本发明与微生物有关，具体而言，与发酵菌剂有关，进一步来说，涉及秸秆的发酵菌剂。
技术背景
作物秸秆的有机质含量高，富含农作物生长所需的营养元素，几乎不含杂质.是有机肥较佳的原料，由其生产的产品具有较高的农用价值。然而，秸秆类的含碳量较高、c/n比值高，并不适合单独作为有机肥的原材料，而需要与含碳量较低、c/n比值低的粪便类配合使用。一般软质作物秸秆的木质素、纤维素、半纤维素含量相对较低，较易腐熟，如水稻、小麦、油菜、玉米等。而硬质秸秆，如谷壳、木屑和树皮的木质素、纤维素、半纤维素含量较高、c/n在100以上，不易分解，降解时间长，能较长期保持原有的形态。但黄豆、棉花、烟草等的杆，一般作为水分含量高、c/n比值低的污泥、畜禽粪尿的辅料，需要控制用量，物料粒径要小，颗粒越细，才能加快降解速度。
对于不同种类的秸秆，要使其加快降解变为肥料，传统的方法就是通过将秸秆发酵。有机肥发酵过程会发生两个主要变化，一个是把复杂的有机物质(纤维素、半纤维素、蛋白质等)分解为简单的无机化合物，这是养分有效化的过程，称之为矿质化过程；另一个是有机物矿质化过程中形成的中间产物，再合成为比原来更为复杂的腐殖质，称之为腐殖化过程。众所周知，发酵是一个微生物的生化过程，需要使用细菌。不同硬度的秸秆，使用的菌种也不一样。
经检索，中国专利数据库中涉及发酵菌或菌剂的专利申请件不很多，检索到的有zl2006101461458号《栓菌ah28－2固态发酵生产漆酶的方法》、2011104132326号《一种大肠埃希氏菌rb3菌株及用它液态发酵制备乙酰酯酶的方法》、2014100753519号《一种西瓜用防病高产em菌剂发酵复合肥料》、2014100752658号《一种西瓜种植用em菌剂发酵复合肥料》、2015103288138号《一种鸽粪em菌发酵法》等，这些发酵菌剂并不能用于秸秆的发酵。适用于秸秆发酵的专利申请件有2011102578402号《一种秸秆发酵复合菌剂及其应用》，系由枯草芽孢杆菌、黄绿木霉、酿酒酵母、米曲霉、扩张青霉、绿色木霉复合而成。目前尚无用于硬质秸秆发酵菌剂的专利申请件。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种硬质秸秆发酵菌剂的配制方法，用以提高硬质秸秆的发酵速度，从而用于制造有机肥料，为农业生产服务。
发明人提供的用于硬质秸秆发酵菌剂的配制方法包括以下步骤：
第一步，选定菌种：以真菌白腐菌和细菌枯草芽孢杆菌作为配制用于硬质秸秆发酵菌剂的原料菌种；所述真菌白腐菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，真菌白腐菌对纤维素降解能力较强；所述细菌枯草芽孢杆菌自行筛选和培养的。
对于选用的原料菌种，都需要通过常规的手段，测定其对烟草主要病原菌拮抗作用，鉴定选用的活性菌株分子；确定其用于配制混合菌剂的可行性。
第二步，菌种的培养：
(1)真菌白腐菌的培养
①真菌白腐菌母种的培养
事先将玉米粒浸泡72h后装袋，并于121℃下高压蒸汽灭菌30-40min后冷却备用；接着将活化后的白腐菌接种于玉米粒培养基，置恒温培养箱内28℃培养，等到菌丝长满整个玉米粒之后备用；
②真菌白腐菌的扩大培养
将培养好的白腐菌母种接入到麦麸棉籽壳混合培养基中，置恒温培养箱内28℃培养，待培养基表面长满菌丝后，每48h翻抛1次，直到白腐菌布满整个麦麸棉籽壳培养基。
(2)细菌枯草芽孢杆菌培养
①枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保存的枯草芽孢杆菌菌株在na固体培养基、平板上于37℃培养箱中培养16h，然后挑取单菌落于种子培养基中，37℃，170r·min-1条件下培养16h作为种子液。
②枯草芽孢杆菌的固体发酵：将麦麸与按照质量配比3∶1组成的棉籽壳混合物在121℃、30min间隔灭菌两次，得到麦麸棉籽壳混合培养基；然后将枯草芽孢杆菌种子液按10％的接种量接入到麦麸棉籽壳混合培养基中，麦麸棉籽壳混合培养基的添加量为20％，含水量为60％，发酵温度为28℃，翻抛次数为1次/24h；实现枯草芽孢杆菌的固体发酵。
第三步白腐菌、枯草芽孢杆菌混合菌剂的配制
取第二步扩大培养后的白腐菌和扩大培养后的枯草芽孢杆菌按照1∶3的质量配比混合均匀，然后按照每包1000g的量装入事先消毒杀菌的容器，储存在阴凉、干燥、通风、避光处、避免和有毒物品一起储运。在上述储运条件下保质期18个月。
上述方法第一步中所述测定对烟草主要病原菌拮抗作用，是对烟草黑胫病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、烟草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)进行拮抗试验；所述鉴定选用的活性菌株分子包括pcr扩增、dna序列测定与分析。
上述方法第二步中所述混合培养基是麦麸棉籽壳与棉籽壳按照质量配比3∶1的混合物，在121℃、30min间隔灭菌两次制得的；所述na固体培养基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、琼脂15-20g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5；所述种子培养基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5。
上述方法第三步中所述容器可以是包装袋、包装桶、包装罐、玻璃瓶中的一种。
为了配制用于硬质秸秆发酵菌剂，发明人进行了以下研究与试验：
1拮抗细菌的分离、纯化
1.1样品的稀释称取烟草根际土壤样品、有机肥各5g(精确到0.01g)，分别加入带玻璃珠的45ml无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成样品母液。对样品母液进行10倍倍比稀释。
1.2加样及培养每个样品取3个连续适宜的稀释度，细菌取10-4、10-5、10-6。分别吸取不同稀释度样品悬浮液0.1ml，加至预先制备好的固体na培养基平板上，涂布直至液体被完全吸收，每个梯度3个重复。细菌放置于28℃条件下培养。
1.3分离细菌的纯化、保存将分离得到的细菌通过平板划线法进行纯化，并将纯化物接入相应的斜面培养基上培养，4℃保存备用。
2分离细菌对烟草主要病原菌拮抗作用的测定
2.1指示烟草病原菌的选择以烟草黑胫病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、烟草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)作为靶标病原菌，利用平板对峙培养法和抑菌圈法，对分离得到的细菌进行抑菌活性筛选。
2.2细菌对烟草黑胫病菌的拮抗试验将供试烟草病原真菌分别在pda平板上活化3d后，用打孔器(直径6mm)沿供试烟草病原菌菌落边缘打取菌碟备用，将分离得到的菌株在na培养基平板上活化24h后，用接种环取一环优势菌株在pda平板中央划线，供试烟草病原菌分别接种在pda平板两侧，接种点均距平板中心2.5cm。同时以只接种病原菌的平板为对照，每处理设3次重复，置于25℃光照培养箱中黑暗条件下恒温培养。培养至第3d时，逐日观察记载病原菌菌落半径，根据菌丝生长抑制率比较各分离菌株对供试烟草病原真菌的抑制效果。
菌落半径＝测量菌落平均半径–3.0mm
菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100
2.3细菌对烟草青枯病菌的拮抗试验将细菌活化后涂布接种在平板上培养24h后，在无菌条件下用6mm打孔器制成菌碟，将菌碟放置于涂布接种有烟草青枯病菌的平板上，28℃培养，每隔12h观察1次，培养48h后用十字交叉法测定抑菌圈的直径，每处理重复3次，以无菌的培养基打孔代替菌碟做为对照(ck)。相对抑菌率(％)＝(抑菌圈直径-菌碟直径)/菌碟直径×100％。
2.4细菌对烟草病原菌的拮抗试验结果
通过平板对峙培养和抑菌圈法筛选获得1株对烟草青枯病菌、烟草黑胫病菌具有强拮抗作用的菌株，用于下一步鉴定。
3活性菌株的分子鉴定
3.1pcr扩增
采用试剂盒法提取具有明显抑菌活性细菌菌株的基因组dna(试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。扩增和测序所用的引物为xjf:5’-agagtttgatcatggctcag-3’和xjr:5’-aaggaggtgatccagccgca-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。pcr反应采用20μl反应体系，包括模板dna溶液(浓度为50ng/μl)1μl、10×buffer2.0μl、dntp(浓度2.5mm)2.0μl、引物xjf(浓度10μmol/l)和xjr(浓度10μmol/l)各0.5μl、extaqdnapolymerase(5u/μl)0.5μl、加ddh2o至20μl。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸90s，33个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用于胶回收。
3.2dna序列测定与分析
pcr产物用tiangelmidipurificationkit琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收，再与pmd18t-vector载体(大连takara公司)连接转化感受态大肠杆菌，重组质粒纯化后交由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果用bioedit7.0软件进行分析，并将dna序列提交于genbank数据库中进行blast同源序列比对。
3.3活性菌株的分子鉴定结果
活性菌株经分子鉴定为枯草芽孢杆菌(基因登录号：kp777596)。
4白腐菌、枯草芽孢杆菌混合菌剂的比例设定
(1)将扩大培养后的白腐菌和扩大培养后的枯草芽孢杆菌分别按照1∶3、2∶3、3∶2、3∶1的比例进行混配，混合均匀后分别测不同配比菌剂的有效活菌数及蛋白酶酶活和纤维素酶酶活。
(2)4种配比混合菌剂的有效活菌数及酶活
4种配比混合菌剂的有效活菌数见表1。由表1可以看出，白腐菌：枯草芽孢杆菌(2∶3)配比浓度的混合菌剂，其真菌数量4.12×107个/g，细菌数量1.18×109个/g，其有效活菌数为1.2212×109。
4种配比混合菌剂的纤维素酶及蛋白酶活性见表2。由表2可看出，白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)配比浓度的混合菌剂纤维素酶及蛋白酶活性分别为77.5715u/g、53.0000u/g，均高于其他配比浓度的混合菌剂。
表14种配比混合菌剂的有效活菌数检测结果(个/g)
表24种配比混合菌剂的纤维素酶及蛋白酶活性(u/g)白腐菌：枯草
结合有效活菌数和两种酶的活性考虑，选择白腐菌：枯草芽孢杆菌2∶3为最佳配比浓度。
采用本发明方法配制的混合菌剂，用于硬质秸秆发酵菌剂，可有效地提高硬质秸秆的发酵速度，从而用于制造有机肥料，为农业生产服务。适用于农业生产中秸秆的回收利用。
附图说明
图1为本发明的菌剂与天地缘发酵菌的发酵温度对比图。
具体实施方式
实施例1：配制用于硬质秸秆发酵菌剂
选定真菌白腐菌和细菌枯草芽孢杆菌为配制用于硬质秸秆发酵菌剂的原料菌种；真菌白腐菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)；细菌枯草芽孢杆菌自行培养；
对于选用的原料菌种，对烟草黑胫病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、烟草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)进行拮抗试验，测定其对烟草主要病原菌拮抗作用；通过pcr扩增、dna序列测定与分析鉴定选用的活性菌株分子；确定其用于配制混合菌剂的可行性。
接着进行菌种的培养：
(1)真菌白腐菌的培养
①真菌白腐菌母种的培养
事先将玉米粒浸泡72h后装袋，并于121℃下高压蒸汽灭菌30-40min后冷却备用；接着将活化后的白腐菌接种于玉米粒培养基，置恒温培养箱内28℃培养，等到菌丝长满整个玉米粒之后备用；
②真菌白腐菌的扩大培养
将培养好的白腐菌母种接入到麦麸棉籽壳混合培养基中，置恒温培养箱内28℃培养，待培养基表面长满菌丝后，每48h翻抛1次，直到白腐菌布满整个麦麸棉籽壳培养基。所述混合培养基是麦麸棉籽壳与棉籽壳按照质量配比3∶1的混合物，在121℃、30min间隔灭菌两次制得的；
(2)细菌枯草芽孢杆菌培养
①枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保存的枯草芽孢杆菌菌株在na固体培养基、平板上于37℃培养箱中培养16h，然后挑取单菌落于种子培养基中，37℃，170r·min-1条件下培养16h作为种子液。所述na固体培养基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、琼脂15-20g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5；所述种子培养基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5。
②枯草芽孢杆菌的固体发酵：将麦麸与按照质量配比3∶1组成的棉籽壳混合物在121℃、30min间隔灭菌两次，得到麦麸棉籽壳混合培养基；然后将枯草芽孢杆菌种子液按10％的接种量接入到麦麸棉籽壳混合培养基中，麦麸棉籽壳混合培养基的添加量为20％，含水量为60％，发酵温度为28℃，翻抛次数为1次/24h；实现枯草芽孢杆菌的固体发酵。
最后，进行白腐菌、枯草芽孢杆菌混合菌剂的配制：取扩大培养后的白腐菌和扩大培养后的枯草芽孢杆菌按照2∶3的质量配比混合均匀，然后按照每包50kg的量装入事先消毒杀菌的包装袋，制得本发明的菌剂。
实施例2：实施本发明的硬质秸秆发酵菌剂效果案例之一
在安徽省合肥市中国科学技术大学烟草与健康研究中心实验室利用发酵箱来验证白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)在腐熟硬质秸秆(甘蔗渣)上的实施效果。
试验表明：
1.白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)在用于一种硬质秸秆(甘蔗渣)有机肥发酵时，发酵平均温度分别为33.3℃，高于天地缘发酵菌(粉剂)(32.4℃)，而且高于50℃温度天数达15天，比天地缘发酵菌(粉剂)多2天。
2.白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)的发酵菌剂在甘蔗渣有机肥生产中，能促进有机肥中真菌、细菌、放线菌等微生物的生长，并对大肠杆菌、霉菌等微生物以及蛔虫卵的生长起到一定的抑制作用，提高有机肥成品质量，尤其是甘蔗渣有机肥成品的大肠杆菌达到ny884～2012生物有机肥料标准要求，好于天地缘发酵菌(粉剂)。
表1可以看出白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)对发酵过程中有机肥微生物和蛔虫卵数量的影响：
表1白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)对发酵过程中有机肥微生物和蛔虫卵数量的影响
3.添加白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)的发酵菌剂生产的甘蔗渣有机肥成品的有机质、总氮、总磷、总钾和腐殖酸等养分指标与天地缘发酵菌(粉剂)相当，达到ny525～2012有机肥料标准要求。但白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)的发酵菌剂在发酵前期表现好。
表2白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)对发酵过程中有机肥主要化学成分的作用
实施例3实施本发明的硬质秸秆发酵菌剂效果案例之二
2016年在贵州省兴义市猪场坪有机肥工场利用有机肥规模现场堆制来验证白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)在腐熟硬质秸秆(甘蔗渣和烟杆混合材料)有机肥堆制中的实施效果(以当前生产上使用效果较好的商品菌剂作对照)。
规模示范堆制表明：
⑴在硬质秸秆(甘蔗渣和烟杆)有机肥规模堆制发酵过程中，白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)能能提高发酵温度(特别是前期发酵温度)和高于50℃温度天数，有利于物料的分解和腐熟；其中平均发酵温度为47.7℃高于天地缘发酵菌(粉剂)(45.0℃)，且高于50℃温度天数为21天，比天地缘发酵菌(粉剂)多9天。本发明的菌剂与天地缘发酵菌的发酵温度对比见附图1。
⑵利用白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)发酵后的有机肥质量符合ny525-2012农业部有机肥料行业标准，且总磷、总钾、总养分含量和ph分别高于天地缘发酵菌(粉剂)0.22、0.10、0.30、0.08个百分点。
表1白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)对发酵后有机肥质量的影响
3白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)发酵能提高发酵后有机肥微生物数量，其中有益微生物细菌、真菌、放线菌数量数量分别比天地缘发酵菌(粉剂)提高23.2％、97.1％、22.2％。
表2白腐菌∶枯草芽孢杆菌(2∶3)对发酵后有机肥有益微生物数量的影响