一种流行性乙型脑炎的重组酶常温扩增核酸（RT‑RPA）试纸条检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测流行性乙型脑炎病毒的等温扩增技术与封闭式侧向流层析技术相结合的试剂盒及应用。

背景技术：

流行性乙型脑炎又称日本乙型脑炎(japaneseencephalitis，je)，简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus，jev)引起的一种中枢神经系统的急性人畜共患传染病，被世界动物卫生组织(oie)列为二类动物疫病，被我国卫生部列为乙类传染病。该传染病主要以三带缘库蚊(culextritaeniorhynchus)作为主要的传播媒介，以高热和狂暴或者沉郁等神经症状为主要特征。流行性乙型脑炎的爆发具有明显的季节性和一定的地理分布区，多发生于夏秋季节蚊类孳生的季节，属于自然疫源性虫媒传染病。

乙型脑炎主要流行于热带、亚热带和温带地区，特别是亚洲东部、东南部的水稻产区，气候温暖、潮湿多雨，蚊虫大量孳生时最为流行，故该病大规模流行呈现一定的周期性。乙型脑炎流行初期主要发生在日本、朝鲜和中国等温带地区，日本于1924年首次证实该病，并分离到病毒。如今，乙型脑炎已经扩展到北起俄罗斯、西伯利亚，南至澳大利亚，东抵美国关岛，西达印度西海岸，而其流行区域还在逐渐扩大。我国处于乙脑病毒流行区域，是乙脑发病人数最多的国家，先后爆发过三次乙脑流行，除了青海、新疆、西藏以外的各省市均有发病的报道。乙型脑炎的流行呈明显的季节性，发病的高峰期在7、8月之间。随着乙脑疫苗的推广和规范，乙脑的发病率明显下降，局部区域时有爆发，疫区主要分布在河南、安徽、江苏、江西等地，尤其是海南、广东、台湾以及福建。

流行性乙型脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属，乙型脑炎病毒粒子为球形，二十面体对称，直径约35-40nm，分子量为4.2×106d。jev基因组全长约11kb，由5′-utr(untranslatedregion,utr)、3′-utr以及仅有的一个开放读码框(openreadingframe，orf)共同组成一个开放式阅读框(orf)，编码大小为3432个多聚蛋白体。其中，e蛋白是jev最重要的结构蛋白，也是目前研究最广泛和充分的蛋白。e蛋白分子量为53kda，含有500个氨基酸残基，其对应的基因组也是相对保守的区域。

目前常用于检测流行性乙型脑炎的方法包括病原的分离鉴定、血清学方法和rt-pcr、荧光定量pcr。其中病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验的敏感性及特异性较低，操作也比较麻烦；而rt-pcr、荧光定量pcr技术需要特殊的仪器设备(如pcr仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作，显然无法满足基层和现场检测的需求。

重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinaseploymeraseamplication,rpa)是由重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内dna复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增。该技术主要依赖于三种酶：t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsx和uvsy、单链结合蛋白gp32及bsudna聚合酶。其中，重组酶蛋白可以与引物结合，形成dna核蛋白微丝，微丝可以结合匹配的dna片段，并紧密结合发生重组，在单链结合蛋白的帮助下,模板dna开始解链,在bsudna聚合酶的作用下进行复制延伸,对模板上的目标区域进行指数式扩增。整个过程仅需在37-42℃下反应20-40分钟即可。与pcr相比，整个过程不需要高温变性和低温退火，反应简单、快速高效。目前，该技术已经成功应用于各种病原检测以及转基因、癌症等多个领域。ahmedabdeiwahed等应用rt-rpa设计了禽流感(h7n9)病毒的便携式诊断方法，同时，也开发了埃博拉病毒的便携式rt-pcr装置；chien-chungchao等研发了立克次体的rpa检测方法。但目前没有将该技术应用到流行性乙型脑炎上。

本发明针对流行性乙型脑炎病毒的e基因，建立并评估了基于rt-rpa核酸试纸条检测试剂盒。与常规pcr引物不同，rpa所需的引物长度为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp,引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对rpa的结果至关重要。rpa技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。

技术实现要素：

本发明目的是提供一具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单、密闭的检测流行性乙型脑炎病毒的rt-rpa核酸试纸条试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测流行性乙型脑炎病毒的rt-rpa核酸试纸条试剂盒，包含如下引物组、探针和核酸检测试纸条：

所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

jev-rpa-f：5’-(biotin)cggaaaaccatgggaattactcagcgcaa-3’

jev-rpa-r：5’-catgtgcctcttcaaattccatgaggagttc-3’

jev-rpa-p：5’-(fitc(fam))ctccttggttcacaatccagtgtgacttct

c(thf)cataatcaccaagct(c3spacer)-3’

引物jev-rpa-f的5’端修饰了biotinlabel；探针jev-rpa-p的5’端修饰了6-carboxyfluorescein(fam)label,中间修饰了abasictetrahydrofuran(thf)residue,3’端修饰了c3spacer。

所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；

所述的检测流行性乙型脑炎的rt-rpa核酸试纸条试剂盒包含上述引物组、探针、twistamptmnfokit和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；

所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品；该检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到；

所述的twistamptmnfokit即重组酶聚合酶等温扩增技术，购自英国twistdx公司；试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液rehydrationbuffer、280mm醋酸镁溶液。

所述的检测流行性乙型脑炎的rt-rpa核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

(1)配置rt-rpa反应体系，在rpa冻干颗粒中加入29.5μlrehydrationbuffer，2.1μl10μmprimera，2.1μl10μmprimerb，0.6μl10μm探针，9.2μl双蒸水，4μl病毒dna模板，在反应管盖上加280mm醋酸镁溶液2.5μl，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测,2-5min观察结果；

(3)结果判读：直接肉眼判读

①阴性：仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有流行性乙型脑炎病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为流行性乙型脑炎病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

扩增反应在温度设定为37-42℃的水浴锅中进行，反应时间15-30min，结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。

更优选的，扩增反应在温度设定为37℃的水浴锅中进行，反应时间为20min,结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益结果：

(1)本发明系首次采用rt-rpa核酸检测试纸条建立快速检测jev的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为jev的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

(2)采用本发明的引物和探针组合，通过rpa技术对流行性乙型脑炎病毒进行检测的方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

本发明选用的流行性乙型脑炎e基因引物是经过大量试验筛选获得的，特异性好，与猪的其他病毒包括猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒ⅰ型、猪圆环病毒ⅱ型无交叉反应。rpa能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平；本发明所建立的检测方法可检测到的100pgcdnajev病毒。

(3)本发明的rpa技术并结合核酸试纸条技术检测流行性乙型脑炎病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的流行性乙型脑炎病毒的检测。

(4)检测速度快：与常规pcr相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤，rpa最适温度在37-42℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。

(5)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测，本发明所建立检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要pcr仪、荧光定量pcr仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，且rpa不需要复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1为jevrt-rpa凝胶检测体系的建立及引物筛选结果图，其中：

a为筛选上游引物电泳亮度关系图，以r1为下游引物，上游引物为f1-f4，泳道1～4依次对应上游引物f1、f2、f3、f4，得出f2为最佳上游。

b为筛选上游引物电泳亮度关系图，以f2为上游引物，下游引物为r1-r4，泳道1～4依次对应上游引物r1、r2、r3、r4，得出r1为最佳上游。

图2为jevrt-rpa-lfd检测方法的建立以及不同jev毒株rt-rpa-lfd检测方法分析，其中：

a为jevrt-rpa-lfd检测方法建立结果图，分别表示为1:ddh2o(空白对照)；2:阴性细胞液(控制对照)；3:阴性血液(控制对照)；4:阴性脑组织(控制对照)；5:阴性蚊子(控制对照)6:jev/sw/gd/2009株阳性对照。

b为不同jev毒株rt-rpa-lfd检测方法分析：分别表示为1：空白对照；2：jev/sw/gd/2009株；3：p3株；4：sa14-14-2株

图3为检测本发明试剂盒特异性的结果图，其中：

第一个检测装置是以ddh2o为模板的rt-rpa反应产物；第二个检测装置是以csfv(猪瘟病毒)石门株基因组为模板的rt-rpa反应产物；第三个检测装置是以pedv(猪流行性腹泻病毒)基因组为模板的rt-rpa反应产物；第四个检测装置是以prrsv(猪繁殖与呼吸综合征)为模板的rt-rpa反应产物；第五个检测装置是以ppv(猪细小病毒)为模板的rt-rpa反应产物；第六个检测装置是以prv(伪狂犬病毒)为模板的rt-rpa反应产物；第七个检测装置是以pcv-i(猪圆环病毒-ⅰ型)为模板的rt-rpa反应产物；第八个检测装置是以pcv-ii(猪圆环病毒-ⅱ型)为模板的rt-rpa反应产物；第九个检测装置是以jev(流行性乙型脑炎病毒)为模板的rt-rpa反应产物。

图4为jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr的敏感性检测结果图，其中：

a为jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr电泳凝胶检测体系cdna含量敏感性结果图，图中均为：1的模板是ddh2o(空白对照)；2的模板是含量1ug的jevcdna；3的模板是含量为100ng的jevcdna；4的模板是含量为10ng的jevcdna；5的模板是含量为1ng的jevcdna；6的模板为含量为100pg的jevcdna；7的模板是含量为10pg的jevcdna；8的模板是含量为1pg的jevcdna；9的模板是含量为100fg的jevcdna；10的模板是含量为10fg的jevcdna。

b为jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr电泳凝胶检测体系毒株梯度稀释敏感性结果图，图中均为：1的模板是ddh2o(空白对照)；2的模板是毒株浓度为107.5tcid50/ml；3的模板是毒株浓度为106.5tcid50/ml；4的模板是毒株浓度为105.5tcid50/ml；5的模板是毒株浓度为104.5tcid50/ml；6的模板是毒株浓度为103.5tcid50/ml；7的模板是毒株浓度为102.5tcid50/ml；8的模板是毒株浓度为101.5tcid50/ml；9的模板是毒株浓度为100.5tcid50/ml。

c为jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr电泳凝胶检测体系猪脑模型临床模拟梯度稀释敏感性结果图，将tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作为初始毒株，用猪脑组织稀释液对初始毒株进行10倍梯度进行稀释(100～10-6)，图中均为：1的模板是阴性猪脑组织研磨液(空白对照)；2的模板是稀释梯度100即tcid50/ml为107.5；3的模板是稀释梯度10-1即tcid50/ml为106.5；4的模板是稀释梯度10-2即tcid50/ml为105.5；5的模板是稀释梯度10-3即tcid50/ml为104.5；6的模板是稀释梯度10-4即tcid50/ml为103.5；7的模板是稀释梯度10-5即tcid50/ml为102.5；8的模板是稀释梯度10-6即tcid50/ml为101.5。

d为jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr电泳凝胶检测体系蚊子模型临床模拟梯度稀释敏感性结果图，将tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作为初始毒株，用蚊子组织稀释液对初始毒株进行10倍梯度进行稀释(100～10-6)，图中均为：1的模板是阴性猪脑组织研磨液(空白对照)；2的模板是稀释梯度100即tcid50/ml为107.5；3的模板是稀释梯度10-1即tcid50/ml为106.5；4的模板是稀释梯度10-2即tcid50/ml为105.5；5的模板是稀释梯度10-3即tcid50/ml为104.5；6的模板是稀释梯度10-4即tcid50/ml为103.5；7的模板是稀释梯度10-5即tcid50/ml为102.5；8的模板是稀释梯度10-6即tcid50/ml为101.5。

e为jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr电泳凝胶检测体系重组质粒标准品梯度稀释敏感性结果图，图中均为：1的模板是ddh2o(空白对照)；2的模板是1010拷贝/μl；3的模板是109拷贝/μl；4的模板是108拷贝/μl；5的模板是107拷贝/μl；6的模板是106拷贝/μl；7的模板是105拷贝/μl；8的模板是104拷贝/μl；9的模板是103拷贝/μl；10的模板是102拷贝/μl；11的模板是101拷贝/μl；12的模板是10-1拷贝/μl。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

twistampnofkits购自twistdx公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；提取病毒dna/rna试剂盒购自omegabio-tek公司；m-mlv反转录酶，rna酶抑制剂、2×taqpcrmixdna聚合酶、随机引物、dntp(2.5mm)、琼脂糖购自takara公司；全封闭式靶核酸扩增产物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司。

实施例1快速检测流行性乙型脑炎病毒的rt-rpa核酸试纸条试剂盒及检测方法的建立。

一、引物及探针序列的设计及制备

本发明发明人通过对genbank中的jev基因同源序列进行对比分析，确定了流行性乙型脑炎病毒e基因的保守区域，根据rpa引物设计原则，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的流行性乙型脑炎病毒。rpa对引物长度的要求是30-35bp，扩增产物在500bp之内，扩增效率较高。要建立一种快速、灵敏的检测方法，需要进行多次引物的筛选，引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，所以，在保守基因区域，设计一系列梯度候选引物，再根据rt-rpa凝胶检测的结果，从中选择最佳引物。针对jeve基因的保守区域序列，应用引物设计软件primepremier5.0进行rpa引物设计，同时应用生物软件oligo7.0对引物进行初步筛选，以确保各引物对之间产生的二聚体较少为原则。设计引物对，并由上海生工生物工程技术服务有限公司对所设计的引物进行合成与标记。本发明分别设计合成了四条上游引物、四条下游引物、一条探针，如下表所示：

二、流行性乙型脑炎病毒rt-rpa反应

1、病毒rna的抽提：

取本实验室保藏jev/sw/gd/2009株、p3株，使用omegaviralrnaextractionkitver.5.0抽提rna，所用离心管等耗材均经0.1﹪depc处理，确保无rna酶污染，按照以下步骤进行抽提：

(1)配置qvlbuffer：每管(即每个样品)含有560μlqvlbuffer，添加5.6μlcarrierrna，10μlβ-巯基乙醇，现配现用；

(2)添加140μl样品，充分混匀30s；

(3)室温孵育5-10min；

(4)添加560μl无水乙醇，充分混匀30s；

(5)加650μl混合物至hibindrna,操作要仔细而迅速，10000g,30s弃滤液；

(6)重复步骤(5)至所有的液体全部经过滤柱；

(7)换新的2ml收集管，加500μlrwa，10000g离心30s后，弃滤液；

(8)换新的2ml收集管，加500μlrwb,，10000g离心30s后，弃滤液；

(9)空管10000g离心3min后，弃滤液；

(10)换新的1.5mlep管加30-50μldepc水，静置3-5min，10000g离心1min。

2、cdna合成

以提取的rna为模板，用mlv酶进行反转录反应，反应体系如下：

(1)配置rna反转录反应预体系，将提取的rna吸取5.75μl于新的1.5mlep管中，再加入1μl随机引物，70℃水浴10min后立即冰浴2min。

(2)配置rna反转录反应体系，rna引物混合液6.75μl，5×buffer2μl，dntpmix0.5μl，rnaseinhibitor0.25μl，m-mlv0.5μl，充分混匀，然后30℃水浴10min，42℃水浴1h。

3、jevrt-rpa凝胶检测体系的建立及引物筛选：

我们以提取纯化的病毒dna为模板进行扩增，并对设计引物进行筛选，筛选出最优引物。实验步骤如：

①以r1为下游引物，筛选上游引物f1-f4。

(1)配置rt-rpa初始反应体系：29.5μl水解缓冲液(rehydrationbuffer,twistampnofkit)，9.2μl的ddh2o,2.4μl上游引物(10μm)，2.4μl下游引物(10μm)，4μl的病毒dna模板；

(2)rt-rpa凝胶检测反应步骤：将上述47.5μl缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnofkit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μl的280mm的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，处理5min；

(5)反应5min后，取出反应管，再次混匀后继续放入37℃的金属恒温箱中反应20min；

(6)反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定,得出f2为最佳下游。试验结果如图1a所示；

②以f2为上游引物，筛选下游引物r1-r4，得出r1为最佳上游，试验结果如图1b所示，结果确定jevrt-rpa凝胶反应体系最优引物。

4、jevrt-rpa试纸条检测体系的建立

①探针设计，探针5’端标记fam基团，中间thf替代g或c(dspacer)，且dspacer两侧尽量避免g、c，dspacer与5’端至少30碱基，与3’端至少15碱基，3’端c3-spacer修饰。

②在筛选出的最佳引物中，将探针相对应的引物的5’标记生物素(biotin)。rt-rpa-lfd反应体系引物与探针序列如下所示：

jev-rpa-f：5’-(biotin)cggaaaaccatgggaattactcagcgcaa-3’

jev-rpa-r：5’-catgtgcctcttcaaattccatgaggagttc-3’

jev-rpa-p：5’-(fitc(fam))ctccttggttcacaatccagtgtgacttct

c(thf)cataatcaccaagct(c3spacer)-3’

③具体实现步骤如下所示：

(1)以病毒cdna为模板作为阳性对照，以ddh2o为阴性对照，以阴性细胞液、阴性血液、阴性脑组织、阴性蚊子为控制对照，；分别加入下列组分：29.5μl水解缓冲液(rehydrationbuffer,twistampnofkit)，9.2μl的ddh2o，2.1μl上游引物(10μm)，2.1μl下游引物(10μm)，0.6μl探针(10μm)，4μl模板；

(2)rt-rpa凝胶检测反应步骤：将上述47.5μl缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnofkit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μl的280mm的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，处理5min；

(5)反应5min后，取出反应管，再次混匀后继续放入37℃的金属恒温箱中反应20min；

(6)反应结束后，用核酸试纸条密闭反应装置进行检测，通过试纸条的显色进行判读。试验结果如图2a所示。

5、不同jev毒株rt-rpa-lfd方法分析，包括jev/sw/gd/2009株、p3株、sa14-14-2株，其中jev/sw/gd/2009株、p3株由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保藏；日本乙型脑炎活疫苗(日本乙型脑炎病毒(jev)sa14-14-2株)由武汉科前生物技术有限公司生产，具体操作如4jevrt-rpa试纸条检测体系的建立所要求，试验结果如图2b所示。

6、检测体系特异性、敏感性分析

为了检验jevrt-rpa-lfd检测方法的特异性，本试验选择猪瘟病毒(csfv)、流行性腹泻病毒(pedv)、猪蓝耳病毒(prrsv)的cdna，猪细小病毒(ppv)、伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒1型(pcv-1)、猪圆环病毒2型(pcv-2)的dna作为特异性对照组，用rt-rpa-lfd方法进行检测。试验结果表明，只有jev阳性模板呈现质(c)、检(t)两条红线，检测结果是阳性，其他病毒均只有质控线(c)一条红线，检测结果是阴性。试验结果如图3所示，该结果表明所建立的jevrt-rpa-lfd检测方法具有良好的特异性。

jevrt-rpa-lfd方法的敏感性分析：

①jevrt-rpa-lfd方法的cdna敏感性分析，抽提jev/sw/gd/2009株的rna模板并反转录成cdna，制备出jev的cdna标准品(1μg/μl)作为初始模板，将初始模板进行10倍梯度稀释(10-1～10-9)，反应产物分别用常规rt-pcr凝胶电泳、rt-rpa-lfd方法进行检测。试验结果如图4a显示，常规rt-rcr琼脂糖凝胶电泳法可以检测到的cdna最低检测限为100fg,rt-rpa-lfd检测方法最低检测限为100fg，两者敏感性一致。

②jevrt-rpa-lfd方法的毒株浓度敏感性分析，将tcid50是107.5/ml的jev/sw/gd/2009株作为初始毒株浓度，将初始毒株浓度进行10倍梯度稀释(100～10-7)，每个浓度分别进行rna模板并反转录成cdna，再用常规rt-pcr凝胶电泳、rt-rpa-lfd方法进行检测。试验结果如图4b所示，常规rt-rcr琼脂糖凝胶电泳法可以检测到的jevtcid50/ml最低检测限达104.5,rt-rpa-lfd检测方法最低检测限也为104.5，两者敏感性一致。

③猪脑模型jevrt-rpa-lfd方法的临床模拟试验敏感性分析，将tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作为初始毒株，用猪脑组织稀释液对初始毒株进行10倍梯度稀释(100～10-6)，制成不同浓度的临床jev猪脑模型，每个模型分别进行rna模板并反转录成cdna，再用常规rt-pcr凝胶电泳、rt-rpa-lfd方法进行检测。试验结果如图4c所示，常规rt-rcr琼脂糖凝胶电泳法可以检测到的jevtcid50/ml最低检测限达103.5,rt-rpa-lfd检测方法最低检测限也为103.5，两者敏感性一致。

④蚊子模型jevrt-rpa-lfd方法的临床模拟试验敏感性分析，将tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作为初始毒株，用蚊子组织液对初始毒株进行10倍梯度稀释(100～10-6)，制成不同浓度的临床jev蚊子模型，每个模型分别进行rna模板并反转录成cdna，再用常规rt-pcr凝胶电泳、rt-rpa-lfd方法进行检测。试验结果如图4d所示，常规rt-rcr琼脂糖凝胶电泳法可以检测到的jevtcid50/ml最低检测限达104.5,rt-rpa-lfd检测方法最低检测限也为104.5，两者敏感性一致。

⑤根据jeve基因保守区域，设计构建重组质粒标准品的上下游引物，通过病毒rna抽提，反转录，pcr反应，pcr产物胶回收，连接，转化等步骤将目的片段克隆到pmd18-t载体形成重组质粒，按照omega质粒抽提试剂盒提取重组质粒。通过紫外分光光度计测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓

所述的检测流行性乙型脑炎病毒的rt-rpa核酸试纸条试剂盒，还包含200u/μl的m-mlv反转录酶、5倍反应缓冲液(5×rtbuffer)、dntp(10mm)、rnaseinhibitor均购自takara公司。

所述的试剂盒更优选为包含浓度为5u/μl的amv逆转录酶、10倍反应缓冲液(10×thermopolreactionbuffer)、浓度为8u/l的链置换dna聚合酶、浓度为2.5mmol/l的dntp混合物溶液、浓度为100mmol/l的mgso4溶液、浓度为10μmol/l的引物fip、浓度为10μmol/l的引物bip、浓度为10μmol/l的引物f3、浓度为10μmol/l的引物b3、浓度为10μmol/l的引物loopf和浓度为10μmol/l的引物loopb；

所述的检测流行性乙脑病毒的rt-rpa核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

(1)配制jev反转录体系，①按终浓度计算，随机引物50-250ng/ul、jevrna，70℃水浴10min，立即冰浴2min；②上述混合液、m-mlv反转录酶为100u/μl、5倍反应缓冲液(5×rtbuffer)为1倍(1×)、dntp混合物为0.4～0.6mmol/l、rnaseinhibitor，30℃水浴10min，42℃水浴1h。

(2)配制jev-rt-rpa反应体系，按终浓度计算,

(3)配制rt-lamp反应体系，按终浓度计算，amv逆转录酶为105u/l、10倍反应缓冲液(10×thermopolreactionbuffer)为1倍(1×)、链置换dna聚合酶为0.32u/l、dntp混合物为0.4～0.6mmol/l、甜菜碱为1～2mol/l、mgso4为0～3mmol/l、fip引物为1.6μmol/l、bip引物为1.6μmol/l、f3引物为0.2μmol/l、b3引物为0.2μmol/l、loopf引物为0.6μmol/l、loopb引物为0.6μmol/l，待测样品rna为12ng/μl；恒温反应；

(4)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10min观察结果；

(5)结果判读：直接肉眼判读，

①阴性(－)：仅在质控区(c)出现一条红色条带，在检测区(t)内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

②阳性(+)：出现两条红色条带，一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区(c)内，证明所检测的样本为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

③无效：质控区(c)和检测区(t)内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。