一种防治辣椒疫病的生防放线菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种防治辣椒疫病的生防放线菌菌株及其应用，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术：

由辣椒疫霉(phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病是辣椒生产中一种毁灭性的土传病害，目前在世界各辣椒产区均有发生。该病不仅可以通过雨水或灌溉水在土壤中传播，引起大面积死苗，也可以通过气流传播，为害辣椒茎、叶、花、果实，在适宜发病条件下，病害在短期内爆发成灾，可造成寄主作物绝收，严重影响我国辣椒产业发展，造成重大的经济损失。

目前辣椒疫病的防治主要还是依赖培育抗病品种和使用化学药剂，其中栽培抗病品种是防治该病最经济、最有效、最简便的方法，但是由于疫病菌群体的易变异性致使很多抗病品种逐渐丧失了原有的抗性，而在短时间内选育出具有水平抗疫病的新品种是非常困难的。农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但随着社会的发展，伴随化学农药引起的安全及环境问题也日益凸显。使用化学农药不仅缺乏长期的有效性，而且对食品和环境的污染，对人类健康潜在的危害、对非靶标生物的影响以及导致病原菌抗药性产生等问题，现已受到越来越多的质疑。因此，生物防治尤其是拮抗微生物的利用受到普遍关注和重视，探索有效的生防途径无疑有着重大的理论意义和实用价值。

放线菌（actinomycetes）是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的约8000种生物活性物质当中，近70%是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，如中生菌素、阿维菌素等，其都具有无污染、无残留、可再生、效果持久、针对性强、难以使有害生物产生抗药性、易于产业化、成本低等特点，在农业生产中具有较高的环境效益和经济效益，开发前景极其广阔。因此，通过筛选和利用拮抗菌达到高效、环保的生物防治目的已成为当前农业科学研究的热点之一，符合农业的可持续发展要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对目前辣椒疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治辣椒疫病的生防放线菌及其应用方法。

一种防治辣椒疫病的生防放线菌菌株及其应用方法，本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治辣椒疫病的生防放线菌st19，经形态观察、培养特征观察和分子生物学研究鉴定为链霉菌(streptomycessp.)，已于2014年3月24月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；菌种保藏号为cgmccno.8962。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述防治辣椒疫病的生防放线菌菌株st19制备的生防菌剂，所述生防菌剂是由所述放线菌菌株st19发酵而成。

本发明还提供了上述利用防治辣椒疫病的生防放线菌菌株st19制备生防菌剂的方法，其步骤如下：

1）种子液的制备：将所述的菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃，200r/min，培养2d后，制成种子液；

2）发酵：将种子液接种于发酵培养基中，发酵条件为：接种量6%vol、装瓶量70ml/250ml、发酵培养基初始ph值7.0，28℃，200r/min，发酵时间5d，制成浓度为10⁸cfu/ml的st19菌株发酵液；

3）无菌滤液的制备：将发酵液4000r/min离心5min后，用0.45µm灭菌微孔滤膜过滤除菌，得无菌滤液。

其中，步骤2）所述发酵培养基的配方为：可溶性淀粉2%wt、葡萄糖1.5%wt、黄豆粉2%wt、mgso4·7h2o0.05%wt、k2hpo40.1%wt、nacl0.1%wt、caco30.2%wt，其余为蒸馏水。

上述生防菌剂的应用方式有以下两种：

1）在辣椒幼苗期或成株期灌根使用：在辣椒幼苗期或成株期连续使用2~3次，每次间隔7~10d；

2）与有机肥混合制成菌肥使用。

上述防治辣椒疫病的生防放线菌菌株st19可应用于辣椒疫病生物防治中。

本发明的优点在于：

本发明筛选出的生防放线菌st19能够明显抑制辣椒疫霉的生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，可减少农田污染，且能有效防治辣椒疫病。

本发明生防放线菌分离自辣椒根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。

本发明生防放线菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株st19气生菌丝和孢子丝形态（光学显微镜下400×）。

图2为菌株st19菌丝形态（电子显微镜5000×）。

图3为拮抗菌株st19对辣椒疫霉的平板抑菌效果图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一拮抗放线菌的分离

具体过程如下：

1、土壤样品的采集

从福建省建瓯市东峰镇坤口村采集不同辣椒地块5~10cm深处的根围土壤，分装标记后带回实验室，待自然风干后分离。

2、放线菌的分离

采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置5分钟，依次稀释10倍，分别配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基（加入终浓度为50mg/l的k2cr2o7）平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5~7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到80株放线菌。

实施例二菌株st19的鉴定

1、形态特征观察

将菌株st19划线接种在高氏一号培养基上，以45℃斜插入无菌盖玻片，28℃培养10d后，取出盖玻片在光学显微镜和电子显微镜下观察菌丝的形态特征（图1和图2）。

2、培养特征观察

采用《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基，将菌株st19于28℃培养7~10d后观察菌体生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。菌株st19在高氏一号培养基、察贝克培养基、淀粉铵培养基、pda培养基、葡萄糖酵母膏培养基和燕麦培养基上生长良好，基内菌丝和气生菌丝发育良好；而在克氏一号培养基和葡萄糖天门冬素培养基上生长较差，在高氏一号培养基和pda培养基上产生黄褪色或棕褪色可溶性色素(表1)。根据以上形态特征分析，对照链霉菌鉴定手册，将st19鉴定为链霉菌(streptomycessp.)。

表1菌株st19在不同培养基上的培养特征

3、16srdna序列分析

基因组提取试剂盒提取菌株st19基因组dna后，采用通用引物f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和r:5'-ggttaccttgttacgactt-3'，进行16srdna的pcr扩增。回收pcr扩增产物得到st19-16srdna，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序得核苷酸序列信息，序列全长为1548bp。将所得序列提交到genbank数据库进行blast分析比对，发现与st19同源性达到99%的菌株均属于链霉菌属，结合形态学特征和培养特征，最终将菌株st19鉴定为链霉菌(streptomycessp.)。

实施例三st19菌株发酵工艺的优化

将上述菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃，200r/min，培养2d后，制成种子液，接种于发酵培养基中。以辣椒疫霉为靶标菌，通过对碳源、氮源的筛选以及营养条件单因子试验和正交试验后，得到该菌株的最佳发酵配方为：可溶性淀粉2%wt、葡萄糖1.5%wt、黄豆粉2%wt、mgso4·7h2o0.05%wt、k2hpo40.1%wt、nacl0.1%wt、caco30.2%wt，其余为蒸馏水。最佳发酵条件为：接种量6%vol、装瓶量70ml/250ml、发酵培养基初始ph值7.0，28℃，200r/min，发酵时间5d，制成浓度为10⁸cfu/ml的st19菌株发酵液。将发酵液4000r/min离心5min后，用0.45µm灭菌微孔滤膜过滤除菌，得无菌滤液。

实施例四菌株st19拮抗测定

采用平板对峙培养法，将菌株st19对辣椒疫霉作拮抗测定，首先在黑麦培养基平板中央接入5cm辣椒疫霉菌饼，待辣椒疫霉菌落长至3cm时，在菌落4周点接上菌株st19，25℃下培养5d后测量菌株st19对辣椒疫霉的抑菌带宽度，以不接拮抗菌为对照，结果表明菌株st19对辣椒疫霉具有较好的拮抗作用（图3）。

实施例五菌株st19发酵液盆栽防效试验

选取4~6叶期的茄门甜椒苗，每株苗浇灌50mlst19菌株发酵液（10⁸cfu/ml）。24h后灌根接种辣椒疫霉游动孢子悬浮液（5×10³个/ml），每株20ml。接种4天后再浇灌一次100mlst19菌株发酵液。以72%克露可湿性粉剂600倍液灌根处理作为农药对照，以发酵培养基和清水处理的植株作为空白对照。每个处理10株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到80%以上时结束实验。

病情分级标准如下：

0级：无病；

1级：幼苗根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

3级：幼苗根茎部变黑1~2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

5级：幼苗根茎部变黑2cm以上，叶片不可恢复性萎蔫或叶片脱落明显；

7级：幼苗根茎部变黑缢缩，除生长点外叶片全部脱落或植株萎蔫；

9级：植株枯死。

病情指数（%）=[∑病级数×该病级植株数)／(最高病级数×总植株数)]×100%

防治效果（%）=[(空白对照病情指数－处理病情指数)／空白对照病情指数]×100%

实验结果见表2，该结果表明供试放线菌st19发酵液能够显著降低辣椒疫病的病情指数，防治效果高达66.85%，仅略低于化学农药72%克露可湿性粉剂600倍液的防治效果71.06%。另外从表中还可以看出，发酵培养基处理的病情指数略低于清水对照处理的病情指数，但两者差异不显著。温室盆栽实验结果说明，st19菌株能够有效防治辣椒疫病，表现出良好的应用潜力。

表2放线菌st19发酵液对辣椒疫病的防治效果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种防治辣椒疫病的生防放线菌菌株及其应用

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