一种低共熔溶剂及用于提取大黄中蒽醌的方法与流程

本发明提供了一种低共熔溶剂及用于提取大黄中蒽醌的方法，属于中药材资源综合利用领域。

背景技术：

大黄是《中华人民共和国药典》(2015版，一部)收录的草药，药用来源为蓼科(polygonaceae)植物掌叶大黄rheumpalmatuml.、唐古特大黄rheumtanguticummaxim.exbalf.或药用大黄rheumofficinalebaill.的干燥根及根茎。味苦，性寒，归脾、胃、肝、大肠、心经，具泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经等功效，主要活性成分为大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素等。现代药理研究表明大黄具有泻下、抗菌、抗肿瘤、降血压、健胃、保肝利胆、强心、消炎、延缓衰老、调节免疫等作用。

大黄中蒽醌类化合物的提取方法主要有碱提法、水煮醇沉法、氯仿回流法、微波提取法、超声提取法和超临界co2提取法等。其中氯仿回流法、微波提取法、超声提取法提取率高，但大多使用氯仿等作溶剂，对环境污染大，限制了大规模工业化。超临界co2提取虽更为环保高效，但对工业设备要求高、成本高难以大规模商用。

低共熔溶剂(deepeutecticsolvents,dess)是英国莱斯特大学的abbott教授于1999年首次提出，主要是由氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如羧酸、多元醇、尿素等)组成，在较低温度下也保持液态的混合物，亦被称之为低共熔离子液体。2011年，荷兰莱顿大学天然产物实验室younghaechoi教授课题组，提出“低共熔溶剂是植物体内除水和脂类以外的另一转运媒介”，在2013年，young的课题组对100多种天然低共熔溶剂(nades)研究，表明nades作为芦丁、槲皮素、肉桂酸、红花苷、银杏内酯b、紫杉酚和1,8-二羟基蒽醌的提取剂是可行的。随后，wei等人和qi等人分别成功用dess提取了黄芩和犬问荆中的黄酮类化合物。但尚未有人将dess用于大黄蒽醌的提取。

技术实现要素：

本发明提供了一种低共熔溶剂及用于提取大黄中蒽醌的方法。

本发明提供了一种低共熔溶剂，它是由乳酸、d-(+)-葡萄糖、水组成，其中，低共熔溶剂中乳酸、d-(+)-葡萄糖的摩尔比为：1-2∶1-5，含水量为0-80％(v/v)。

进一步优选地，低共熔溶剂中乳酸、d-(+)-葡萄糖的摩尔比为：1∶2，含水量为20％(v/v)。

本发明还提供了该低共熔溶剂在提取大黄蒽醌工艺中的用途。

本发明提供了一种低共熔溶剂提取大黄中蒽醌的方法，包括如下步骤：

a、取干燥大黄粉，加入1～5倍体积的1％～20％的硫酸酸化，干燥后，加入10～50倍体积的所述的低共熔溶剂，在超声波功率300w～800w、超声波温度20～70℃条件下，超声波提取5～60min；

b、a步骤超声处理混合物在温度40～100℃，水浴或回流提取0.5～3h；冷却、离心，取上清液大孔树脂吸附，然后纯水—乙醇洗脱，分别收集洗脱液至洗脱液基本无色，合并相同组分，浓缩结晶，将结晶产物45℃真空烘干后得到大黄蒽醌单体。

进一步优选地，a步骤所述的干燥大黄粉，加入1倍体积的10％硫酸酸化大黄粉，烘干后加入26倍体积的所述的低共熔溶剂，于40℃、600w超声10min。

进一步优选地，b步骤超声处理混合物于82℃水浴搅拌提取1.5h，离心上清液用dm130大孔树脂吸附，纯水洗脱至不含糖，然后以90％乙醇作为洗脱液，以1bv·h^-1的速度洗脱。

本发明采用低共熔溶剂提取大黄中蒽醌的方法，通过对经硫酸酸化的大黄粉采低用共熔溶剂超声波辅助提取、抽虑、浓缩、大孔树脂吸附、洗脱、结晶、抽虑、真空干燥、含量测定等工艺流程，得到五种大黄蒽醌。

本发明采用超声波辅助低共熔溶剂提取法进行大黄蒽醌的提取，采用超声前处理大幅提高提取率，同时缩短提取时间。使用dm130大孔树脂吸附，90％乙醇溶液洗脱，能够快速将大黄提取物中主要的5种蒽醌单体分离。大黄总蒽醌的提取率达到25.3mg/g，经dm130大孔树脂纯化后，单体蒽醌纯度高达90％以上。

本发明将低共熔溶剂用于大黄中蒽醌的提取，替代了传统提取的氯仿等有毒有机溶剂，减少了大黄产业的环境污染，绿色环保，且提取效率高、本发明低共熔溶剂可回收重复使用，大幅降低了提取成本，对大黄资源的合理开发利用提供了新的技术手段。

附图说明

图1不同溶剂大黄提物中五种游离蒽醌含量的主成分分析因子荷载图(a)及得分图(b)

图2低共熔溶剂中乳酸/葡萄糖摩尔比对五种蒽醌提取率影响

图3低共熔溶剂中含水量对五种蒽醌提取率影响

图4提取温度与提取时间对总游离蒽醌提取率的效应面(a)及等高线图(b)

图5提取时间与液固比对总游离蒽醌提取率的效应面(a)及等高线图(b)

图6提取温度与液固比对总游离蒽醌提取率的效应面(a)及等高线图(b)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但发明的保护范围并不仅仅限于此：

实施例1本发明低共熔溶剂提取大黄中蒽醌的方法

1.材料与试剂

大黄粉；大孔吸附树脂dm130；无水乙醇，浓硫酸(优级纯)，乳酸，葡萄糖，磷酸，甲醇(色谱纯，fisher)，芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚标准品(含量≥98％，成都植标化纯生物技术有限公司)，除标明外其他均为分析纯。

2.实验仪器

lc-20a型高效液相色谱仪(日本shimadzu)，kq-300gdv型恒温数控超声波清洗器，bt124s型电子天平，lgj-12型冷冻干燥机，wp-z-uv型实验室超纯水机，fw135型中草药粉碎机，80-1型电动离心机，df-101s型集热式恒温加热磁力搅拌器。

3.实验方法

3.1大黄蒽醌提取技术路线

称一定量干燥的大黄粉→加入一倍量的10％硫酸，烘干→加入26倍体积的低共熔溶剂中→超声波提取→恒温搅拌提取→将提取混合物离心后得到提取液→提取液上样到dm130上→90％乙醇洗脱→hplc分析→合并相同组分，浓缩结晶→抽虑得到沉淀→将沉淀45℃真空烘干得到大黄蒽醌单体。

3.2高效液相色谱条件

色谱柱：agilenteclipsexdb-c18(4.6×250mm,5μm)，流动相体系：0.10％磷酸水溶液(a)-甲醇(b)，梯度洗脱条件：0～15min，70～100％b；15min～20min，100～70％b；20～25min，70％b，检测波长264nm，柱温30℃，进样量10μl。

3.3标准曲线的制作

分别称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，分别于5个10.00ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声溶解。然后分别吸取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚2.0ml于25.00ml棕色容量瓶中，用甲醇定容，为混标，其中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的浓度分别为0.0168mg/ml、0.0180mg/ml、0.047mg/ml、0.0416mg/ml、0.024mg/ml。分别吸取1、3、5、7、9、12、15μl的混标注入hplc，以峰面积(x)为横坐标，标准溶液质量(y)为纵坐标得出线性回归方程。

3.4实验条件优化

3.4.1低共熔溶剂体系筛选及组成优化

先进行低共熔溶剂体系筛选，然后对最佳体系进行组成优化(包括低共熔溶剂组分比例及含水量)，以五种游离蒽醌类化合物总提取率为指标，采用主成分分析法，筛选出最适低共熔溶剂体系。

3.4.2低共熔溶剂提取工艺条件的优化

先进行低共熔溶剂提取工艺的单因素设计，包括超声预处理条件、提取时间、提取温度和液固比。得出超声预处理条件。

经各单因素提取条件实验后，固定超声预处理条件，以提取时间、提取温度和液固比为自变量，以大黄中五种游离蒽醌类化合物的总提取率为因变量，根据box-benhnkendesign的设计原理，采用3因素3水平的响应面优化法，研究了各因素及其交互作用后对大黄中蒽醌提取率的影响。通过bbd优化，得出最佳低共熔溶剂提取大黄蒽醌的最优提取工艺。

3.4.3五种蒽醌的分离纯化

以最佳提取工艺获得大黄粗提物，通过筛选大孔树脂种类、上样量、洗脱液等，得到最佳分离大孔树脂及洗脱液组成。

4.实验结果

4.1五种蒽醌类化合物的标准曲线

表1五种游离蒽醌类化合物的标准曲线

4.2低共熔溶剂体系筛选及优化

4.2.1低共熔溶剂的配制

参考dai等(daiy,spronsenjv,witkampgj,etal.naturaldeepeutecticsolventsasnewpotentialmediaforgreentechnology.analyticachimicaacta,2013,766(5):61-68.)的方法，采用加热法制备低共熔溶剂，按表2所示组分配比将组分混合，在一定温度下(通常在85℃下)用水浴恒温磁力搅拌器进行搅拌，直到形成透明澄清的液体(约30～120min)，再将得到的液体置于硅胶干燥器中直至恒重。

表2低共熔溶剂组分及比例

4.2.2低共熔溶剂体系的选择实验方案

用电子天平准确称取大黄粉末1.00g，加入到50ml具塞锥形瓶中，然后再分别加入按“1”方法自制的13种低共熔溶剂20ml，将具塞锥形瓶置于恒温式水浴磁力搅拌器中，在60℃下匀速搅拌提取2h。将提取液转移至离心管中，用10000r/min离心机离心10min，准确吸取上清液5.00ml置于25.00ml容量瓶中，用纯甲醇溶解稀释至容量瓶刻度，摇匀。用一次性无菌针头分别吸取适量不同样品溶液，用0.22μm微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪。以五种游离蒽醌类化合物提取率为指标，采用主成分分析法，筛选出最适低共熔溶剂体系。

4.2.3低共熔溶剂体系的选择实验结果

低共熔溶剂的性质与其组成组分的类型有着密切的联系，同时溶剂性质也决定了提取率的大小。在同一提取条件下，选取了13种不同的低共熔溶剂对大黄中的五种游离蒽醌类化合物进行提取，并用传统大黄游离蒽醌类化合物提取有机溶剂氯仿作为对照。不同低共熔溶剂及氯仿提取大黄中五种游离蒽醌化合物的提取率结果如表3所示。

表3不同溶剂对大黄中五种游离蒽醌类成分提取率的影响

由表3可知，低共熔溶剂对大黄中五种游离蒽醌类化合物都具有较好的提取率，其中lgh、pmh、mch对五种游离蒽醌类化合物提取率都大于传统·溶剂氯仿的提取率。由于大黄中五种游离蒽醌类化合物性质不同，导致同一种溶剂并不是对五种游离蒽醌类化合都表现出最高的提取率，不能直接通过五种游离蒽醌化合物的提取率筛选出最适的提取溶剂。其中，pmh对芦荟大黄素的提取率最高，为2.56mg/g；pch对大黄酸的提取率最高，为4.01mg/g；lgh对大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的提取率最高，分别为1.55mg/g、5.68mg/g和4.99mg/g。因此，本研究利用simca-p软件，通过降维的思路方法，采用主成分分析法，将13种不同低共熔溶剂及氯仿的五种游离蒽醌类化合物的提取率结果转化成两个主成分指标，主成分分析的因子载荷图和得分图如图1所示。

图1(a)为五种游离蒽醌在主成分分析中的因子贡献率，由图可知，pc1为大黄酚和大黄素甲醚，特征值百分比为72.8％，pc2为芦荟大黄素、大黄酸和大黄素，特征值百分比为15.5％，两主成分总特征值为88.3％(大于80％)，说明可以用这两主成分的贡献率客观的评价各溶剂对五种游离蒽醌类化合物综合提取能力的高低。图1(b)为13种低共熔溶剂和氯仿的主成分得分图，由图可知，fch、xch、xoch和sch在图上相距较近，表明这四种低共熔溶剂对五种游离蒽醌化合物的提取能力相似；mch与pc2相距最近，表明mch对芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的提取效果最好；lgh与pc1相距最近，表明其对大黄酚和大黄素甲醚的提取效果最好。但是，由于pc1在主成分分析中所占贡献率大于pc2，因此选取lgh为提取大黄中五种游离蒽醌的最适低共熔溶剂。

再将体系中乳酸∶葡萄糖不同摩尔配比后进行蒽醌提取率考察，试验结果表明，乳酸∶葡萄糖的摩尔比为1∶2，含水量为20％，提取率最高(见图2、图3)。

4.3超声预处理条件

超声预处理条件：40℃，600w超声提取10min。

4.4响应面优化低共熔溶剂提取工艺条件

根据单因素实验结果，分别用a、b、c来表示超声波的提取时间，提取温度和液固比，按表4选择响应面实验各因素水平，设计box-behnken实验，每组实验平行实验3次，最后取平均值，进行实验结果的处理，y表示大黄总蒽醌提取率。

表4响应面优化设计各因素水平表

表5box-behnken实验设计及实验结果

表6box-behnken实验设计回归模型方差分析结果

注：*表示显著，**表示极显著。

box-behnken响应面优化的结果显示，提取时间，提取温度和液固比对总蒽醌提取率的影响，在95％的概率水平上差异显著。实验结果拟合方程为：y＝25.23+0.28a+0.58b+0.36c-0.35ab-0.21ac+0.38bc-1.96a²-2.12b²-1.95c²

r²＝0.9973，变异系数为0.046，说明此模型与实际试验拟合较好，由表6可知试验失拟项不显著，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。试验优化条件为：提取时间1.53h，提取温度81.42℃，液料比25.51ml/g，优化大黄总蒽醌最大提取率为25.38mg/g。考虑实际操作条件，选择提取时间1.5h，提取温度82℃，液料比26ml/g，三次验证试验测定总蒽醌提取率为25.28±0.07mg/g。(见图4、图5、图6)

4.5五种蒽醌的分离纯化

结果表明，dm130大孔树脂对芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的分离纯化效果最好，具有较高的回收率，分别为84.08％、79.51％、84.96％、81.83％和78.35％。经hplc测定，纯化的五种游离蒽醌纯度均大于90％。

4.6低共熔溶剂提取大黄中蒽醌的研究

以低共熔溶剂(乳酸和d-(+)-葡萄糖摩尔比为1∶2，含水量为20％(v/v)的混合溶剂)为提取低共熔溶剂。取干燥的大黄粉，加入1倍量的10％硫酸酸化，烘干，然后加入26倍量的低共熔溶剂，于40℃、600w超声10min，然后于82℃水浴搅拌提取1.5h。总蒽醌提取率为25.6mg/g。将提取物冷却后离心，将得到的上清液按3∶1(ml/g)上样到dm130大孔树脂上，先用适量纯水洗脱大孔树脂柱数遍，至molish反应检测洗脱液不含糖为止，然后用90％乙醇作为洗脱液，以1bv·h^-1的速度洗脱，分别收集90％乙醇溶液的洁洗液，记录体积。hplc检测，合并相同组分洗脱液，浓缩结晶，将结晶产物45℃真空烘干后得到大黄蒽醌单体。

综上所述，本发明所采用的提取溶剂为低共熔溶剂，替代了传统提取的氯仿等有毒有机溶剂，减少了大黄产业的环境污染，绿色环保，同时本发明低共熔溶剂可回收重复使用，大幅降低了提取成本，适合工业化大生产。