、铰链区和fc片段(抗cd20ch2-ch3)组成，或由一组抗cd20特异性抗体的轻链(抗cd20vl-cl)和重链(抗cd20vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由两组抗cd20特异性抗体的轻链(抗cd20vl-cl)和重链(抗cd20vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由抗cd20特异性抗体的轻链可变区(抗cd20vl)和重链可变区(抗cd20vh)组成。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a’.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由一组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成；以及b’.特异性识别和结合cd20的结构域，其由一组抗cd20特异性抗体的轻链(抗cd20vl-cl)和重链(抗cd20vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域与所述特异性识别和结合cd20的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a”.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由一组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成；以及b”.特异性识别和结合cd20的结构域，其由依次连接的抗cd20特异性抗体的轻链可变区(抗cd20vl)、重链可变区(抗cd20vh)、铰链区和fc片段(抗cd20ch2-ch3)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域与所述特异性识别和结合cd20的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a”’.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由依次连接的抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)、重链可变区(抗pd-1vh)、铰链区和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)组成；以及b”’.特异性识别和结合cd20的结构域，其由一组抗cd20特异性抗体的轻链(抗tcd20vl-cl)和重链(抗cd20vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域与所述特异性识别和结合cd20的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a””.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由两组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成；以及b””.特异性识别和结合cd20的结构域，其由两组抗cd20特异性抗体的轻链可变区(抗cd20vl)和重链可变区(抗cd20vh)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域中的每个抗pd-1特异性抗体的重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)的ch3分别与所述特异性识别和结合cd20的结构域中的每个抗cd20特异性抗体的重链可变区(抗cd20vh)通过化学键连接。优选地，所述的抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。优选地，所述特异性识别和结合pd-1的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如seqno:1、5、9或21所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:3、7、11或23所示。优选地，所述特异性识别和结合cd20的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:13、17或25所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:15、19或27所示。优选地，所述抗pd-1特异性抗体的重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)的氨基酸序列为seqidno:29，核苷酸编码序列为seqidno:30；所述抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)的氨基酸序列为seqidno:31，核苷酸编码序列为seqidno:32；由依次连接的抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)、重链可变区(抗pd-1vh)、铰链区和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)组成的所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域的氨基酸编码序列为seqidno:33，核苷酸编码序列为seqidno:34。优选地，所述抗cd20特异性抗体的重链(抗cd20vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)的氨基酸序列为seqidno:35，核苷酸编码序列为seqidno:36；所述抗cd20特异性抗体的轻链(抗cd20vl-cl)的氨基酸序列为seqidno:37，核苷酸编码序列为seqidno:38；由依次连接的抗cd20特异性抗体的轻链可变区(抗cd20vl)、重链可变区(抗cd20vh)、铰链区和fc片段(抗cd20ch2-ch3)组成的所述特异性识别和结合cd20的结构域的氨基酸序列为seqidno:39，核苷酸编码序列为seqidno:40；由抗cd20特异性抗体的轻链可变区(抗cd20vl)和重链可变区(抗cd20vh)组成的所述特异性识别和结合cd20的结构域的氨基酸序列为seqidno:41，核苷酸编码序列为seqidno:42。另一方面，本发明还提供了一种编码所述的抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的核酸分子，或者一种包含所述核酸分子的表达载体，或者一种包含所述表达载体的宿主细胞。优选地，所述特异性识别和结合pd-1的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如seqidno:2、6、10或22所示，轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:4、8、12或24所示。优选地，所述特异性识别和结合cd20的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如seqidno:14、18、26所示；轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:16、20、28所示。再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括所述的抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，或所述的核酸分子，或所述的表达载体或所述的宿主细胞。优选地，所述药物组合物还包括一种或多种其他抗肿瘤药物；优选地，所述药物组合物还与一种或多种其他抗肿瘤治疗方法，例如化学疗法、放射疗法和/或生物疗法一起使用。进一步地，本发明还提供了所述的抗pd-1和cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段、或所述的核酸分子、或所述的表达载体或所述的宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。具体地，所述肿瘤为非霍奇金淋巴瘤。本发明提供了能够同时特异结合程序性死亡因子1(pd-1)和cd20的双特异性抗体、突变体及其功能性片段。本发明的双特异性抗体、突变体或其功能性片段具有以下特性的至少一种：a.能够与pd-1以高特异性结合，并阻断pd-1和pd-l1的相互作用；b.与其它cd28家族成员(如icos、ctla-4和cd28)不发生结合；c.能够与cd20以高特异性结合；d.与其他b细胞分化抗原(如cd19，cd22)不发生结合；e.激活免疫细胞(如肿瘤特异性t细胞)，并特异识别cd20阳性肿瘤细胞，促进cd8+t细胞进入肿瘤组织，使ifn-γ等免疫效应物的水平大大增加，从而实现靶向杀伤肿瘤细胞。本发明还提供了人源化的抗pd-1/cd20双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段。所述人源化抗体由免疫小鼠产生的鼠源抗体经由计算机模拟设计并结合噬菌体展示技术而得到，并且根据其与不同物种的pd-1和cd20蛋白胞外结构域的结合特性，鉴定其相应的结合表位。本发明所述的人源化抗pd-1/cd20双特异性抗体、变体及其功能性片段具备上述pd-1/cd20双特异性抗体及其功能性片段的有利特性。本发明所述变体和功能片段包括通过化学修饰或通过掺入脂质体中能够增加半寿期的任何片段，修饰后的片段保留与其来源抗体相同的结合特异性和亲和力，这样获得的新的具有双特异结合特性的蛋白分子也在本发明保护的范围内。在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。本领域技术人员可以将编码本发明所述抗pd-1/cd20双特异性抗体的dna分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了以图1a-d所示双特异抗体为例的重组dna载体。编码图2所示pd-1/cd20双特异抗体的变体及功能片段的载体及宿主细胞也在本发明保护的范围内。本发明所述宿主细胞可以为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选bhk细胞、cho细胞、nso细胞或cos细胞。本发明从重组体培养液中获得相应的双特异性抗体，并用细胞elisa和流式细胞术来检测其对pd-1和cd20的结合活性。实验结果表明，本发明的双特异性抗体能够结合cd20阳性的细胞，如raji细胞，也能够结合t淋巴细胞，因此本发明所构建的双特异性抗体可以有效靶向cd20阳性淋巴瘤细胞和t淋巴细胞。鉴于以上pd-1抗体和cd20单克隆抗体的缺点，如果把能够增强t淋巴细胞功能的pd-1抗体分子与靶向b淋巴瘤细胞的分子cd20抗体分子融合，这样就能够有效地在非霍奇金淋巴瘤细胞周围富集t淋巴细胞，在防御免疫逃逸的基础上，能够更有效地靶向杀伤肿瘤细胞，从而大大提高了杀伤肿瘤细胞的效果。因此，本发明将pd-1抗体和cd20抗体设计成pd-1/cd20双特异性抗体，使细胞毒性t淋巴细胞靶向到肿瘤细胞，既避免了免疫逃逸，又能精确杀伤肿瘤细胞，比单纯利用pd-1抗体或cd20抗体的杀伤效能更充分、更精确，大大提高了抗体治疗非霍奇金淋巴瘤患者的临床效果，有更好的临床应用价值。本发明应用纯化方法获得高纯度的双特异性抗体后，在体外检测其对t淋巴细胞的激活作用，还利用体外细胞模型和体内动物模型来检测其对b细胞淋巴瘤生长的抑制作用。在体外实验中，用mtt等方法检测本发明的双特异性抗体对pd-1表达阳性的t淋巴细胞的增殖作用，或用mtt等方法检测其对cd20表达阳性的淋巴瘤细胞如raji细胞的生长抑制作用。在体内实验中，上述cd20阳性的肿瘤细胞可以用来构建小鼠肿瘤模型，肿瘤模型可通过腹背侧皮下、腹腔、尾静脉等方法构建，以用于观察双特异性抗体的抗肿瘤或抗转移实验。本发明提供的包含pd-1抗体和cd20抗体的人源双特异性抗体蛋白在体内外都具有良好的生物活性和稳定性，能够同时结合pd-1和cd20阳性的细胞，并且能够激活人t淋巴细胞，靶向杀伤非霍奇金淋巴瘤细胞。本发明的有益效果在于提供了一种人源化的pd-1/cd20双特异性抗体，其可以结合pd-1和cd20阳性的细胞，并且能够增强t淋巴细胞的功能，从而达到靶向抗非霍奇金淋巴瘤细胞的作用，较目前临床应用的pd-1抗体和cd20单克隆抗体，具有更加强大的杀伤能力，在临床应用中具有很好的应用前景。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1为本发明所述抗pd-1/cd20双特异性抗体的结构示意图。图2为本发明所述抗pd-1/cd20双特异性抗体的功能性片段或变体的结构示意图。图3为纯化人源化pd-1、cd20胞外结构域的sds-page检测结果。图4为抗pd-1单克隆抗体与抗cd20单克隆抗体的elisa检测结果。图5分别显示抗pd-1单克隆3、21、45与77与cd28家族蛋白的结合。图6分别显示抗pd-1单克隆3、21、45与77对pd-l1蛋白与人t细胞的pd-1结合的封闭作用。图7分别显示抗cd20单克隆8、65与cd20蛋白的特异性结合。图8显示编码本发明的双特异抗体的重组质粒图谱。图9显示流式细胞术检测双特异性抗体对raji细胞的结合效应的结果，左图：抗-pd1/抗-cd20；右图：对照抗体。图10显示双特异抗体中抗pd-1抗体部分的亲和力能力实验结果；图11显示本发明的pd-1/cd20双特异性抗体对pd-1和cd20的特异结合；图12显示双特异性抗体的体外肿瘤细胞生长抑制活性；图13显示双特异性抗体抑制小鼠体内移植瘤的生长的实验结果，其中纵坐标为肿瘤体积。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1抗pd-1/cd20双特异性抗体的结构设计本发明提供了一些可同时特异性结合pd-1与cd20胞外结构域的双特异性抗体的结构模型，此类抗体4种主要实施例的结构如图1所示，图1(a-c)中3种异源二聚体的形成均基于本领域技术员所熟知的ch3结构域突变技术(“knobandholemutation”)(vonkreudensteinetal.，mabs.20135(5):646-54)。(其中，(a)抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)-重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)对与抗cd20特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)-重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)对组成的双特异性结合蛋白；(b)抗pd-1特异性抗体的轻链-重链对与cd20轻链可变区(抗cd20vl)、重链可变区(抗cd20vh)、铰链区和fc片段(抗cd20ch2-ch3)融合蛋白组成的双特异性结合蛋白；(c)抗pd-1轻链可变区、重链可变区、铰链区和fc片段融合蛋白与抗cd20特异性抗体的轻链-重链对组成的双特异性结合蛋白；(d)抗pd-1特异性抗体的轻链与抗pd-1特异性抗体的重链、抗cd20轻链可变区(抗cd20vl)和重链可变区(抗cd20vh)融合蛋白组成的双特异性结合蛋白。抗pd-1/cd20双特异性抗体的变体及功能性片段的实施例如图2所示，图2e-h中的双特异抗体变体及功能性片段的形成基于本领域技术员所熟知的融合肽技术(以多肽链或蛋白质将不同结构域连接，进而实现融合表达)，图2i中异源二聚体的形成基于本领域技术员所熟知的ch3结构域突变技术(同图1a-c)(e)抗pd-1的重链可变区(抗pd-1vh)与抗cd20重链可变区(抗cd20vh)的融合蛋白；(f)抗pd-1的单链可变片段(scfv)与抗cd20的scfv组成的融合蛋白；(g)抗pd-1的单链可变片段(scfv)与抗cd20的scfv组成的非免疫球蛋白融合蛋白；(h)抗pd-1轻链可变区、重链可变区、铰链区、fc片段与抗cd20轻链可变区、重链可变区组成的四价融合蛋白；(i)抗pd-1轻链可变区、重链可变区、铰链区和fc片段融合蛋白与抗cd20轻链可变区、重链可变区、铰链区和fc片段融合蛋白组成的双特异性结合蛋白(注：图中特异识别pd-1与cd20的功能片段位置可互换)。实施例2抗pd-1/cd20双特异性抗体抗原(人pd-1和cd20胞外可溶结构域)的制备在uniprot数据库获得人源pd-1和cd20胞外结构域的编码基因序列，通过全基因合成的方式获得编码基因pd-1ed-cds和cd20ed-cds，合成产物在经bamhi、ecori(pd-1ed-cds)和bamhi、xbai(cd20ed-cds)双酶切后，克隆到pcdna3.1载体，利用cho细胞作为宿主细胞进行蛋白质表达，利用亲和层析、离子交换层析等纯化技术对目的蛋白进行纯化。图3显示人源pd-1与cd20胞外结构域蛋白纯化并进行去糖基化处理后的sds-page检测结果图。实施例3抗人pd-1与cd20抗体的获得1.免疫动物将1mg/ml已纯化的人pd-1或cd20胞外结构域蛋白100μl分别与等体积弗氏完全佐剂室温下均匀混合后，腹部皮下多点注射入6-8周balb/c小鼠体内。7天后，将1mg/ml蛋白100μl与等体积弗氏不完全佐剂在室温下均匀混合后，腹部皮下多点注射入小鼠体内。七天后，重复上面步骤。七天后，重复上面步骤。第四次注射后三天，断鼠尾尖取血15μl，室温下静置2h，25℃，6000-8000rpm，离心10-15min，取上清，通过elisa实验检测效价。若效价检测可用即眼部取全血，室温下静置2h，25℃，6000-8000rpm，离心10min，取上清，-80℃保存。若效价不可用，继续免疫一次。2.细胞融合无菌取小鼠脾细胞并制成细胞悬液，将1×108个脾细胞与2-5×107个骨髓瘤(sp2/0-ag14)细胞融合，50％peg作融合剂，以hat选择培养基培养3-10天后，以ht培养基进行培养，培养条件为5％co2，37℃。3.阳性克隆筛选利用elisa反应筛选单克隆杂交瘤细胞中可分泌结合pd-1或cd20胞外结构域的蛋白抗体的克隆，分别是筛选出结合pd-1(克隆3、21、45、77)和cd20(克隆8、65)的优选克隆，克隆均可特异性识别相应的抗原蛋白。实施例4抗pd-1抗体与其他cd28家族蛋白的结合鉴定为鉴定筛选出的pd-1抗体的特异性，将cd28家族的成员蛋白pd-1、cd28、ctla-4和icos(r&dsysterm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入100μl侯选抗体(1μg/ml)，37℃孵育1h；洗涤5次后加入稀释的hrp标记山羊抗小鼠抗体(abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入opd底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。用酶标仪测定490nm处各孔的吸光值。实验结果如图5，候选克隆分泌的抗体不结合除pd-1外的cd28家族成员蛋白。实施例5抗pd-1抗体对人t细胞的pd-1受体与pd-l1结合的封闭实验1.人外周血t细胞的分离抽取健康志愿者外周血10ml，缓慢加入装有5ml淋巴细胞分离液的离心管中，2500rpm，20min，取出白膜层，以pbs洗涤3次，获得人外周血单核细胞pbmc。分离得到的pbmc，加入100μl/mlcd3抗体(invitrogen)，轻吹混匀，室温孵育15min；加入5μl/ml免疫磁珠(invitrogen)，4℃下孵育60min，每10分钟震荡一次；以pbs冲洗并稀释，将细胞悬液注入填有不锈钢毛的特制试管中，放入分离器进行分离纯化，强磁场下t细胞不能通过分离器，得以纯化。2.人pd-l1胞外结构域与绿色荧光蛋白融合蛋白的制备在uniprot数据库获得人pd-l1胞外结构域编码基因序列，通过全基因合成的方式获得编码基因，合成产物在经ecori、xhoi双酶切后，克隆到pegfp-n1载体，利用cho-s细胞作为宿主细胞进行蛋白质表达，利用亲和层析、离子交换层析等纯化技术对目的蛋白进行纯化，获得绿色荧光蛋白融合表达的人源pd-l1胞外结构域蛋白rh-pd-l1-gfp，图6(a)显示融合蛋白的表达与纯化并进行区糖基化处理后的sds-page结果。3.抗pd-1抗体对人t细胞的pd-1受体与pd-l1结合的封闭实验将优选克隆产生的4种抗体(1μg/ml)与rh-pd-l1-gfp(1μg/ml)室温下轻柔混合30min，然后将混合蛋白溶液加入分离纯化出的人外周血t细胞，室温孵育15分钟后以pbs清洗3次，以流式细胞仪进行分析。由图6(b-f)，克隆3、21和77可阻碍pd-l1与人t细胞上的pd-1受体的结合，克隆45的阻断效果较差。实施例6抗cd20抗体与cd19、cd33和cd138的结合鉴定将cd20、cd19、cd33和cd138(r&dsysterm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入100μl侯选抗体(1μg/ml)，37℃孵育1h；洗涤5次后加入稀释的hrp标记山羊抗小鼠抗体(abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入opd底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。用酶标仪测定490nm处各孔的吸光值。实验结果如图7，候选克隆分泌的抗体不结合cd19、cd33和cd138蛋白。实施例7抗pd-1和cd20候选抗体可变区序列的获得分别扩大培养抗pd-1克隆3、21、77和抗cd20克隆8、65，培养至细胞量为109个，离心收集细胞，去除细胞培养液，以预冷的pbs缓冲液(6-8ml)轻轻洗涤细胞两次；以trizol试剂盒(takara)提取总rna，以紫外分光光度计检测rna的纯度与浓度；以总rna为模板，逆转录获得cdna，逆转录体系20μl，其中5×逆转录buffer(4μl)，dntp(1μl)，mgcl2(2.4μl)，pd(n6)随机引物(1.5μl)，rna模板(2μg)，逆转录酶(1μl)，depc水(至20μl)。以cdna为模板，扩增杂交瘤中可变区的dna序列，扩增引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补(orlandir，etal.cloningimmunoglobulinvariabledomainsforexpressionbypolymerasechainreaction.proc.natl.acad.sci.usa,1989,86：3833)，扩增体系50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)。扩增产物克隆至pmd19载体，经蓝白斑筛选后，重组子测序，获得的抗pd-1克隆3、21、77的重链和轻链可变区氨基酸序列见seqno:1和3，5和7，9和11；编码相应氨基酸的核苷酸序列见seqno:2和4，6和8，10和12。获得的抗cd20克隆8、65的重链和轻链可变区氨基酸序列见seqno:13和15，17和19；编码相应氨基酸的核苷酸序列见seqno:14和16，18和20。实施例8抗pd-1与cd20抗体的人源化改造利用获得的抗pd-1与cd20抗体的可变区氨基酸序列(实施例7获得的序列)，利用imgt/v-quest在线服务器分析抗体亚型，综合kabat、chothia及imgt三种抗体的cdr区的numbering方案确定抗体轻链与重链的六个cdr区序列；利用ds软件进行小鼠亲本抗体fab及其嵌合人源化抗体fab的空间结构，获得嵌合抗体的分子模型后，对亲本fab和嵌合抗体fab初始模型采用分子动力学模拟进行全面的优化，提取稳定的平均构象；利用表位扫描检验设计的人源化抗体可能存在的线性表位与构象表位，确定必须保留的框架区氨基酸位点后，设计不同的氨基酸突变位点获得人源化抗体。在此基础上，我们得到了多个人源化抗体，其中评分最高的抗pd-1和抗cd20抗体序列分别为克隆81和克隆34，克隆81的重链和轻链氨基酸序列分别为seqidno:21和23，编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为seqidno:22和24；克隆34的重链和轻链氨基酸序列分别为seqidno:25和27，编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为seqidno:26和28。实施例9抗pd-1/cd20双特异性抗体表达载体的构建本发明的抗pd-1/cd20双特异性抗体中的抗pd-1(克隆81，制备方法见实施例8)的可变区编码核苷酸pd-1-vh和pd-1-vl，抗cd20(克隆34，制备方法见实施例8)的可变区编码核苷酸cd20-vh和cd20-vl，igg1重链恒定区ch1、铰链区、fc和fc-knob和fc-hole编码核苷酸，以及轻链恒定区cl的kappa链编码核苷酸，以及链接scfv的多肽(ggggs)3编码基因得自于lifetechnologiesinc.(carlsbad，ca)。同时，为了抗pd-1/cd20抗体能在cho细胞中表达，并能分泌到培养基中，选择了分泌tnf-α的前导肽序列作为分泌信号肽。双特异性抗体pd-1/cd20的n端加上了分泌信号肽以及his6标签，不但能够保证其分泌到哺乳细胞外，而且还能够利用亲和层析纯化，并能够进一步利用酶切除标签而只保留活性双特异性抗体蛋白。图1中所示4种结构的双特异性抗体中的各个不同链，vl和cl、vh和ch1、ch1和fc(fc-knob、fc-hole)、scfv和fc(fc-knob、fc-hole)、fc和scfv通过重叠pcr的方式获得。pcdna3.1和pires作为表达载体以制备双特异性抗体。实施例10本发明的双特异性抗体在细胞中的表达和纯化本发明的双特异性抗体是在cho-s细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用镍柱亲和层析的方法纯化得到。1.抗pd-1/cd20双特异性抗体在cho-s细胞中的瞬时表达获得高纯度编码双特异性抗体pd-1/cd20的重组质粒后，利用lipofectamine2000质粒转染试剂盒(invitrogen公司)将重组质粒转染cho细胞(atcc)，在无血清培养基中培养三天后收集cho细胞上清液，可以用免疫印迹检测双特异性抗体的表达。此方法可用于快速地获取少量的双特异性抗体蛋白，其浓度可以用elisa法定量检测，所用一抗可以为抗his6抗体。2.抗pd-1/cd20双特异性抗体在cho-s细胞中的稳定表达将编码双特异性抗体的重组质粒用lipofectamine2000质粒转染试剂盒转染cho细胞，在无血清培养基中培养两天后加入潮霉素，采用有限稀释法进行细胞克隆培养，大约14天后挑取潮霉素抗性的细胞克隆进行细胞的扩大培养，并选取状态良好的细胞在液氮中冷冻保存。稳定转染后的cho-s细胞进一步扩大培养以生产大量的双特异性抗体蛋白，此方法可用于获取大量的双特异性抗体pd-1/cd20，其浓度可以用elisa法定量检测，所用一抗可以为抗his6抗体。3.双特异性抗体pd-1/cd20的纯化包含双特异性抗体的细胞培养液可采用镍柱亲和层析的方法进行纯化。将镍层析柱以缓冲液平衡后，将超滤器浓缩过的cho-s细胞培养液上清液进样，以a280(nm)进行监测，用清洗液洗至未结合的蛋白全部被洗脱，然后用洗脱液洗脱结合蛋白。纯化后的双特异性抗体用elisa法检测浓度。实施例11本发明双特异性抗体与细胞的体外结合实验本发明的双特异性抗体(序列参见实施例8)在体外能够富集t淋巴细胞至相应的靶细胞。本发明以raji细胞作为cd20阳性的细胞，并以本发明的双特异性抗体来检测其细胞结合活性。1.双特异性抗体与raji细胞的结合活性对照抗体或双特异性抗体20μl与1×106个raji细胞混合，37℃下孵育30分钟。pbs缓冲液洗涤2次，然后与鼠抗his6抗体在冰上孵育30分钟。pbs缓冲液洗涤，与pe标记的兔抗鼠抗体在染色缓冲液中在冰上孵育30分钟。pbs缓冲液洗涤2次，上流式细胞仪进行分析。结果显示，本发明的双特异性抗体与cd20单克隆抗体相比，具有更强结合cd20阳性的raji细胞的能力，并且差异较为显著(见图9)。2.双特异性抗体中抗pd-1抗体的亲和力鉴定将pd-1-his重组蛋白按2μg/ml包被到酶标板中，4℃下静置过夜。用pbst洗3次。用0.1％的bsa室温封闭1小时。用pbst洗3次，将实施例2制备获得的pd-1/cd20抗体配制成200μg/ml浓度，并进行梯度稀释，每孔加入30μl，室温静置30分钟。用pbst洗3次，加入偶联hrp的抗人fc的酶标二抗，室温静置1小时。用pbst洗4次，加入tmb显色，并用2m的h2so4终止反应，酶标仪读数。从结果可看出，筛选得到的抗体对pd-1具有较好的亲和力，而且其能力与阳性对照nivolumab相近(图10)。实施例12抗pd-1/cd20双特异性抗体的特异性结合鉴定将pd-1、ctla-4、cd20和cd19(r&dsysterm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入纯化的4种抗体(序列参见实施例8，结构参见图1a-d)(100μg/ml)的梯度稀释液(pbs连续稀释(1：102，1：103，1：104，1：105，1：106，1：107，1：108，1：109)，100μl/孔，37℃孵育1h；洗涤5次后加入稀释的hrp标记山羊抗小鼠抗体(abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入opd底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。用酶标仪测定490nm处各孔的吸光值。实验结果如图11，4种双特异性抗体可同时特异性识别pd-1和cd20。实施例13本发明的双特异性抗体的体外肿瘤细胞生长抑制活性检测本发明利用raji细胞作为细胞模型来检测双特异性抗体对raji细胞的体外生长抑制作用。在96孔细胞培养板内接种raji细胞，按照t淋巴细胞与raji细胞10：1的比例将t淋巴细胞加入到培养板内，同时将不同浓度的双特异性抗体加入到细胞培养孔。继续培养细胞后，每孔加20μlmtt。继续孵育4小时后，吸弃细胞培养孔内的上清液，每孔加150μl二甲基亚砜(dmso)，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm波长的吸收值，绘制细胞生长曲线。结果显示，较pd-1抗体组和cd20单克隆抗体组，本发明的双特异性抗体(序列见实施例8，结构见图1d)能显著抑制raji细胞的生长，与对照组有显著差异(见图12)。实施例14本发明的双特异性抗体pd1/cd20对小鼠体内移植瘤生长抑制的检测本发明利用raji细胞来接种scid小鼠以检测双特异性抗体对raji细胞的体内生长抑制作用。4-5周龄scid小鼠(体重为18-20g/只)分为4组。小鼠腋下接种raji细胞l×107/ml，0.2ml/只，建立淋巴瘤裸鼠模型。一组raji接受vehicle(pbs)，另一组接受5μg双特异性抗体(pd-1/cd20bsab)处理，其余两组均为阳性对照组：抗pd-1抗体对照组(实施例8制备的克隆81)和抗cd20单克隆抗体对照组(实施例8制备的克隆34)，处理方案为隔天尾静脉注射5次。15天后，测量肿瘤大小，结果见表1。表1双抗对肿瘤的抑制作用结果组别肿瘤体积(cm3)pbs对照组2.76±0.5pd-1抗体对照组1.65±0.2*cd20单克隆抗体组1.62±0.08*双抗组1.20±0.1**#&注：与pbs对照组比较**p<0.01，*p<0.05；与pd-1抗体对照组比较#p<0.05；与cd20单克隆抗体组比较&p<0.05。图13显示，比pbs对照组相比，抗pd-1抗体对照组、抗cd20单克隆抗体对照组和本发明的双特异性抗体组(序列参见实施例8，结构参见图1d)能够明显抑制移植瘤的生长(p<0.01)；与抗pd-1抗体对照组和抗cd20单克隆抗体对照组相比，本发明的双特异性抗体能够更加有效抑制raji移植瘤的生长，且差异具有显著性(p<0.05)。实施例15抗pd-1/cd20双特异抗体的变体(图2所示的5种变体)体内肿瘤杀伤实验将种植瘤小鼠分为6组，每组4只，以纯化的5种抗pd-1/cd20双特异抗体的变体(图2e-i所示的双抗变体，序列参见实施例8)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为a组：pbs，b组：30mg/kg变体1(图2e)，c组：30mg/kg变体2(图2f)，d组：30mg/kg变体3(图2g)，e组：30mg/kg变体4(图2h)，和f组：30mg/kg变体5(图2i)。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。5种抗pd-1/tem-8双特异性抗体的变体同样具备抑制肿瘤生长的功效(p＜0.01)。表2不同抗体的变体对肿瘤的抑制作用结果组别肿瘤大小对照组1495±33mg变体1(图2e)组218±41mg**变体2(图2f)组129±19mg**变体3(图2g)组86±23mg**变体4(图2h)组87±15mg**变体5(图2i)组82±14mg**注：与对照组比较**p<0.01。上述实施例表明，本发明的人源抗pd-1/cd20双特异性抗体可以在cho细胞中表达，能够进一步通过亲和层析纯化。所得到的双特异性抗体可以结合cd20阳性的raji细胞，并且可以抑制t淋巴细胞的凋亡，诱导t淋巴细胞靶向杀伤非霍奇金淋巴瘤的作用，并且较单独使用抗pd-1抗体或抗cd20抗体具有更显著的杀伤效能。<110>顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司<120>抗pd1和cd20双特异性抗体及其应用<130>shunhobimab-pd-1xcd20<160>42<170>patentinversion3.3<210>1<211>120<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆3重链的氨基酸序列<400>1glnglyglnleuvalglnserglyglygluvallyslysproglyala151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyglyiletrptyraspglyserlysargtyrtyrasnglulysphe505560lysasnargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargargasptyrphepheasptrptyrpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrvalthrvalserser115120<210>2<211>360<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆3重链可变区的核苷酸序列<400>2cagggccagctggtgcagagcggcggcgaggtgaagaagcccggcgccagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacaccttcaccaactactacatgcactgggtgaggcaggcc120cccggccagggcctggagtggatgggcggcatctggtacgacggcagcaagaggtactac180aacgagaagttcaagaacagggtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctac240atggagctgagcagcctgaggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggagggac300tacttcttcgactggtacttcgactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc360<210>3<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆3轻链可变区的氨基酸序列<400>3gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserglnservalserthrser202530glytyrsertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro354045argleuleuiletyraspalasertyrleugluserglyileproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleulysileser65707580serleugluprogluaspvalglyvaltyrtyrcysglnhisserser859095asntrpproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105110<210>4<211>333<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆3轻链可变区的核苷酸序列<400>4gagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagccagagcgtgagcaccagcggctacagctacctggcctggtac120cagcagaagcccggccaggcccccaggctgctgatctacgacgccagctacctggagagc180ggcatccccgccaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagc240agcctggagcccgaggacgtgggcgtgtactactgccagcacagcagcaactggcccctg300accttcggccagggcaccaagctggagatcaag333<210>5<211>114<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆21重链可变区的氨基酸序列<400>5glnvalglnleuvalgluserglyalagluvalvalglnproglyarg151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrilethrpheserasp202530tyrtyrmettyrtrpvalargglnalaproglyhisglyleuglutrp354045ileglytyrileasnproserasnglyglythrasnpheasnglulys505560phelysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleu65707580pheleuglnmetasnserleuglnpheaspaspthralavaltyrtyr859095cysalathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval100105110serser<210>6<211>342<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆21重链可变区的核苷酸序列<400>6caggtgcagctggtggagagcggcgccgaggtggtgcagcccggcaggagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacatcaccttcagcgactactacatgtactgggtgaggcag120gcccccggccacggcctggagtggatcggctacatcaaccccagcaacggcggcaccaac180ttcaacgagaagttcaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacaccctg240ttcctgcagatgaacagcctgcagttcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaccaac300gacgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc342<210>7<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆21轻链可变区的氨基酸序列<400>7aspilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserlysglyvalsersertyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnserproargleuleuile354045tyrleualasertyrleugluserglyvalproaspargphesergly505560serglyserglythraspphethrleulysileserargvalgluala65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserargaspleuprotyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>8<211>321<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆21轻链可变区的核苷酸序列<400>8gacatcgtgatgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagcaagggcgtgagcagctacctgcactggtaccagcagaagccc120ggccagagccccaggctgctgatctacctggccagctacctggagagcggcgtgcccgac180aggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagggtggaggcc240gaggacttcgccgtgtactactgccagcagagcagggacctgccctacaccttcggccag300ggcaccaagctggagatcaag321<210>9<211>115<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆77重链可变区的氨基酸序列<400>9glnglyglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015thrcysthrvalthrglytyrserilethrserasptyrsertrpasn202530trpileargglnalaproilehisglyleuglutrpileglytyrile354045asntyralaglyserthrsertyrasnproserleuglualavalthr505560ilethralaasplysserthrserthralatyrmetgluleuserser65707580leuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargtrpphegly859095serthralatrptyrileaspvaltrpglyglnglythrthrvalthr100105110valserser115<210>10<211>345<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆77重链可变区的核苷酸序列<400>10cagggccagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccacctgcaccgtg60accggctacagcatcaccagcgactacagctggaactggatcaggcaggcccccatccac120ggcctggagtggatcggctacatcaactacgccggcagcaccagctacaaccccagcctg180gaggccgtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagc240ctgaggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggtggttcggcagcaccgcctgg300tacatcgacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc345<210>11<211>109<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆77轻链可变区的氨基酸序列<400>11aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugln151015proalaserilesercyslysserserglnalaleuleuhisserasp202530glylysthrtyrleutyrtrptyrleuglnlysproglyglnserpro354045lysleuleuiletyrgluleuserserargpheserglyileproasp505560argilethrglyserglythraspphethrleulysileserargval65707580glualagluaspleuglyvaltyrphecyspheglnglyvalhisile859095protyrserpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>12<211>327<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆77轻链可变区的核苷酸序列<400>12gacgtggtgatgacc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