一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，涉及细胞的分离、鉴定及分化领域，具体为一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法。

背景技术：

随着老龄化社会的到来，骨质疏松症已成为危害老龄人口健康的第四大因素。作为一种系统性骨病，骨质疏松的临床表现主要为骨量下降、骨微结构退化、骨脆性增加等。可引起全身关节酸痛，腰背疼痛甚至骨折，大大降低了患者的生活质量，同时也给家庭、社会带来巨大压力。如何预防和延迟骨质疏松的发生已经成为当下重要的健康课题。骨质疏松的发生在病理上与破骨细胞有着密切的关系，如何成功获得破骨细胞是进一步研究骨质疏松症的关键。

目前，破骨细胞的获取方法主要分为机械分离法和诱导法。由于破骨细胞是一种高代谢终末分化细胞，具有无法传代、存活时间短等特点，且破骨细胞在体内数量极少，因此机械分离获取困难。在现有的诱导方法中，通过raw264.7细胞系诱导是目前最常用的诱导方法，然而，由于raw264.7是细胞系，与原代细胞基因系存在的具体差异无法知晓。骨髓单核细胞作为一种较为前体的破骨细胞，采用其作为研究对象更有说服力。另外，通过骨髓单核细胞诱导获得的破骨细胞在数量、纯度、成熟度等方面均优于脾细胞诱导法和外周血单核细胞诱导法获得的破骨细胞。

关于骨髓单核细胞诱导获得破骨细胞的方法国内外文献报道较少，主要原因是采用骨髓单核细胞作为研究对象需要进行原代提取，而原代提取需要精细剥离长骨周围软组织，需要大量的精力和时间。这不仅降低了研究人员的积极性，而且常导致提取的原代细胞活性较低，诱导分化效果较差。

因此，建立一种简便快速的体外分离、扩增骨髓单核细胞的方法，同时高效地将其诱导为破骨细胞，为进一步探索骨代谢疾病提供研究基础显得尤为重要。

技术实现要素：

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种步骤简单、工作量小、耗时短，且保证分离获得的细胞具有良好的细胞活性和分化能力，本发明提供了一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法。

技术方案：一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法，包括以下步骤：

第1步、骨髓单核细胞分离

a、取移液枪枪头，剪取其下端1～1.5cm的移液口，采用尖头镊子将移液口进行扩口处理；

b、取1.5ml规格的ep管，将步骤a中的移液口置于ep管中，组装后灭菌；

c、无菌条件下分离完整的大鼠胫骨、股骨，将其剪断后断端朝下，置于步骤b中灭菌处理后的移液口中，6000r/min×30s离心1次；

第2步、骨髓单核细胞鉴定

d、将第1步分离的骨髓单核细胞接种至含25～100ng/mlm-csf(巨噬细胞集落刺激因子)的完全培养基中培养，隔天半量换液，观察细胞形态学特征；

e、培养3～5天后，取步骤d培养的细胞，采用流式细胞术检测其表面抗原cd11b(白细胞分化抗原11b)的阳性表达率；

f、取步骤d培养了1～9天的细胞，采用cck-8法(细胞计数试剂盒法)绘制生长曲线；

第3步、骨髓单核细胞诱导分化

g、取步骤d培养的细胞，采用m-csf和rankl(核因子κb受体活化因子配基)诱导其分化，并通过trap(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色、ctr(降钙素受体)荧光染色鉴定为成熟破骨细胞。

优选的，步骤c中胫骨、股骨取自新生1周内的sd大鼠。

优选的，步骤d中所述完全培养基的组分为α-mem(α基础培养基)75～90％，胎牛血清10～25％，抗生素10～100u/ml。

优选的，步骤g中m-csf的使用浓度为25～100ng/ml，rankl的使用浓度为50～100ng/ml。

优选的，步骤e中培养5天，细胞密度至少为90％。

优选的，步骤e中单核细胞的表面抗原cd11b的阳性表达率达到98.6％。

有益效果：(1)本发明采用骨髓单核细胞作为研究对象，较破骨前体细胞系更具有说服力；(2)本发明所述方法克服了传统的注射器冲洗骨髓腔法的不足，大大缩短了获得骨髓单核细胞的时间，提高了细胞活性；(3)本发明所述方法分离后的骨髓单核细胞能够被成功诱导分化为破骨细胞；(4)本发明所述方法分离纯化获得的骨髓单核细胞数量可观、性状稳定、活性较高，能够为后续的骨代谢疾病的基础研究提供可靠的细胞来源。

附图说明

图1是骨髓单核细胞分离装置示意图；

图2是骨髓单核细胞在m-csf刺激下第1、3、5天的形态特征图，

其中a为第1天的形态特征图，b为第3天的形态特征图，c为第5天的形态特征图；

图3是骨髓单核细胞表面抗原cd11b流式检测结果图，

其中，a为同型对照组，b为加入0.5μlcd11b荧光抗体实验组；

图4是骨髓单核细胞在m-csf刺激下的生长曲线；

图5是骨髓单核细胞分化为破骨细胞后trap染色结果图，其中a为对照组，b为诱导组；

图6是骨髓单核细胞分化为破骨细胞后ctr免疫荧光染色和hochest33342荧光染色结果图，其中a为降钙素受体染色(ctr)，b为核染色(nucleus)，c为混合(merged)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1骨髓单核细胞分离

取若干实验室常用的塑料移液枪头，剪取下端1～1.5cm，使用尖头镊子将移液口进行扩口处理。另取若干实验室常用的1.5mlep管，每管中放入一小段剪取的移液枪头下段，组装成如图1所示装置后，进行高压灭菌处理，备用。

无菌条件下分离出新生大鼠的胫骨和股骨，初步分离周围软组织，并放入无血清α-mem中备用；将大鼠胫骨、股骨从中间剪断，断面朝下，置于如图1所示的分离装置的移液枪头中；将ep管6000r/min×30s离心1次。

移除ep管中的枪头，每管用含1％青链双抗(ps)、5％fbs的α-mem培养基200μl吹打重悬，收集在一起后将细胞悬液从200目筛网中滤过后，1500r/min离心5min，弃上清；加入10倍于细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，冰上裂解8min，1500r/min离心5min，弃红色上清后，再用pbs溶液洗涤细胞两遍；然后用含25ng/ml的m-csf、1％ps、5％fbs的α-mem培养基重悬，并按照4×10⁵/cm²的密度接种，于37℃、体积分数5％co2培育箱静置培养过夜(12～18h)；收集上清1200r/min离心5min，用含25ng/ml的m-csf、1％ps、5％fbs的α-mem重悬，直至细胞增殖到合适密度。

实施例2骨髓单核细胞鉴定

将实施例1分离的骨髓单核细胞接种至含25～100ng/mlm-csf的完全培养基中培养，隔天半量换液，观察细胞形态学特征。分别取细胞增殖培养过程中第1、3、5天的细胞，采用日本olympus倒置显微镜记录单核细胞的形态特征及形态变化。

如图2所示，培养1天，细胞基本呈小圆形，杂细胞较少；培养3天，细胞数目增多，体积稍大，大多呈椭圆形，部分细胞两端长出触角；培养5天，细胞数目明显增多，细胞触角更加明显，形态均一，大小一致，细胞密度可达90％以上。

取上述培养3～5天的细胞，采用流式细胞术检测其表面抗原cd11b的阳性表达率。将生长状态良好的原代大鼠单核细胞轻轻吹下，调整密度至10⁶个/ml，收集于2个ep管中各400μl，各加入含1％fbs(用1％nan3溶解)200μl冰上封闭30min，并标记a、b。a管为同型对照，b管加入0.5μlcd11b荧光抗体，冰上静置30min。离心后用pbs清洗两次，转移到流式管中上机检测。

如图3所示，流式细胞仪检测的结果表明通过实施例1所述方法分离培养的原代单核细胞的cd11b表达率可达98.6％，符合骨髓单核细胞表面标志的表达。

取上述培养了1～9天的细胞，采用cck-8法绘制生长曲线。取对数生长期的原代大鼠单核细胞按照10⁴个/孔，分为两组，每组8孔，一组加入含100ng/ml的m-csf的含血清培养基，另外一组只加含血清培养基，各100μl。分别在接种后的第1、3、5、7、9天，以cck-8法检测其细胞活力。每次检测时均加入10μl的cck-8检测液，放入培养箱中孵育4h，用酶标仪检测其在450nm处的吸光度，每组取8孔测定值的平均值。以天数为横轴，od值为纵轴绘制生长曲线。

结果如图4所示，m-csf可明显促进大鼠骨髓单核细胞的增殖。在接种3天前细胞的生长相对较缓，应属于平台期。3天后细胞快速生长，进入对数生长期。5天后细胞增速逐渐放缓，进入平台期。而没有加入m-csf的对照组生长基本停滞，提示m-csf是大鼠骨髓单核细胞增殖过程中的必要生长因子。

综上所述，通过实施例1所述方法分离获得的骨髓单核细胞，能够在m-csf的刺激下大量增殖，获得的细胞符合单核细胞表面标志的表达。说明通过该方法能够在短时间、低成本的条件下获取一批数量可观、性状稳定、纯度较高的骨髓单核细胞。

实施例3骨髓单核细胞诱导分化

取实施例1培养的细胞，采用m-csf和rankl诱导其分化，并通过trap染色、ctr荧光染色鉴定为成熟破骨细胞。具体操作如下：

将骨髓单核细胞轻轻吹下，离心重悬后按照1.5×10⁵个/cm²的密度接种，并在培养基中加入25ng/ml的m-csf、100ng/ml的rankl，隔天半量换液。

诱导培养4～6天后可在镜下发现大量融合的多核细胞，采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tarp)染色，细胞用4％的多聚甲醛固定10min，再置于以蔡酚as-bi磷酸盐作为底物的孵育液中37℃孵育40min，去离子水清洗3次，再以苏木精染液孵育10min，去离子水清洗3次，染色后尽快在倒置显微镜下观察拍照。

结果如图5所示，诱导培养4～6天后的骨髓单核细胞中出现大量体积较大、粒径为30-150μm的细胞，细胞多呈椭圆形或不规则性；trap染色后可见胞浆中有紫红色颗粒，分布均匀，伪足和褶皱清晰可见，细胞核呈蓝紫色，每个细胞中可见大量细胞核，大部分细胞呈明显的trap阳性。而未诱导的骨髓单核细胞trap染色呈阴性，仍为单核细胞。

诱导培养4～6天后，同样将增殖后骨髓单核细胞按照1.5×10⁵个/cm²的密度接种，培养6天后将细胞用预冷的4％多聚甲醛固定10min，加入含0.3％triton-x100的pbs冰上放置30min，再加入含5％fbs的pbs冰上封闭30min，加入兔抗大鼠ctr抗体(1:100稀释)后4℃过夜。次日pbs洗3次后，加入alexa-488标记的驴抗兔二抗37℃孵育1h后，pbs洗三次。再用hochest33342染液复染细胞核10min，pbs洗三次后。荧光显微镜下观察荧光分布范围及强度。

结果如图6所示，诱导培养后的骨髓单核细胞免疫荧光染色后细胞膜和核周细胞质中均呈现较强的绿色荧光，hochest33342染色可见诱导后的细胞的核中呈蓝色荧光，每个细胞中基本含有3个以上的细胞核。而未诱导的大鼠骨髓单核细胞中则不存在ctr的表达。

综上所述，通过实施例1所述方法分离获取的骨髓单核细胞具有活性高、数量多、形状稳定的优点。经鉴定可被成功诱导为破骨细胞，能够为骨代谢疾病的基础研究提供可靠的细胞来源。