一种利用ZFN在哺乳动物细胞中实现多个大片段DNA定点整合的方法与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体地，涉及一种利用zfn在哺乳动物细胞中实现多个大片段dna定点整合的方法。
背景技术：
：哺乳动物细胞基因组中进行大片段外源基因的定点整合，通常采用的是双交换同源重组的方法，该技术的实施步骤为通过构建包含目的基因两侧的两个同源臂的打靶供体，利用两个同源臂与目的基因进行双交换同源重组，从而将目的基因替换成两个同源臂之间的外源dna片段来实现的。但是该技术存在如下不足：只能将单个外源dna片段整合进基因组，此外，双交换同源重组的效率一般偏低，一般为10-6；采用该技术实现定点整合的外源dna片段相对较小，一般为2kb以下。具体原因可能是因为两个同源臂的物理距离越大越不利于在目的基因两侧同时进行同源重组交换的发生导致。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种利用zfn在哺乳动物细胞中实现多个大片段dna定点定向整合的方法。本发明能实现多个6kb以上大片段dna在哺乳动物细胞中的定点定向整合。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种在利用zfn在哺乳动物细胞中实现多个大片段dna定点整合的方法，包括如下步骤：(1)构建靶向ccr5基因的单交换zfn打靶系统：单交换zfn打靶系统包括针对切割靶点的左、右zfn表达载体和多个使用不同荧光标记的打靶供体；每个打靶供体的设计包括启动子、荧光标记基因、目的基因左右同源臂以及左右同源臂衔接处的zfn打靶位点的设计；(2)zfn打靶系统共转染哺乳动物细胞，转染后利用流式分选稳定表达荧光的细胞；(3)步骤(2)分选的细胞进行pcr检测和测序鉴定，实现在哺乳动物细胞中进行多个dna大片段的依次定点定向插入。优选地，所述靶向ccr5基因的zfn靶点序列如seqidno：1所示。优选地，本发明能实现2个6kb以上大片段dna在哺乳动物细胞中的定点定向整合。一种在利用zfn在哺乳动物细胞中实现2个6kb以上大片段dna定点整合的方法，包括如下步骤：(1)构建靶向ccr5基因的zfn打靶系统，zfn打靶系统包括seqidno：3所示的ccr5-zfn-l质粒、seqidno：5所示的ccr5-zfn-r质粒、seqidno：7所示的pegfp-ccr5-hr质粒和seqidno：8所示的pdsred-ccr5-hr质粒；(2)将ccr5-zfn-l质粒、ccr5-zfn-r质粒、pegfp-ccr5-hr质粒和pdsred-ccr5-hr质粒共转染hek293t细胞，转染后利用流式分选稳定表达egfp和dsred荧光的细胞；(3)步骤(2)分选的细胞进行pcr检测和测序鉴定，实现在哺乳动物细胞中进行2个dna大片段的依次定点定向插入。其中，pegfp-ccr5-hr质粒和pdsred-ccr5-hr质粒是两种携带不同荧光标记基因的打靶供体，ccr5-zfn-l质粒和ccr5-zfn-r质粒是针对切割靶点设计的左、右zfn表达载体，这两个质粒可以分别表达出左侧锌指蛋白、右侧锌指蛋白，两个锌指蛋白能在靶标位点产生双链断裂缺口(dsb)。优选地，所述转染时，按照每孔hek293t细胞150ngccr5-zfn-l质粒、150ngccr5-zfn-r质粒、100ngpegfp-ccr5-hr质粒、100ngpdsred-ccr5-hr质粒、1μllipofectamine3000、1μlp3000tm和50μlopti-mem培养基添加转染。优选地，当hek293t细胞的汇合度至90％左右时，转染效率高。本技术通过构建靶向ccr5基因的单交换定点打靶供体，实现了通过zfn介导的多个打靶供体的定点整合。单交换介导定点整合的前提为在打靶供体左右同源臂中间产生双链断裂缺口，而在基因组同源序列区域不产生缺口，如此才能保证整个打靶供体的完整插入而不破坏打靶位点的完整性。针对单个打靶供体的定点整合结果，发现zfn介导单个打靶供体整合后，其打靶位点spacer区域存在一定破坏，而针对两种打靶供体的定点整合结果，在转染分别带egfp和dsred标记基因两种打靶供体的情况下，由zfn介导单交换的egfp单阳性细胞的打靶位点是完全完整的，从而能够实现第二个甚至多个打靶供体的整合，针对这种情况，我们认为是由于两种打靶供体共转染的打靶供体浓度是转染单种打靶供体的两倍，转染进hek293t细胞的外来打靶供体相对浓度较高，阻碍了核酸酶在基因组同源区域产生缺口，从而能够保证整合的完整性，实现多个打靶供体的定点整合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明首次采用单交换同源重组的原理将多个大片段外源dna定点整合进哺乳动物细胞的基因组中，相较于传统的双交换同源重组策略，单交换可以较为完整的将多个大片段载体定点插入基因组，且效率较高；其次，本发明发现zfn在介导单交换整合方面比crispr/cas9更具优势。附图说明图1为pegfp-zfn-lredesigned质粒结构示意图。图2为pccr5-zfn-l表达载体结构示意图。图3为pegfp-zfn-rredesigned质粒结构示意图。图4为pccr5-zfn-r表达载体结构示意图。图5为pegfp-n1质粒结构示意图。图6为pegfp-ccr5-hr质粒结构示意图。图7为zfn位点设计以及打靶效率检测；(a)zfn-l、zfn-r在ccr5基因上的位置示意图；(b)野生型和突变型的dna序列以及各突变型的发生频率。图8为单交换介导单种打靶供体定点整合至hek293t细胞ccr5基因；(a)通过单交换或者非同源末端连接介导的单个打靶供体正向定点插入示意图；(b)通过非同源末端连接介导的单个打靶供体反向定点插入示意图；(c)pcr检测zfn介导的单个打靶供体的定点插入方式均为正向插入，而非反向插入；(d)野生型和突变型的dna序列以及各突变型的发生频率。图9为单交换介导两种打靶供体定点整合至hek293t细胞ccr5基因；(a)单交换介导分别带egfp和dsred标记基因的两个打靶供体连续定点插入示意图；(b)pcr检测定点整合情况；(c)野生型和突变型的dna序列以及各突变型的发生频率。图10为pcmv-dsred质粒结构示意图。图11为pdsred-ccr5-hr质粒结构示意图。图12为zfn介导单交换整合效率鉴定；(a)单荧光单细胞克隆图；(b)单细胞克隆pcr检测zfn介导单个打靶供体单交换整合效率。(a)双荧光单细胞克隆图；(b)单细胞克隆pcr检测zfn介导多个打靶供体单交换整合效率。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例11、ccr5基因靶位点选择：根据ccr5基因序列以及zfn基本设计原则，设计靶向人ccr5基因的zfn，具体序列见表1。表1.靶向ccr5基因的zfn序列信息名称序列(5’to3’)zfn靶向位点gtcatcctcatcctgataaactgcaaaag2、hek293t细胞培养与转染：hek293t细胞培养使用10％胎牛血清的dmem高糖培养基，细胞以约1×105个/ml的密度接种于24孔细胞培养板中，待用。待细胞汇合度至90％左右时可用于转染，转染时按照每孔细胞150ngccr5-zfn-l质粒、150ngccr5-zfn-r质粒、100ngccr5-egfp-donor质粒(pegfp-ccr5-hr)、1μllipofectamine3000、1μlp3000tm和50μlopti-mem培养基添加转染，同时设置单转ccr5-egfp-donor质粒处理组和空白对照组。其中，ccr5-zfn-l质粒、ccr5-zfn-r质粒、ccr5-egfp-donor质粒的构建方法如下。ccr5-zfn-l质粒的构建：合成seqidno：2所示以下dna片段ccr5-zfp-l，通过ecori和sacii两个酶切位点，将ccr5-zfp-l克隆进zfn-l表达载体pegfp-zfn-lredesigned(见图1)中，获得靶向ccr5的zfn-l表达载体pccr5-zfn-l。pccr5-zfn-l的序列seqidno：3所示，结构图见图2。ccr5-zfn-r质粒的构建：合成seqidno：4所示以下dna片段ccr5-zfp-r，通过ecori和sacii两个酶切位点，克隆进zfn-r表达载体pegfp-zfn-rredesigned(见图3)中，获得靶向ccr5的zfn-r表达载体pccr5-zfn-r。pccr5-zfn-r的序列seqidno：5所示，结构图见图4。ccr5-egfp-donor质粒(pegfp-ccr5-hr)的构建：合成长度为1640bp如seqidno：6所示的dna片段，通过asei酶切位点克隆进pegfp-n1载体(见图5)，获得pegfp-ccr5-hr质粒。pegfp-ccr5-hr质粒的序列seqidno：7所示，结构图见图6。3、细胞分选：转染后3天，将部分贴壁的hek293t细胞用胰酶消化，1600rpm离心5min，去除上清，添加pbs重悬细胞，经50μm尼龙膜过滤到流式管中，流式细胞分选仪分选出荧光阳性细胞，接收至1.5ml离心管中，以备后续打靶效率鉴定。转染后20天，将荧光阳性细胞分选至1.5ml离心管和96孔培养皿，分别进行后续定点整合鉴定以及单细胞克隆培养整合效率检测。4、测序分析：pcr扩增包含zfn识别位点的ccr5基因片段，将目的片段克隆至t载，转化后挑选若干个单克隆菌落，进行测序分析。5、结果：(1)zfn打靶效率鉴定：本技术设计了针对人ccr5基因的一对zfn，zfn-f和zfn-r(图7.a)。并且通过t-a克隆确定该zfn系统的打靶效率，结果表明在获得的10个单克隆菌落中，3个ccr5-zfn位点发生突变，打靶效率30％(图7.b)。(2)检测单个打靶供体通过单交换机制实现定点整合的情况：针对打靶供体的定点整合情况，我们设计了与ccr5基因组有同源序列且带有荧光标记基因的打靶供体，分为左同源臂(lha)和右同源臂(rha)，在两段同源臂中间衔接处设计了一个zfn的打靶序列位点，即zfn可在基因组以及所构载体上同时产生双链断裂缺口(dsb)。根据单交换原理，打靶供体可被完整插入基因组序列中，打靶供体的插入分为正向插入(图8.a)和反向插入(图8.b)，正向插入才能确保zfn打靶序列完整。具体操作为：将zfn与带有egfp标记基因的打靶供体转染hek293t细胞，通过观察转染后不同时间段的荧光变化，结合流式分析数据，我们发现在转染后20天左右，荧光率维持在一个比较稳定的状态，表明该阶段绿色荧光细胞为打靶供体稳定整合细胞。流式分选稳定荧光表达的细胞后，提取基因组进行pcr鉴定，验证该打靶供体是否定点稳定整合进目的基因。我们分别在发生定点整合后的序列5端和3端设计了一对pcr引物，5端pcr扩增引物上游位于ccr5基因组上，下游位于所构打靶供体上，跨越左右同源臂，3端pcr扩增引物上游位于所构打靶供体上，下游位于ccr5基因组上，跨越左右同源臂，结果表明同时转染zfn与打靶供体的基因组能够扩增出目的片段，表明发生了单交换，也就是打靶供体的定点整合，同时整合的类型为正向插入而非反向插入，而空白对照组与只转染打靶供体的基因组均不能扩增出该目的条带(图8.c)。进一步t-a克隆测序结果表明，zfn介导的单交换定点整合，发生整合后，其锌指蛋白识别结合区域r和l多是完整的，只是spacer区域序列出现同等复制，我们推测此种情况的突变不会完全消除zfn的打靶功能，可能能够介导多个打靶供体的定点整合(图8.d)。(3)检测多个打靶供体通过单交换机制实现定点整合的情况：针对介导多个打靶供体依次定点插入基因组的情况，除了使用打靶供体pegfp-ccr5-hr质粒之外，同时设计了一个携带dsred标记基因的打靶供体pdsred-ccr5-hr质粒，两种打靶供体的差别在于携带不同的荧光标记基因，其原理示意图与单个打靶供体定点整合类似(图9.a)。分别将zfn与两个分别携带红绿荧光基因的打靶供体共转染hek293t细胞。具体步骤为：待hek293t细胞汇合度至90％左右时进行转染，转染时按照每孔细胞150ngccr5-zfn-l质粒、150ngccr5-zfn-r质粒、100ngpegfp-ccr5-hr质粒、100ngpdsred-ccr5-hr质粒、1μllipofectamine3000、1μlp3000tm和50μlopti-mem培养基添加转染。转染约20天后，流式分选egfp单阳性细胞、egfp与dsred双阳性细胞，提取基因组进行pcr扩增，在检测单个打靶供体整合的基础上，进一步设计了一对检测是否发生多个打靶供体整合的中间引物，上游引物于第一个载体上，下游引物于第二个载体上，并且跨左右同源臂。结果表明，zfn介导单交换整合后，5端、3端以及中间部分均能扩增出目的条带，说明发生了多个打靶供体的整合(图9.b)。同时我们进行了相应t-a克隆测序分析，结果表明，在两种打靶供体共转染的情况下，我们发现egfp单阳性细胞的打靶位点是完全完整的，从而能够介导多个打靶供体的整合。进一步分析egfp、dsred双阳性细胞的打靶位点，该锌指蛋白识别结合区域r和l多是完整的，可能能够介导多个打靶供体的定点整合(图9.c)。其中，pdsred-ccr5-hr质粒的构建方法如下：合成长度为1640bp如seqidno：6所示的dna片段，通过asei酶切位点克隆进pcmv-dsred(见图10)，获得pdsred-ccr5-hr质粒。pdsred-ccr5-hr质粒的序列seqidno：8所示，结构图见图11。(4)针对zfn介导的打靶供体的整合，我们进一步通过单细胞克隆培养确定其单打靶供体整合效率以及多打靶供体整合效率。将流式分选后的阳性细胞分选至96孔细胞培养皿进行单细胞克隆培养，培养至7天左右，可观察到明显的单荧光单细胞克隆细胞群(图12.a)以及双荧光单细胞克隆细胞群(图12.c)。培养至20天左右，可提取相应单细胞克隆基因组进行pcr鉴定，pcr扩增结果表明，zfn介导单个打靶供体的整合效率为10％左右(图12.b)，zfn介导多个打靶供体的整合效率为65％左右(图12.d)。目前针对同源修复整合主要为双交换和单交换两种方式，前者表现为目的基因的替换插入，后者主要为整个打靶供体的整体插入。在哺乳动物细胞中，多通过核酸酶作用产生一个双链断裂缺口，再通过双交换机制实现片段的定点整合，但其效率往往很低，并且能够发生整合的片段相对较小。而在微生物中，大片段的整合多通过单交换方式实现。本技术的目的在于利用微生物的单交换机制，以求在哺乳动物细胞中，实现多个大片段的定点整合。本技术设计了包含人ccr5基因同源臂的打靶供体，针对多个打靶供体的定点整合，发现由zfn介导单交换的egfp单阳性细胞的打靶位点是完全完整的，从而能够实现第二个甚至多个打靶供体的整合，且存在较高的整合效率。针对这种情况，我们认为是由于两种打靶供体共转染的打靶供体浓度是转染单个打靶供体的两倍，转染进hek293t细胞的外来打靶供体相对浓度较高，阻碍了核酸酶在基因组同源区域产生缺口，从而能够保证整合的完整性，实现多个打靶供体的定点整合。sequencelisting<110>中山大学<120>一种利用zfn在哺乳动物细胞中实现多个大片段dna定点整合的方法<130><160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>29<212>dna<213>zfn靶向位点<400>1gtcatcctcatcctgataaactgcaaaag29<210>2<211>473<212>dna<213>ccr5-zfp-l<400>2gaattcatggactacaaggaccacgatggtgattataaggatcacgatattgattacaag60gacgacgacgacaaaatggctcctaagaaaaaacggaaagtcggaatccacggagtgccc120gctgcgatggccgagaggccctttcagtgcagaatttgcatgcgcaacttttccgacaga180tccaaccttagtcggcatatacgaactcatactggcgaaaagcctttcgcctgcgacatc240tgcgggcgcaaattcgccatctcttcaaatctgaacagccataccaagattcacacaggc300agccagaagccgtttcaatgtcgaatttgtatgaggaatttctctagaagcgacaatttg360gccagacatatccggacccataccggtgagaaaccattcgcatgtgacatatgtggcagg420aagtttgcaacatcagggaacctcacacgccacacgaagatccacctccgcgg473<210>3<211>5048<212>dna<213>pccr5-zfn-l质粒<400>3tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccg60cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccatt120gacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtca180atgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc240aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagta300catgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattac360catggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgggg420atttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacg480ggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgt540acggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgcta600ccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattcatggactacaaggaccacgatggtga660ttataaggatcacgatattgattacaaggacgacgacgacaaaatggctcctaagaaaaa720acggaaagtcggaatccacggagtgcccgctgcgatggccgagaggccctttcagtgcag780aatttgcatgcgcaacttttccgacagatccaaccttagtcggcatatacgaactcatac840tggcgaaaagcctttcgcctgcgacatctgcgggcgcaaattcgccatctcttcaaatct900gaacagccataccaagattcacacaggcagccagaagccgtttcaatgtcgaatttgtat960gaggaatttctctagaagcgacaatttggccagacatatccggacccataccggtgagaa1020accattcgcatgtgacatatgtggcaggaagtttgcaacatcagggaacctcacacgcca1080cacgaagatccacctccgcggcagccaactggtcaagagtgaactggaggagaagaaatc1140tgaacttagacacaagttgaaatatgtgcctcatgagtacatagaactgatcgagatagc1200cagaaattccactcaggatagaatccttgagatgaaggtgatggaattttttatgaaagt1260ttatggctacagaggcaaacacttgggtgggtcaaggaagccggacggggcaatctacac1320ggtcggaagccctattgattacggggtgatcgtggatactaaggcttatagcggagggta1380caacctgcccattggccaggcagacgaaatgcaacgatatgtcaaggagaatcagacccg1440caacaagcatatcaaccctaatgaatggtggaaagtctatccatcttctgtaacggagtt1500taagttcctctttgtgagtgggcatttcaaaggaaactacaaagctcagcttacacgact1560gaatcataagactaattgtaatggagccgttctcagtgtagaagagttgctgattggtgg1620agaaatgatcaaagccggcacactgaccctcgaggaagtgagacggaagttcaataacgg1680cgagattaacttccaccatcaccatcatcattgagcggccgcgactctagatcataatca1740gccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctga1800acctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatg1860gttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcatt1920ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaggcgtaaattgtaagcgttaat1980attttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggcc2040gaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgtt2100ccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaa2160accgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttgggg2220tcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttga2280cggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgct2340agggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaat2400gcgccgctacagggcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatt2460tgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataa2520atgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatg2580tgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagca2640tgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaa2700gtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccat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