一种藻毒素降解菌的分子标记、藻毒素降解菌及藻毒素降解菌的制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种藻毒素降解菌的分子标记、藻毒素降解菌及藻毒素降解菌的制备方法。
背景技术：
：蓝藻毒素(cyanotoxin)中的微囊藻毒素(microcystin，mc)常常简称为藻毒素。藻毒素是一种肝毒素，具有强烈的促癌效应，严重威胁人类的健康。在水中藻毒素自然降解过程是十分缓慢的，在水中只有少量的藻毒素能够被水体中微粒吸收。同时，藻毒素有很高的耐热性，加热煮沸都不能将毒素破坏，也不能将其去除。现有技术中去除藻毒素的方式为通过生物酶降解藻毒素，具体地，将目的基因mlra构建到原核表达载体上得到重组载体，将该重组载体转化到大肠杆菌中，得到表达菌，将表达菌进行诱导表达，收集菌体，破碎后利用重组载体上的融合蛋白表达标签纯化后得到藻毒素降解酶。在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：现有的藻毒素降解酶在制备过程中，需要将重组载体转化到大肠杆菌中，由于大肠杆菌是致病菌，这使得制备出的藻毒素降解酶并不能在实际中应用。技术实现要素：为了解决现有技术中降解藻毒素的生物酶并不能在实际中应用的问题，本发明实施例提供了一种藻毒素降解菌的分子标记、藻毒素降解菌及藻毒素降解菌的制备方法。所述技术方案如下：一方面，本发明实施例提供了一种藻毒素降解菌的分子标记，所述分子标记的序列如序列表中seqidno:1所示。另一方面，本发明实施例提供了一种藻毒素降解菌，所述藻毒素降解菌包括上述分子标记。又一方面，本发明实施例提供了一种制备上述藻毒素降解菌的方法，所述方法包括：将如序列表中seqidno:1所示的分子标记构建到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组表达载体转入到受体菌的感受态细胞中，培养后得到藻毒素降解菌，所述受体菌为枯草芽孢杆菌rik1285。具体地，所述将如序列表中seqidno:1所示的分子标记构建到表达载体上，包括：将含有如序列表中seqidno:1所示的分子标记的目的基因mira、启动子pglv和枯草源信号肽sacb分别克隆至质粒prepu-cmr上，得到重组质粒pmira-cmr，所述目的基因mira的序列如序列表中seqidno:2所示。提取所述枯草芽孢杆菌rik1285的基因组，并将所述基因组作为模版，利用如序列表中seqidno:3所示的上游引物和如序列表中seqidno:4所示的下游引物进行pcr扩增，得到扩增产物。将所述扩增产物与所述重组质粒pmira-cmr分别进行双酶切，纯化后于16℃过夜连接，得到重组表达载体pmira-repu。具体地，所述质粒prepu-cmr的选择标记为氯霉素抗性，所述质粒prepu-cmr的启动子为启动子repu。具体地，所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃延伸10min。具体地，制备所述受体菌的感受态细胞的方法包括：将所述受体菌的菌液涂布在平板培养基上，于37℃过夜培养；挑取过夜培养的所述受体菌置于平板液体培养基中，于37℃过夜培养，得到培养产物；将所述培养产物置于第一培养基中，于37℃培养5～6小时后，转入第二培养基中培养4～5小时，得到所述受体菌的感受态细胞。进一步地，所述第一培养基为包括硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁和葡萄糖的水溶液，所述第一培养基中硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁和葡萄糖的浓度分别为2g/l、14g/l、6g/l、1g/l、0.2g/l和2g/l。具体地，所述第二培养基为包括硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的水溶液，所述第二培养基中硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的浓度分别为2g/l、14g/l、6g/l、1g/l、0.2g/l、5.55mg/l和2.6μg/l。具体地，所述方法还包括：将所述重组表达载体加入所述感受态细胞后，于30℃培养1～2小时，得到重组菌；将所述重组菌的菌液涂布在含有氯霉素的平板培养基上，于37℃过夜培养，得到所述藻毒素降解菌。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的藻毒素降解菌的分子标记，该藻毒素降解菌的分子标记能够作为特异性标识物能够用于筛选藻毒素降解菌，含有该分子标记的目的基因的感受态细胞能够有效降解藻毒素。本发明实施例提供的制备方法，将启动子构建到含有该分子标记的枯草芽孢杆菌rik1285后能够得到藻毒素降解菌，且枯草芽孢杆菌rik1285为分泌型的益生菌，这使得该藻毒素降解菌不仅能够有效分泌藻毒素降解酶，从而降解水体中的藻毒素解决藻毒素污染的问题，而且枯草芽孢杆菌rik1285具有益生功能，这使得本发明实施例制备的藻毒素降解菌能够在实际中应用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例二提供的重组表达载体的结构示意图，图中ecorⅰ、sacⅰ、xhoⅰ、pstⅰ、bamhⅰ、sphⅰ和hindⅲ均为限制性内切酶位点，cmr为氯霉素抗性基因，ori为复制起点，ampr为筛选标记；图2是本发明实施例二提供的质粒prepu-cmr的结构示意图，图中ecorⅰ、sacⅰ、kpnⅰ、notⅰ、bamhⅰ、sphⅰ和hindⅲ均为限制性内切酶位点，cmr为氯霉素抗性基因，ori为复制起点，ampr为筛选标记；图3是本发明实施例二提供的扩增结果图，图中，1-康地恩公司提供的枯草芽孢杆菌，2-枯草芽孢肝菌m31，3-枯草芽孢肝菌tl，4-枯草芽孢杆菌可速必宁，5-本发明实施例提供的藻毒素降解菌，6-大肠杆菌bl2151006b，7-阴性对照，m-5000dlmaker；图4是本发明实施例二提供的藻毒素降解菌的检测结果图，图中1～4分别为4种市场销售的芽孢杆菌，5为本发明实施例提供的藻毒素降解菌，6为dnamarker；图5是本发明实施例二提供的对照例1中重组表达载体的结构示意图，图中ecorⅰ、sacⅰ、kpnⅰ、xhoⅰ、pstⅰ、bamhⅰ、sphⅰ和hindⅲ均为限制性内切酶位点，cmr为氯霉素抗性基因，ori为复制起点，ampr为筛选标记；图6是本发明实施例二提供的对照例2中重组表达载体的结构示意图，图中ecorⅰ、sacⅰ、kpnⅰ、xhoⅰ、pstⅰ、bamhⅰ、sphⅰ和hindⅲ均为限制性内切酶位点，cmr为氯霉素抗性基因，ori为复制起点，ampr为筛选标记。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例一本发明实施例提供了一种藻毒素降解菌的分子标记，该分子标记的序列如序列表中seqidno:1所示。实施例二本发明实施例提供了一种藻毒素降解菌，该藻毒素降解菌包括实施例一提供的分子标记。下面介绍一下该藻毒素降解菌的制备方法，具体如下：步骤1：将如序列表中seqidno:1所示的分子标记构建到表达载体上，得到结构如图1所示的重组表达载体。具体方法包括：将含有如序列表中seqidno:1所示的分子标记的目的基因mira(序列如序列表中seqidno:2所示)、启动子pglv和枯草源信号肽sacb均克隆至质粒prepu-cmr上，得到重组质粒pmira-cmr。具体地，将枯草源信号肽sacb的两端插入kpni酶切位点和xhoi酶切位点，将目的基因mira的两端分别插入xhoi酶切位点和bamhi酶切位点，其中，目的基因mira和枯草源信号肽sacb均由生工生物工程(上海)有限公司合成。质粒prepu-cmr的构建结构图如图2所示，其中，质粒prepu-cmr的选择标记为氯霉素抗性，质粒prepu-cmr的启动子为强启动子repu。采用限制性内切酶saci和限制性内切酶kpni分别对启动子pglv和质粒prepu-cmr分别进行双酶切，得到酶切产物，将酶切产物纯化后利用t4dna连接酶连接酶切产物，得到第一重组质粒；采用限制性内切酶kpni和限制性内切酶xhoi分别对枯草源信号肽sacb和第一重组质粒进行双酶切，将酶切产物纯化后利用t4dna连接酶连接酶切产物，得到第二重组质粒，采用限制性内切酶xhoi和限制性内切酶bamhi分别对目的基因mira和第二重组质粒进行双酶切，将酶切产物纯化后利用t4dna连接酶连接酶切产物，得到重组质粒pmira-cmr。其中，纯化的方法可以为：将酶切产物利用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，得到带有酶切产物的凝胶，通过凝胶回收试剂盒回收酶切产物。提取枯草芽孢杆菌rik1285的基因组，并将该基因组作为模版，利用如序列表中seqidno:3所示的上游引物和如序列表中seqidno:4所示的下游引物进行pcr扩增，得到扩增产物；具体地，利用ctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取枯草芽孢杆菌rik1285的基因组，并用超微量核酸蛋白测定仪q5000检测提取的基因组的质量与浓度，并将提取的基因组的浓度稀释至50～100ng/μl作为模板。具体pcr扩增的反应体系参见表1。表1为pcr扩增的反应体系试剂体积(μl)ddh2o4.82×primestargcbuffer10dntpmix(2.5mm)2上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1takaraprimestartaq酶0.2模板1pcr扩增的反应体系共20μl。将表1中的pcr扩增的反应体系按照如下pcr反应程序进行扩增：pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃延伸10min，得到扩增产物，其扩增结果如图3所示。将扩增产物与重组质粒pmira-cmr分别进行双酶切，纯化后于16℃过夜连接，得到重组表达载体pmira-repu。步骤2：将重组表达载体转入到受体菌的感受态细胞中，培养后得到藻毒素降解菌，受体菌为枯草芽孢杆菌rik1285。本发明实施例所提供的枯草芽孢杆菌rik1285购买于takara公司。具体地，制备受体菌的感受态细胞的方法包括：将受体菌的菌液涂布在平板培养基上，于37℃过夜培养；挑取过夜培养的受体菌置于平板液体培养基中，于37℃过夜培养，得到培养产物；将培养产物置于第一培养基中，于37℃培养5～6小时后，转入第二培养基中培养4～5小时，得到感受态细胞。该感受态细胞现制现用，不能储存。在本实施例中，第一培养基为包括硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁和葡萄糖的水溶液，该第一培养基中硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁和葡萄糖的浓度分别为2g/l、14g/l、6g/l、1g/l、0.2g/l和2g/l。在本实施例中，第二培养基为包括硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的水溶液，该第二培养基中硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的浓度分别为2g/l、14g/l、6g/l、1g/l、0.2g/l、5.55mg/l和2.6μg/l。在制备第一培养基和第二培养基时，可以先制备基础培养基，该基础培养基为包括硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠和硫酸镁的水溶液，该基础培养基中硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠和硫酸镁的浓度分别为2g/l、14g/l、6g/l、1g/l和0.2g/l。取制备好的基础培养基100ml，加入浓度为50％的葡萄糖的水溶液1ml得到第一培养基。取制备好的基础培养基100ml，加入浓度为50mm的氯化钙的水溶液1ml和浓度为250mm的氯化镁的水溶液1ml，得到第二培养基。具体地，该方法还包括：将重组表达载体加入感受态细胞后，于30℃培养1～2小时，得到重组菌。将重组菌的菌液涂布在含有氯霉素的平板培养基上进行筛选，并于37℃过夜培养，得到藻毒素降解菌。在实现时，可以采用常用的制备干菌体的方法，将藻毒素降解菌制备成干菌体，以便于运输和储存。在其它实施例中，将重组表达载体转入到受体菌的感受态细胞中，培养后得到藻毒素降解菌的方法可以为：将枯草芽孢杆菌rik1285涂布在平板培养基上，于37℃培养箱培养12h；挑单菌落置于3ml的平板培养基中，于37℃、250rmin过夜培养，得到第一培养液；取160μl第一培养液转接至8ml的spi培养基中，于37℃、250rmin培养至对数生长末期，得到第二培养液，取0.2ml第二培养液至2ml的spii培养基中，于37℃、100rmin培养90min，加入20μl浓度为10mmol的egta溶液，再于37℃、100rmin培养10min，得到第三培养液；每0.5ml第三培养基中加入1μl浓度为100ng/μl的重组表达载体，再于37℃、250rmin培养90min，取菌液涂布于含有氯霉素的抗性筛选平板培养基上，得到藻毒素降解菌。在本实施例中，spi培养基包括：9.8mlsp-asalts溶液、9.8mlsp-bsalts溶液、200μl(1％v)葡萄糖(50％w/v，115℃灭菌20min)和200μl(1％v)100×caye溶液。其中，500mlsp-asalts溶液包括：0.4％(nh4)2so42g、2.8％k2hpo4·3h2o14g、1.2％kh2po46g和0.2％柠檬酸钠二水合物(trisodiumcitratedihydrate)1g，121℃灭菌20min。500mlsp-bsalts溶液包括：0.04％mgso4·7h2o0.2g，121℃灭菌20min。caye溶液包括浓度为2％的酪蛋氨基酸酪蛋白水解物(casaminoacid)2g和浓度为10％的酵母膏(yeastextract)10g，121℃灭菌20min。spii培养基包括：5.88mlspi培养基、60μl(1％v)50mmcacl2和60μl(1％v)250mmmgcl2。egta溶液为10mmol/l乙二醇二乙醚二胺四乙酸盐溶液，溶解时需加少量naoh将ph值调至8.0。将本发明实施例提供的藻毒素降解菌进行鉴定，具体方法如下：将得到的藻毒素降解菌利用如序列表中seqidno:3所示的上游引物和如序列表中seqidno:4所示的下游引物进行pcr扩增，且pcr扩增的反应体系和反应程序与枯草芽孢杆菌rik1285的基因组扩增的反应体系和反应程序一致。同时，采用四种市场销售的4种枯草芽孢杆菌(4种枯草芽孢杆菌分别为枯草芽孢肝菌m31、枯草芽孢肝菌tl、枯草芽孢杆菌可速必宁和由康地恩公司购置的枯草芽孢肝菌)作为对照组。只有本发明实施例提供的藻毒素降解菌的扩增产物的长度为520bp，与理论检测值相符，检测结果见图4，由此可以证明本发明实施例获得的藻毒素降解菌含有本发明实施例提供的分子标记。将本发明实施例提供的启动子(该启动子包括repu基因序列和pglv基因序列)分别替换为repu基因序列和pglv基因序列，并按照实施例二提供的制备方法制备第一菌体(该菌体构建的重组表达载体的结构如图5所示)和第二菌体(该菌体构建的重组表达载体的结构如图6所示)，将本实施例提供的藻毒素降解菌、第一菌体、第二菌体和对照组(未放置任何菌体)按照体积比为10％(藻毒素降解菌、第一菌体和第二菌体的菌体浓度均为108cfu/ml)分别放置于四份含有藻毒素的水体中，并检测放入后水体中的藻毒素含量，在本实施例提供的藻毒素降解菌降解后的水体中没有检测到藻毒素，在第一菌体降解后的水体中检测到221μg/l藻毒素，在第二菌体降解后的水体中检测到147μg/l藻毒素，在对照组的水体中检测到317μg/l藻毒素，可见本发明实施例提供的藻毒素降解菌具有良好的降解藻毒素的功能。本发明实施例提供的藻毒素降解菌的分子标记，该藻毒素降解菌的分子标记能够作为特异性标识物能够用于筛选藻毒素降解菌，含有该分子标记的目的基因的感受态细胞能够有效降解藻毒素。本发明实施例提供的制备方法，将启动子构建到含有该分子标记的枯草芽孢杆菌rik1285后能够得到藻毒素降解菌，且枯草芽孢杆菌rik1285为分泌型的益生菌，这使得该藻毒素降解菌不仅能够有效分泌藻毒素降解酶，从而降解水体中的藻毒素解决藻毒素污染的问题，而且枯草芽孢杆菌rik1285具有益生功能，这使得本发明实施例制备的藻毒素降解菌能够在实际中应用。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>湖北华大瑞尔科技有限公司<120>一种藻毒素降解菌的分子标记、藻毒素降解菌及藻毒素降解菌的制备方法<160>4<170>patentinversion3.4<210>1<211>536<212>dna<213>人工序列<400>1tatgggcaagcaggatttcgtgaactgctcagccgctgcgccccgtggcggtcgcctgtt60tcctggcgtcagggcgttactgtcatagccgtgtgtttccttgcgttcttcgcgctcaca120ggaatcatgtgggttcagacatacctctacgctccgcctggtacgcttgatcgtaccttc180ctgcgctatgggtcagatccggtcgccatttatgtgatgctggcagcatcgctgctactc240agccctggcccgctgctcgaagaactgggctggcgcggctttgcgctgccgcagctcctc300aagaagtttgacccccttaccgcagcggtgatcctcggcatcatgtggtgggcctggcat360ttgccacgcgacctgccaacactgttctccggcgcccctggcgcggcctggagcgttatt420gtcaaacaactcgttatcactcctgggttcattgcgagcaccatcatcgctgtcttcgta480tgcaacaagctcggtggatcaatgtgggggggcgtgctcactcacgccatccataa536<210>2<211>1008<212>dna<213>人工序列<400>2atgcgggagtttgtccgacagcggcctttgctgtgcttctatgtgttggcgatactgatc60gctctcgcggcccatgcgctacgcgcgatgagcccgacgccgctcgacccgatgttcaag120atgctgcaggagacgcacgctcacctcaacattattaccgctgtcaggtctacgttcgag180tatccgggagcctatacgctcttactgtttccggccgccccaatgttcgcggccctgatc240gcaaccgggatcggctatgggcaagcaggatttcgtgaactgctcagccgctgcgccccg300tggcggtcgcctgtttcctggcgtcagggcgttactgtcatagccgtgtgtttccttgcg360ttcttcgcgctcacaggaatcatgtgggttcagacatacctctacgctccgcctggtacg420cttgatcgtaccttcctgcgctatgggtcagatccggtcgccatttatgtgatgctggca480gcatcgctgctactcagccctggcccgctgctcgaagaactgggctggcgcggctttgcg540ctgccgcagctcctcaagaagtttgacccccttaccgcagcggtgatcctcggcatcatg600tggtgggcctggcatttgccacgcgacctgccaacactgttctccggcgcccctggcgcg660gcctggagcgttattgtcaaacaactcgttatcactcctgggttcattgcgagcaccatc720atcgctgtcttcgtatgcaacaagctcggtggatcaatgtgggggggcgtgctcactcac780gccatccataacgagctgggagtaaacgtcactgccgaatgggctccaacggtcgcaggc840ctcgggtggcgcccatgggatctcatcgaatttgccgtggccattgggctcgtcctgatt900tgtgggaggagccttggtgccgcatctcctgacaatgcgcgtttggcctggggcaacgtg960ccgccaaagctgccgggcggagtgggtgacaagtccggcgcgaacgcg1008<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tatgggcaagcaggatttcg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tatggatggcgtgagtgagc20当前第1页12