一种景天属植物的遗传转化方法与流程

本发明涉及一种景天属植物的遗传转化方法。
背景技术：
：镉(Cd)对所有的有机体都具有严重的毒害作用。目前我国土壤镉污染形式严峻，且有逐年加重的趋势。土壤中的镉具有很强的迁移能力，很容易被植物吸收，并通过食物链进入人体，严重危害人们的身体健康。植物修复(Phytoremediation)是治理镉等土壤重金属污染的一种理想途径。近年来研究较多的镉超富集植物有鼠耳芥、遏蓝菜、东南景天和伴矿景天。镉超富集植物同时也是锌的超富集植物。相对其它镉超富集植物来说，伴矿景天具有镉富集能力强，生物量大等特点(CaoD,ZhangHZ,WangYD,ZhengLN(2014)Accumulationanddistributioncharacteristicsofzincandcadmiuminthehyperaccumulatorplantsedumplumbizincicola.B.Environ.Contam.Tox.93,171-176.)。近年来，关于伴矿景天在镉污染土壤植物修复中的研究较多，种植伴矿景天7年之后，土壤中Cd含量降低了87.8％(DengL,LiZ,WangJ,LiuHY,LiN,WuLH,HuPJ,LuoYM,ChristieP(2016)Long-termfieldphytoextractionofzinc/cadmiumcontaminatedsoilbySedumplumbizincicolaunderdifferentagronomicstrategies.Int.J.Phytoremediat.18,134-140.)。目前利用镉超富集植物进行镉污染土壤的植物修复需要长期大量的投资，很难实现大规模商业化应用。关于伴矿景天的研究只停留在小规模的试验阶段，还很难以实际应用。因此，培育具有经济效益的超富集工程植物对镉污染土壤的持续性植物修复具有重要意义。深入研究伴矿景天等超富集植物镉富集和解毒的分子机制，挖掘镉富集相关基因，进而可以为获取镉超富集的工程修复植物提供理论基础和基因元件。若要进行伴矿景天基因功能的研究，前提是能够对其进行基因操作。建立超富集植物的遗传转化体系是揭示这类特殊生境植物对重金属吸收、转运分子机理的关键手段。而且，伴矿景天只对镉锌具有高抗性和超富集能力，但对其它重金属如砷铜汞等却不具有超富集和高抗性。如果能够实现伴矿景天遗传转化，将会极大地促进植物对镉超富集分子机制的研究和相关功能基因的挖掘，并且可以获取对多种重金属复合污染具有抗性和修复能力的伴矿景天工程植物。技术实现要素：本发明的目的是提供一种景天属植物的遗传转化方法。本发明首先保护一种景天属植物的遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)取景天属植物的茎段，诱导丛生芽形成，得到分生组织块；(2)取步骤(1)得到的分生组织块，与重组农杆菌进行共培养；所述重组农杆菌是将具有目的DNA分子的质粒导入出发农杆菌得到的；(3)取步骤(2)得到的分生组织块，诱导生芽；(4)取生芽的分生组织块，诱导生根。步骤(1)中，所述诱导丛生芽形成是在芽诱导培养基上进行的；所述芽诱导培养基为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)含有6-BA和NAA的培养基；(a2)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(a3)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基。步骤(1)中，诱导丛生芽形成的培养时间可为3-6周。步骤(1)中，诱导丛生芽形成的过程中，每周继代一次，均采用芽诱导培养基。步骤(1)中，诱导丛生芽形成的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。步骤(1)中，茎段的制备方法具体如下：取景天属植物的茎，灭菌后纵向切成茎段。每个茎段具有1个茎节。每个茎段的长度为1厘米左右。灭菌的方法具体如下：用自来水冲洗干净→用75％(体积比)酒精水溶液消毒30s→用无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干→用0.1g/100mLHgCl2水溶液浸泡6分钟(期间轻轻摇动)→用无菌水至少冲洗4次后用无菌滤纸吸干。步骤(1)中，诱导丛生芽形成后，选择生长状况良好、丛生芽密集成团(>40个/茎节)的茎段组织块，切除丛生芽的叶片，并进一步将丛生芽切成块(1cm左右小块)，即为分生组织块。所述质粒上具有潮霉素抗性基因。所述潮霉素抗性基因具体可为潮霉素磷酸转移酶基因(HPT基因)。所述质粒具体可为pSN1301质粒。所述质粒具体可为在pSN1301质粒的多克隆位点插入目的DNA分子得到的重组质粒。所述出发农杆菌为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌C58。步骤(2)中，分生组织块用侵染液侵染后进行共培养。所述侵染液为含有所述重组农杆菌的液相。所述侵染液的OD600nm具体可为2.0。所述侵染液具体可为用含100μMAS的MS液体培养基重悬所述重组农杆菌菌体得到的液相。所述侵染具体可为室温浸泡30min(每隔2-3min震荡一次)。步骤(2)中，所述共培养是在共培养培养基上进行的。所述共培养培养基具体可为如下(d1)、(d2)或(d3)：(d1)含6-BA、2,4-D和AS的培养基；(d2)含0.5mg/L6-BA、1.5mg/L2,4-D和100mg/LAS的培养基；(d3)含0.5mg/L6-BA、1.5mg/L2,4-D和100mg/LAS的MS固体培养基。步骤(2)中，共培养的条件具体可为：25℃暗培养3天。步骤(3)中，所述诱导生芽是在筛选培养基上进行的；所述筛选培养基为如下(b1)至(b9)中的任意一种：(b1)含有6-BA和NAA的培养基；(b2)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b3)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基；(b4)含有潮霉素、6-BA和NAA的培养基；(b5)含有20mg/L潮霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b6)含有20mg/L潮霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基；(b7)含有潮霉素、头孢霉素、6-BA和NAA的培养基；(b8)含有20mg/L潮霉素、600mg/L头孢霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b9)含有20mg/L潮霉素、600mg/L头孢霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基。步骤(3)中，诱导生芽的培养时间可为：培养至苗茎高达到1cm。步骤(3)中，诱导生芽的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。步骤(3)中，诱导生芽的过程中，每周继代一次，均采用筛选培养基。步骤(4)中，所述诱导生根是在根诱导培养基上进行的；所述根诱导培养基为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)含有潮霉素和头孢霉素的培养基；(c2)含有30mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的培养基；(c3)含有30mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的MS固体培养基。步骤(3)中，诱导生根的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。步骤(3)中，诱导生根的过程中，每周继代一次，均采用根诱导培养基。本发明还保护一种制备景天属植物的分生组织块的方法，包括如下步骤：取景天属植物的茎段，诱导丛生芽形成，得到分生组织块；所述诱导丛生芽形成是在以上任一所述芽诱导培养基上进行的。诱导丛生芽形成的培养时间可为3-6周。诱导丛生芽形成的过程中，每周继代一次，均采用芽诱导培养基。诱导丛生芽形成的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。茎段的制备方法具体如下：取景天属植物的茎，灭菌后纵向切成茎段。每个茎段具有1个茎节。每个茎段的长度为1厘米左右。灭菌的方法具体如下：用自来水冲洗干净→用75％(体积比)酒精水溶液消毒30s→用无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干→用0.1g/100mLHgCl2水溶液浸泡6分钟(期间轻轻摇动)→用无菌水至少冲洗4次后用无菌滤纸吸干。诱导丛生芽形成后，选择生长状况良好、丛生芽密集成团(>40个/茎节)的茎段组织块，切除丛生芽的叶片，并进一步将丛生芽切成块(1cm左右小块)，即为分生组织块。以上任一所述培养基的pH具体可为5.8。本发明还保护一种用于景天属植物遗传转化的试剂盒，包括以上任一所述的芽诱导培养基和以上任一所述的筛选培养基。所述试剂盒还包括以上任一所述的根诱导培养基。所述试剂盒还包括以上任一所述的共培养培养基。所述试剂盒还可包括农杆菌，具体可为根癌农杆菌，更具体可为根癌农杆菌C58。所述试剂盒还可包括出发质粒，具体可为具有潮霉素抗性基因的表达载体，更具体可为具有潮霉素磷酸转移酶基因(HPT基因)的表达载体，更具体可为pSN1301质粒。本发明还保护一种用于制备景天属植物的分生组织块的试剂盒，包括包括以上任一所述的芽诱导培养基。以上任一所述景天属植物为东南景天或伴矿景天。所述东南景天具体可为非超富集生态型东南景天。本发明首先通过诱导伴矿景天和非超富集型东南景天的茎节产生大量丛生芽，使得外植体材料上形成众多顶端分生组织，并以这些密集的芽原基作为农杆菌侵染对象，成功地建立了景天属植物的遗传转化体系。本发明提供的方法或试剂盒，具有遗传转化率高的优点，对于景天属植物的遗传转化以及基因工程研究，具有重大的应用推广价值。附图说明图1为实施例1的结果照片。图2为实施例2的结果照片。图3为实施例2中外植体的存活率结果。图4为pSN1301质粒的元件示意图。图5为实施例3中东南景天茎段组织块的照片、在筛选培养基上培养过程中的照片、在根诱导培养基上培养的单个分生组织块的照片及其GUS染色的照片。图6为东南景天在根诱导培养基上培养3-5周的植株照片和在培养基质中栽培2周后的植株照片。图7为对东南景天5个株系进行各个鉴定的结果照片。图8为实施例3中伴矿景天的茎段、以及培养不同时间后的茎段的照片。图9为伴矿景天在筛选培养基上培养2周的照片。图10为伴矿景天在根诱导培养基上培养2-3周的照片。图11为伴矿景天在根诱导培养基上培养3-5周的单个分生组织块的照片及其GUS染色的照片。图12为伴矿景天单个芽的照片及其GUS染色的照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。头孢霉素的作用是防止农杆菌大量生长。培养基质由2体积份花肥、1体积份珍珠岩和1体积份蛭石组成。6-BA全称为6-苄氨基腺嘌呤。NAA全称为1-萘乙酸。2,4-D的全称为2,4-二氯苯氧乙酸。AS全称为乙酰丁香酮。伴矿景天(Sedumplumbizincicola)：伴矿景天为镉超富集植物。参考文献：WuLH,LiuYJ,ZhouSB,GuoFG,BiD,GuoXH,BakerAJM,SmithJAC,LuoYM.2013.SedumplumbizincicolaX.H.GuoetS.B.ZhouexL.H.Wu(Crassulaceae):anewspeciesfromZhejiangProvince,China.PlantSystematicsandEvolution299:487-498.。实施例中所用的东南景天为非超富集生态型东南景天(SedumalfrediiHance,non-hyperaccumulatingecotype)，即参考文献中的“Sedumalfredii(nonhyperaccumulatingecotype,NHE)：参考文献：Peng,J.S.,Ding,G.,Meng,S.,Yi,H.Y.,andGong,J.M.(2017).EnhancedmetaltolerancecorrelateswithheterotypicvariationinSpMTL,ametallothionein-likeproteinfromthehyperaccumulatorSedumplumbizincicola.PlantCellEnviron.doi:10.1111/pce.12929.。实施例1、丛生芽诱导参数的优化以东南景天的茎段为外植体，进行丛生芽诱导，具体步骤如下：1、采集东南景天新鲜的茎，依次进行如下步骤：用自来水冲洗干净→用75％(体积比)酒精水溶液消毒30s→用无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干→用0.1g/100mLHgCl2水溶液浸泡6分钟(期间轻轻摇动)→用无菌水至少冲洗4次后用无菌滤纸吸干。2、完成步骤1后，将茎纵向切成长度为1厘米左右的茎段(每个茎段具有1个茎节)。3、取步骤2得到的茎段，置于芽诱导培养基上培养3周(每周继代一次，均采用相同的芽诱导培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)，然后统计每个茎段诱导产生的芽的数量。芽诱导培养基为含有6-BA和NAA的MS固体培养基(pH5.8)。不同芽诱导培养基中的6-BA浓度、NAA浓度以及步骤3中培养3周后平均每个茎段诱导产生的芽的数量见表1和图1。设置三次重复试验，每次重复试验中每种芽诱导培养基对至少9个外植体进行培养。结果显示，0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的组合能够最有效地诱导丛生芽的形成，平均每个茎段诱导产生的芽的数量达4.40。因此确定0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的组合为诱导丛生芽产生的最佳激素组合。表1植物激素对东南景天丛生芽诱导的影响6-BA(mg/L)NAA(mg/L)平均每个茎段诱导产生的芽的数量0.10.11.30±0.70f0.10.52.11±0.17cde0.11.04.40±0.74a0.11.51.74±0.33de0.50.11.36±0.31e0.50.52.50±0.29bcd0.51.02.83±0.07bc0.51.52.37±0.27bcde1.00.13.37±0.70ab1.00.53.06±1.12bc1.01.02.43±1.08bcd1.01.53.41±0.57ab用伴矿景天代替东南景天进行上述步骤，结果与东南景天一致。实施例2、筛选参数的优化1、同实施例1的步骤1。2、同实施例1的步骤2。3、取步骤2得到的茎段，置于芽诱导培养基上培养3周(每周继代一次，均采用芽诱导培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)。芽诱导培养基为含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基(pH5.8)。4、完成步骤3后，取长有丛生芽的茎段，切除叶片后置于筛选培养基上培养3周(每周继代一次，均采用相同的筛选培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)。筛选培养基为含有抗生素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基(pH5.8)。抗生素为潮霉素(Hyg)时，在筛选培养基中的浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L或40mg/L。抗生素为卡那霉素(Kan)时，在筛选培养基中的浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L或250mg/L。步骤4中，培养3周后的照片见图2。东南景天的丛生芽对潮霉素很敏感，潮霉素浓度为20mg/L以上丛生芽全部死亡。东南景天的丛生芽对卡那霉素的抗性很强，卡那霉素浓度为250mg/L仍然生长状态良好。抗生素为潮霉素时，步骤4中，培养1周、2周和3周后外植体的存活率统计见图3。随着潮霉素浓度的增加及处理时间的延长，外植体的存活率急剧下降。当潮霉素的浓度达到20mg/L时，培养1周后的存活率为29.63％，培养2周后和培养3周后的存活率分别为7.41％和0。用伴矿景天代替东南景天进行上述步骤，结果与东南景天一致。实施例3、遗传转化采用的植物表达载体为pSN1301质粒。pSN1301质粒是在pCAMBIA1301质粒的基础上改造得到的，具有CaMV35S启动子驱动的GUS报告基因。记载有pSN1301质粒的文献为：Guo,J.；Dai,X.；Xu,W.；Ma,M.OverexpressingGSH1andAsPCS1simultaneouslyincreasesthetoleranceandaccumulationofcadmiumandarsenicinArabidopsisthaliana.Chemosphere2008,72，1020-1026.)。pSN1301质粒的元件示意图见图4。图4中：LB代表T-DNA插入左边界；RB代表T-DNA插入右边界；HPT代表潮霉素磷酸转移酶基因；35SP代表CaMV35启动子；MCS代表多克隆位点；GUS代表β-葡萄糖苷酸酶基因。一、侵染液的制备1、将pSN1301质粒导入根癌农杆菌C58，得到重组农杆菌。2、将重组农杆菌接种于5ml含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基，28℃、200rpm培养过夜。3、取步骤2得到的菌液，转接至40ml含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基，28℃、200rpm培养至OD600nm值达到0.5-1.0。4、完成步骤3后，4000g离心10min，收集沉淀。5、取步骤4得到的沉淀，用5ml含100μMAS的MS液体培养基重悬，即为侵染液(侵染液的OD600nm为2.0)。二、对东南景天的遗传转化1、制备分生组织块(1)同实施例1的步骤1。(2)同实施例1的步骤2。(3)取步骤(2)得到的茎段，置于芽诱导培养基上培养3周(每周继代一次，均采用芽诱导培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)。芽诱导培养基为含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基(pH5.8)。(4)完成步骤(3)后，选择生长状况良好、丛生芽密集成团(>40个/茎节)的茎段组织块，切除丛生芽的叶片，并进一步将丛生芽切成1cm左右小块，即为分生组织块。茎段组织块(切除丛生芽的叶片前)的照片见图5A的左图。茎段组织块(切除丛生芽的叶片后)的照片见图5A的右图。2、遗传转化(1)取步骤1制备的分生组织块(进行三次重复试验，每次50个左右分生组织块)，置于步骤一制备的侵染液中室温浸泡30min(每隔2-3min震荡一次)，然后取出并用无菌滤纸吸干。(2)完成步骤(1)后，取分生组织块，置于共培养培养基上，25℃暗培养3天。共培养培养基：含0.5mg/L6-BA、1.5mg/L2,4-D和100mg/LAS的MS固体培养基(pH5.8)。(3)完成步骤(2)后，取分生组织块，无菌条件下用含有300mg/L头孢霉素的无菌水浸泡30min，然后用含300mg/L头孢霉素的无菌水冲洗3-4次，然后放在无菌滤纸上吸干。(4)完成步骤(3)后，取分生组织块，转移到筛选培养基上进行培养(每周继代一次，均采用筛选培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)。筛选培养基：含20mg/L潮霉素、600mg/L头孢霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基(pH5.8)。上述培养的过程中，没有完成遗传转化的分生组织块变成白色或褐色，成功完成遗传转化的分生组织块保持绿色的芽。培养2周的照片见图5B的左图，培养6周的照片见图5B的右图。培养6周后的单个分生组织块的照片(左图)及其GUS染色的照片(右图)见图5C。培养6周后进行统计，以用于遗传转化的分生组织块的数量为分母，平均57.67％的分生组织块具有潮霉素抗性，具有潮霉素抗性的分生组织块中82.35％为GUS染色阳性(有GUS基因表达)，遗传转化效率为47.49％。(5)步骤(4)中，苗茎高达到1cm时，取分生组织块，转移到根诱导培养基上进行培养(每周继代一次，均采用根诱导培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)。根诱导培养基：含30mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的MS固体培养基(pH5.8)。培养2-3周的单个分生组织块的照片(左图)及其GUS染色的照片(右图)见图5D。培养3-5周的植株照片见图6A。根发育良好的植株转移到培养基质中栽培。栽培2周后的照片见图6B。(6)从图5D发现，同一分生组织块上并不是所有的芽都能被染成蓝色，这可能由于部分嵌合体组织被诱导出的假阳性苗。将单个分生组织块中聚集成团的丛生芽分开，将各个芽分别置于根诱导培养基上继续培养(每周继代一次，均采用根诱导培养基；培养条件：25℃，14小时光照/10小时黑暗)。假阳性的芽变白死亡，存活的芽均为为GUS染色阳性(有GUS基因表达)。根诱导培养基：含30mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的MS固体培养基(pH5.8)。(7)以上步骤得到多个株系，随机取5个株系进行鉴定(同一时期未进行遗传转化的东南景天作为对照，野生型，用WT表示)。5个株系分别用L1、L2、L3、L4和L5表示。对植株的根、茎和叶进行GUS染色。照片见图7A。5个株系的根、茎、液均为GUS染色阳性，WT的根、茎、叶均为GUS染色阴性。结果表明，各个株系中，GUS基因已经整合到植物基因组上，并能稳定表达。提取植株的基因组DNA，PCR(正向引物5'–GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG–3'；反向引物5'–CGGTGATACATATCCAGCCAT–3')鉴定GUS基因。结果见图7B。在5个转基因株系中都检测到约1.5kb的GUS基因片段，WT中没有扩增出相应GUS基因片段。应用real-timePCR对植株中GUS基因拷贝数进行鉴定。以pSN1301质粒上单拷贝的GUS基因作为内参基因，以植株的基因组DNA(50μg)为模板，采用绝对定量的标准曲线法进行实验。结果见图7C。不同株系之间GUS基因的拷贝数不同，L5中的拷贝数最多(126copies/μgDNA)，而L1的拷贝数最少(46copies/μgDNA)。结果表明，各个株系中，GUS基因已经整合到植物基因组上，并能稳定表达。三、对伴矿景天的遗传转化用伴矿景天代替东南景天，步骤1的(3)中培养时间为6周，其他同步骤二。图8，由左至右四张照片依次为步骤1的(2)得到的茎段、步骤1的(3)培养1周后的茎段、步骤1的(3)培养2周后的茎段和步骤1的(3)培养3周后的茎段。图9，左图为步骤2的(4)中培养2周的照片，右图为左图中一个分生组织块的局部放大图。图10，左图为步骤2的(5)中在根诱导培养基上培养2-3周的照片，右图为左图中一个分生组织块的局部放大图。图11，步骤2的(5)中在根诱导培养基上培养3-5周的单个分生组织块的照片(左图)及其GUS染色的照片(右图)。图12，为步骤(6)中单个芽的照片(左图)及其GUS染色的照片(右图)。步骤2的(4)中，培养6周后进行统计，伴矿景天的遗传转化效率为10％左右。SEQUENCELISTING<110>中国科学院植物研究所<120>一种景天属植物的遗传转化方法<130>GNCYX170702<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtgggaaagcgcgttacaag21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cggtgatacatatccagccat21当前第1页1 2 3