本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒。
背景技术：
基因是具有遗传效应的dna片段，是遗传信息的存储载体，它储存着生命的种类、生长、发育、繁殖、疾病及死亡等过程的全部信息。基因由碱基构成，碱基包括腺嘌呤a，鸟嘌呤g，胞嘧啶c和胸腺嘧啶t。其中a与t，g与c两两配对，基因的信息就存储在这些碱基序列中。基因需要进行遗传和复制。在细胞分裂和dna的复制过程中，在细胞的增殖过程中，基因的dna序列通过进行半保留复制，虽然这一过程中序列保真性非常高，但复制过程中难免出现差错。此外，环境中的一些因素，例如紫外线，甲醛，黄曲霉素等也会诱发复制过程中的基因突变的发生。基因的碱基突变主要包括三种，碱基的缺失，插入和替换。对于编码蛋白质的基因来说，蛋白质编码区的碱基发生缺失，插入或者替换都会导致具有正常功能蛋白无法表达，进而对细胞及生物体的生命活动产生影响。
基因突变绝大多数都是有害的，在很多疾病的发生和发展过程中，突变基因都具有重要的作用。例如，镰刀型贫血症是由于血红蛋白相关基因发生突变引起。正常的血红蛋白由两个α珠蛋白和两个β珠蛋白结合形成四聚体。而当这两种珠蛋白发生突变时，则无法形成正常的血红蛋白，因而结合氧气的能力大大受限，而且红细胞容易破碎。又如，许多中国人喝酒容易脸红，这是由于线粒体中的一个蛋白相关基因乙醛酸脱氢酶2中第259位的一个鸟嘌呤发生替换引起。该突变导致其乙醛脱氢酶催化活性降低，因此乙醛在体内积累，导致脸色和皮肤发红。除了先天性疾病之外，一些老年慢性疾病也与基因突变密切相关。肿瘤便是一个最为常见的例子，例如在胰腺癌中，90％以上的患者癌基因kras都发生了突变。kras具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能，在正常情况下，它的活性受到磷酸化的调节，而当它发生突变时，调节的位点失活而无法被调控，因而一直处于活性状态，进而导致了癌细胞的不断增殖。又如著名的凋亡相关抑癌基因p53，它在50％以上的患者中均发生了突变，p53基因发生突变时，不但其正常的促进凋亡的功能无法实现，而且常常会获得一些促进肿瘤形成的新的功能，这些功能包括改变细胞的代谢结构，促进细胞的增殖和迁移等等。因此，基因突变在疾病的形成和发展过程中常常发挥着重要的作用。
由于基因突变与疾病的发生发展过程密切相关，因此，对细胞的基因突变进行检测就具有非常重要的意义。例如在新生儿早期筛查中，筛选新生儿的dna进行突变的测定是检查新生儿是否患有白化病，苯丙酮尿症，遗传性耳聋等的重要方法之一。相较于传统的检测方法，突变筛查具有检测时间早，灵敏度高和可靠性好等优点。例如白化病等病人目前通过基因检测的方法，可以在妊娠前几周就能较为准确的检测出来。在疾病的预防中，基因突变检测也具有非常重要的作用，例如儿童先天性耳聋，当线粒体基因突变时，倘若服用氨基糖甙类抗生素者，就容易引起耳聋。倘若能够及早发现，在用药时避免使用氨基糖甙类抗生素者，就能够避免这一情况的发生。另外，一些突变基因特别容易诱发癌症，例如brac1和brca2突变，特别容易诱发乳腺癌，卵巢癌妇科恶性肿瘤。此外，突变检测在疾病的治疗中也具有重要的应用。例如，在胰腺癌中，绝大多数病人的肿瘤组织中均发现了kras突变，携带kras突变的病人一般病情比较严重，而且难以治愈。在肺癌中，egfr突变是一个重要的检测位点，当检测到其发生突变时，可以通过特异性靶向药物吉非替尼进行治疗而且具有非常好的疗效。在精准医学的治疗中，基因突变检测将会是一个非常重要的常规的检测手段。
基因突变检测非常重要，目前也已经开发出了许多非常有效的检测手段。最主要的方法有测序检测、芯片检测和arms-pcr检测。测序检测是采用sanger测序的方法，通过碱基互补配对的原则对dna的序列进行读取。这一方法读取的片段较短，一次最多只能读取800个bp的碱基，但是精度很高，是目前检测突变可靠的方法。但它也有一些不足，比如，每次检测的片段不是太长，而每个基因一般都包含内含子，因此基因一般都非常长，常常在1万个bp以上，因此采用这一方法必须连续设计至少数十对pcr引物，挨个进行可靠性的尝试，过程非常繁琐和费时；此外，读取需要找公司或者专门的机器，因此也比较费时。通过rna-seq和外显子测序等芯片技术进行检测是近几年发展起来的一种高通量的检测技术。这一方法通过一群细胞便能对整个基因组的基因突变情况有一个了解，由于它包含着所有的基因，因此它能反映出体内基因的一个整体全貌以及所有可能的突变情况，因而对个体的健康状况以及可能诱发的疾病做一个整体的评估。然而，它也有自身的缺点，首先便是耗时太长，一般一次芯片检测需要一个月左右的时间，分析也需要一个月，总共需要两个月左右时间，而对一些疾病，比如晚期肿瘤病人来说，这些时间过于漫长，许多肿瘤病人结果未出来就已经离世了；第二个是它价格高昂，一次检测包括分析一般需要3到4万人民币，有些时候还常常到10万以上；第三个不足，是它的精确度对单个基因来说比较差，由于它测量的是人体内几十亿个碱基，因此它对单个碱基的精度无法保证，常常需要进一步的测序，以对单个碱基的序列进行验证。arms-pcr检测法是目前国际上检测单点突变先进的方法，由于pcr反应从引物的3’末端开始，因此当3’端与模板不匹配时，pcr难以进行；然而，由于其引物序列仍为正常长度，引物与模板结合紧密，仍然有可能产生条带，产生假阳性的结果；同时它的灵敏度也不是很高，需要突变样本占样本总量的1％以上。
因此，如何解决上述突变检测技术在实际应用中的困难和不足，是一个必须要突破的问题。
技术实现要素：
鉴于目前在基因突变检测领域方法技术不足，本发明的目的在于提供一种检测基因突变的方法，能够较为简单，方便，快捷和准确地对基因的序列进行检测，旨在解决目前需要专业检测设备以及耗时较长等问题。
本发明的技术方案如下：
一种检测基因突变的方法，所述的方法包括pcr反应，所述的pcr反应采用的引物对中，针对突变位点的引物是截短的，为8-14bp；如能够克隆出目的条带，表明发生了相应的突变，反之，则未发生突变。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的pcr反应为普通pcr反应或荧光定量pcr反应。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的pcr反应为普通pcr反应，所述的目的条带通过琼脂糖凝胶电泳的方式检测。
作为本发明的一个优选例，所述的pcr反应其退火温度在55℃以下。
作为本发明的一个优选例，所述的pcr反应其延伸温度不超过72℃。
更优选地，所述的pcr反应其延伸温度为68℃。
本发明还提供了一种检测基因突变的试剂盒，所述的试剂盒包含引物对，其中针对突变位点的引物是截短的，为8-14bp。
作为本发明的一个优选例，所述的引物对为seqidno:1和seqidno:3所示的序列。
作为本发明的一个优选例，所述的引物对为seqidno:4和seqidno:6所示的序列。
本发明还提供了seqidno:1和seqidno:3所示的序列构成的引物对在检测kras是否携带ggt>gat突变的试剂中的应用。
本发明还提供了seqidno:4和seqidno:6所示的序列构成的引物对在检测p53是否携带agg>agt突变的试剂中的应用。
传统的pcr反应一般用于扩增特异的dna片段，本发明通过实验，首次发现pcr反应在基因突变检测方面也大有可为。在pcr反应结束之后，只需通过跑dna琼脂糖凝胶电泳观察条带或者定量pcr的检测荧光即可很快速地对是否发生突变进行判断。本发明的方法具有以下优点：
1.我们的方法较为快捷，如果采用荧光定量的方法，全部检测在两个小时左右可以结束，而如果采用普通pcr的方法，时间稍长一些，但两个半小时左右也能结束，最长不超过三个小时，可以做到当天检测，当天出结果；
2.我们的方法成本低，价格便宜，便于大规模开展。由于仅仅需要pcr等试验，采用的原料十分简单易得，价格也经济实惠。需要的仪器设备也不昂贵，操作简单，因此便于大规模开展应用；
3.新方法准确率高。现有的检测方法中，测序的方法也需要采用pcr这一步骤，而我们采用的是特异性的引物，因此特异性和专一性都很强，在反应条件中，我们也经过了进一步的优化，进一步提高了准确率。
附图说明
图1：普通pcr反应显示缩短的序列具有检测突变的功能。
左边检测kras突变：293t携带正常的基因，panc1携带突变的基因(ggt>gat)。
右边检测p53突变：hepg2携带正常的基因，huh7携带突变的基因(agg>agt)。
图2：荧光定量pcr显示缩短的序列具有检测kras突变的功能。
图3：荧光定量pcr显示缩短的序列具有检测p53突变的功能。
图4：引物正常序列长度(21bp)时pcr检测的结果。
图5：普通pcr反应显示缩短的突变序列检测效果。
图6：荧光定量pcr反应显示缩短的突变序列检测效果。
图7：普通pcr反应显示截短的正常和突变引物检测效果。
图8：普通pcr反应显示截短的正常和突变引物检测的灵敏度。
图9：胰腺癌肿瘤样本检测kras突变。
图10：肝癌肿瘤样本检测tp53突变。
具体实施方式
本发明提供一种检测基因突变的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具体的实施方法如下：
1.设计检测目的突变的截短的引物序列，并在已知的突变阳性和阴性样本中进行验证。
2.采用设计并验证的截短的引物对样本进行pcr实验或者荧光定量pcr实验。
3.pcr实验中的退火温度为40～55℃，延伸温度为58～72℃，具体的反应条件需要根据截短的引物序列进行选择。
4.倘若进行pcr实验，则将pcr产物进行dna电泳，检测是否有目的条带，分析样本是否携带突变；
倘若进行荧光定量pcr实验，通过观察扩增曲线和溶解峰，从而对样本是否携带突变进行分析。
以下各实施例中，kras和p53的普通pcr反应体系为：
2xtaq聚合酶反应混合液25μl，上游引物0.2-1μl(10μm)，下游引物0.2-0.5μl(10μm)，dna模板50ng-500ng，灭菌蒸馏水补足到50μl。
kras和p53的普通pcr反应条件为：
kras和p53的荧光定量pcr反应体系为：
2x荧光定量pcr反应混合液10μl，上游引物0.2-0.5μlmol(10μm)，下游引物0.1-0.25μl(10μm)，dna模板25ng-200ng，灭菌蒸馏水补足到20μl。
kras和p53的荧光定量pcr反应条件为：
引物序列如下：
实施例1：普通pcr反应显示缩短的引物序列具有检测突变的功能
如图1所示，左边检测的是kras基因，检测结果显示，正常长度的引物(krasnpf和kraspr)在kras正常和突变细胞中都能产生pcr产物，而截短的突变引物(krasmpf和kraspr)则只在有突变细胞系的panc1中产生，而在正常细胞系293t中则没有。因此，截短的kras突变引物区分了突变的样本和正常的样本。同样在p53基因中，截短的突变引物(tp53mpf和tp53pr)在携带正常p53基因的hepg2细胞中未产生条带，而在携带突变p53的huh7细胞中产生了条带。
实施例2：荧光定量pcr显示缩短的序列具有检测kras突变的功能
我们又通过荧光定量pcr的方法检测截短的引物是否可以鉴定样本是否携带突变，结果如图2所示，panc1n指的是kras的正常长度引物对panc1样本进行检测，293tn指的是kras的正常长度引物对293t样本进行检测，panc1m指的是kras的截短的突变引物对panc1样本进行检测，293tm指的是kras的截短的突变引物对293t样本进行检测。溶解峰显示是否有单一的pcr产物，结果显示，panc1n、panc1m和293tn都能出现正常的溶解峰，而293tm则没有出现正常的溶解峰，这表明截短的突变引物可以区分正常和突变的kras基因。
实施例3：荧光定量pcr显示缩短的序列具有检测p53突变的功能
我们也对p53突变的情况进行了验证，荧光定量pcr的反应条件与kras的反应条件相同。huh7n指的是p53的正常长度引物对huh7样本进行检测，hepg2n指的是p53的正常长度引物对hepg2样本进行检测，huh7m指的是p53的截短的突变引物对huh7样本进行检测，hepg2m指的是p53的截短的突变引物对hepg2样本进行检测。结果显示，huh7n、huh7m和hepg2n都能出现正常的溶解峰，而hepg2m则没有出现正常的溶解峰，这表明截短的突变引物可以区分正常和突变的p53基因。
实施例4：正常序列长度(21bp)时pcr检测结果难以鉴别基因突变
pcr反应的条件与实施例1相同，结果显示，当引物为正常长度时，无论是kras基因还是p53基因，正常的引物和突变的引物都能够在这些细胞中跑出条带，因此正常的引物长度较难区别正常和突变的基因。
实施例5：普通pcr反应显示缩短的突变序列检测效果
我们然后测试了缩短引物长度对条带产生的影响，突变kras引物针对的是携带突变kras的panc1样本，突变p53引物针对的是携带突变p53的huh7样本，引物长度范围(6bp～20bp)。左边kras的结果显示在kras基因的检测过程中，当缩短至8bp和6bp时，开始无法产生条带；而对于右边的p53基因，当引物缩短至6bp时，也无法产生扩增条带。这一结果显示显示引物大小应该大于6bp。
实施例6：荧光定量pcr反应显示缩短的突变序列检测效果
我们又通过定量pcr的方法对实施例5的结果进行验证，结果如图6所示。kras和p53基因我们都选用了三个引物：20bp、16bp和6bp。左边的峰为kras基因，右边的峰为p53基因。在kras中，20bp和16bp的引物仍然可产生条带，而6bp的无法扩增出条带，这进一步暗示引物大小应该大于6bp。
实施例7：普通pcr反应显示截短的正常和突变引物检测效果
接着我们又检测了截短的突变和正常引物的检测效果(见图7)。左边为kras的检测结果，右边为p53的检测结果；n代表的是正常序列引物，m代表的是突变序列引物。结果显示，在携带正常kras的293t细胞中，正常的kras引物可以扩增出条带，而突变的引物则不行；相反在携带突变kras的panc1细胞中，突变的引物可以扩增出条带，而正常的也不行，这显示，截短的引物对正常和突变的序列具有较好的区分效果。p53的检测中显示的结果也是一致的。
实施例8：普通pcr反应显示截短的正常和突变引物检测的灵敏度
灵敏度是检验检测性能的一个重要指标。我们将正常和突变的kras基因构建到质粒plvx-ires-zsgreen1中，构建了携带正常kras基因的质粒(记为kn)和携带突变kras基因的慢病毒质粒(记为km)。鉴定正确之后检测质粒的浓度。混合kn和km，其中km在混合后的占比分别为0％、0.1％、1％、100％。0％为纯正常质粒kn，100％为纯突变质粒km。截短的突变kras引物pcr及dna电泳结果显示，在km的含量仅为0.1％时，即已能被检出(图8)。同样的，我们也成功的构建了携带正常和突变p53的质粒并进行检测，结果显示0.1％的突变p53即可用被检测出来。
实施例9：肿瘤样本胰腺癌(检测kras)
我们收集了胰腺癌肿瘤病人的组织样本，通过收集rna，反转录的方法获得肿瘤组织cdna，然后进行组织突变检测(图9)。结果显示：组织2、组织3、组织4、组织5和组织7这5例样本均携带kras突变，经测序对比，表明检测结果正确。这显示在胰腺癌中，kras突变的概率较大。
实施例10：肿瘤样本肝癌(检测tp53)
我们也收集了肝癌病人的组织样本进行检测(见图10)。结果显示，组织2、组织5和组织8携带有p53突变，经测序对比，表明检测结果正确。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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