以脱脂小麦胚芽为原料制备免疫球蛋白和免疫活性肽的方法与流程

本发明属于农产品深加工及其副产品综合利用的技术领域，涉及以脱脂小麦胚芽为原料制备免疫球蛋白和免疫活性肽的方法。

背景技术：

小麦胚芽是小麦生长发育的重要器官，是小麦的生命源泉，被誉为“人类天然的营养宝库”。由于小麦胚芽中富含不饱和脂肪酸，色素和酶，会影响面粉的色泽及贮藏期，因此在制粉过程中往往将小麦胚芽剔除。我国每年可开发利用的小麦胚芽量高达几百万吨,但绝大多数都未被合理利用。目前对于小麦胚芽油的利用率较高，而剩余的脱脂小麦胚芽粕往往作为饲料或者直接丢弃，造成极大的浪费。因此如何利用脱脂小麦胚芽粕，以创造更大的经济效益具有十分重要的意义。

脱脂小麦胚芽中蛋白含量约为30%，其中球蛋白占的比例约为15.6%。球蛋白的氨基酸含量均衡，必需氨基酸占总氨基酸的比例在麦胚各蛋白中最高，其中苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量较高。除蛋氨酸外，其它必需氨基酸与fao/who推荐模式相符。其次球蛋白的蛋白消化率在麦胚各蛋白中最高，是非常有价值的天然蛋白质。经过免疫活性评价发现，球蛋白具有一定的免疫效果。目前对于免疫蛋白主要是乳源及大豆源，小麦胚芽蛋白未见报道。多肽是蛋白质的酶解产物，多肽与蛋白质相比，更容易被机体所利用。目前已报道的免疫活性肽已有很多，但是主要是动物源活性肽。众所周知，植物源活性肽相对动物源，更加安全、健康，来源广泛，因此植物源的免疫活性肽越来越受到关注。植物源中大豆免疫活性肽报道的较多，而小麦胚芽源免疫活性肽尚未被报道。因此以小麦胚芽为原料，开发免疫活性蛋白和多肽对增加小麦的附加值也具有深远意义。

蛋白及多肽的免疫活性评价方法包括非特异性免疫和特异性免疫，其中非特异性免疫指细胞的固有免疫，而特异性免疫又分为细胞免疫和体液免疫。本发明建立的免疫评价体系涵盖了非特异性和特异性免疫，其中巨噬细胞吞噬中性红属于细胞的非特异性免疫，刺激淋巴细胞转化属于细胞免疫，而刺激巨噬细胞分泌的细胞因子，如一氧化氮、白介素、肿瘤坏死因子等具有杀伤侵入的外来物的作用。

技术实现要素：

本发明提供以脱脂小麦胚芽为原料制备免疫球蛋白和免疫活性肽的方法，，使用本发明的方法可以获得蛋白含量为85.3%，分子量主要分布在37kda和55kda，必需氨基酸与总氨基酸的比值（e/t）为42.49%，蛋白质消化率校正后的氨基酸分数（pdcaas）为0.42的免疫球蛋白以及水解度为9.1%-20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量为72.2%-84.6%，可溶性肽得率为40.3%-69.3%的免疫活性肽。

本发明技术方案如下。

以脱脂小麦胚芽为原料制备免疫球蛋白和免疫活性肽的方法，取脱脂小麦胚芽为原料，经过盐提酸沉，透析及冷冻干燥得到免疫球蛋白；用蛋白酶对球蛋白进行水解、大孔树脂吸附与解离，浓缩及冷冻干燥，获得水解度为9.1%-20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量为72.2%-84.6%，可溶性肽得率为40.3%-69.3%的球蛋白免疫活性肽。

上述方法，包括如下步骤：

（1）小麦胚芽球蛋白的制备：将过100-300目的脱脂小麦胚芽粉以1：10-1:30w/v的比例加入水，在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mmtris-hcl（ph8.0）所述tris-hcl中含0.3-0.5mnacl的溶液，同样在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min；获得的上清液用0.1-1m的hcl调ph至4.0，6000-9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调ph至7.0，然后透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白；

（2）酶解：将上述所得麦胚球蛋白配成4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保温5-10min，再冷却至37-55℃，用0.1-1mnaoh调节ph,使ph值在7.5-8.0，加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶，在37-55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入1m的naoh，使ph保持不变，水解完成后，调节ph至7.0，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，6000-9000r/min离心5-10min，保留上清液并冷冻干燥，得到多肽；

（3）大孔树脂吸附与解离：将上述得到的多肽配成浓度为10-30g/l的溶液，吸附到大孔树脂后，用水洗脱至流出液的吸光值与水接近，再用75%的乙醇洗脱，收集，旋转蒸发后冷冻干燥，得到免疫活性肽。

上述方法中，所述脱脂小麦胚芽粉的蛋白含量25-30%，水分含量为5-10%，灰分含量为5-10%。

上述方法中，所述水包括蒸馏水、纯净水、去离子水中的任意一种。

上述方法中，所述透析中使用的水包括蒸馏水、纯净水、去离子水、自来水中的任意一种，但是都要保持低温，当使用自来水时用流水透析。

上述方法中，碱性蛋白酶为液体或固体的任意一种；所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的添加量满足：每1kg底物加入10⁷u的酶，以碱性蛋白酶为例，如果它的酶活力是200u，那么1kg球蛋白需要加入50g碱性蛋白酶。

上述方法中，所述大孔树脂选自da201-c型号。

上述方法中，所述麦胚球蛋白的蛋白含量为85.3%，分子量主要分布在37kda和55kda，必需氨基酸与总氨基酸的比值（e/t）为42.49%，蛋白质消化率校正后的氨基酸分数（pdcaas）为0.42。

上述方法中，所述免疫活性肽的水解度为9.1%-20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量为72.2%-84.6%，可溶性肽得率为40.3%-69.3%。

上述方法中，经过免疫活性评价证明，在药物剂量为80μg/ml时，与空白对照组相比，球蛋白对小鼠脾淋巴细胞的转化能力提高了5.8%，raw264.7细胞的吞噬能力提高了15.11%，raw264.7细胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的能力分别提高了23.5%，40.3%，93.1%和253.4%。经过水解球蛋白，在药物剂量为80μg/ml时，与空白对照组相比，球蛋白多肽对小鼠脾淋巴细胞的转化能力提高了2.8%-27%，raw264.7细胞的吞噬能力提高了73.1%-114.6%，raw264.7细胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的能力分别提高了53.0%-81.35%，61.1%-326.3%，187.3%-305.1%和310.8%-703.1%。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

（1）本发明采用的原料是小麦胚芽榨油后的副产物，来源广泛，营养丰富,蛋白含量高。

（2）本发明可以得到两种产品，一个是氨基酸组成全面、且具有免疫功效的球蛋白，一个是具有更高免疫功效且易被机体吸收利用的多肽。

（3）本发明是以小麦胚芽油的副产物脱脂小麦胚芽粕为原料，提取球蛋白，然后用不同蛋白酶分别水解球蛋白，在一套工艺下可同时制备具有免疫活性的球蛋白和球蛋白多肽。工艺简单、高效，并且资源利用率高。

（4）本发明采用的免疫活性评价体系涵盖了特异性和非特异性免疫，可以较为全面的评价蛋白及多肽的免疫活性。

附图说明

图1是本发明提供的制备免疫球蛋白和免疫活性肽的工艺方法流程图；

图2为麦胚球蛋白及其酶解产物对小鼠脾淋巴细胞刺激指数的影响图；

图3为麦胚球蛋白及其酶解产物对raw264.7细胞吞噬能力的影响图；

图4为麦胚球蛋白及其酶解产物对raw264.7细胞产no能力的影响图；

图5为麦胚球蛋白及其酶解产物对raw264.7细胞产il-6能力的影响图；

图6为麦胚球蛋白及其酶解产物对raw264.7细胞产il-12能力的影响图；

图7为麦胚球蛋白及其酶解产物对raw264.7细胞产tnf-α能力的影响图；

图中：blank指空白对照组，cona和lps分别是阳性对照组，globulin是球蛋白，th、nh和ah分别是胰蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物和碱性蛋白酶酶解物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

本发明工艺方法流程图见图1。

实施例1

以蛋白含量为27%，脂肪含量为0.75%，水分含量为7.4%，灰分含量为6.9%的脱脂小麦胚芽为原料,将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同样在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min。获得的上清液用1m的hcl调ph至4.0，9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调ph至7.0，然后用蒸馏水透析72h并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。其蛋白含量为85.3%，分子量主要分布在37kda和55kda，必需氨基酸与总氨基酸的比值（e/t）为42.49%，蛋白质消化率校正后的氨基酸分数（pdcaas）为0.42。在药物剂量为80μg/ml时，球蛋白对小鼠脾淋巴细胞的转化值si为1.06，比空白对照提高了5.8%，raw264.7细胞的吞噬率为124.83%，比空白对照提高了15.11%，raw264.7细胞产no，il-6，il-12和tnf-α的量分别是24.13μm、309.92pg/ml、349.40pg/ml和5.15ng/ml，比空白对照分别提高了23.5%，40.3%，93.1%和253.4%（如图2~图7所示）。

实施例2

以蛋白含量为27%，脂肪含量为0.75%，水分含量为7.4%，灰分含量为6.9%的脱脂小麦胚芽为原料,将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同样在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min。获得的上清液用1m的hcl调ph至4.0，9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调ph至7.0，然后用蒸馏水透析72h透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。球蛋白配成4%的蛋白溶液，在90-95℃保温10min，再冷却至37℃。用1mnaoh调节ph至8.0，加入胰蛋白酶，加酶量是每1kg球蛋白加40g胰蛋白酶（酶活250u/mg）。在37℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入1m的naoh,使ph保持不变。水解完成后，调节ph至7.0，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，9000r/min离心5min，保留上清液并冷冻干燥。将上述得到的多肽配成浓度为10-30g/l的溶液，吸附到大孔树脂（da201-c）后，用水洗脱至流出液的吸光值与水接近，再用75%的乙醇洗脱，收集，旋转蒸发后冷冻干燥。得到的酶解产物水解度为9.1%，分子量低于1450da，蛋白含量为84.6%，可溶性肽得率为40.3%。在药物剂量为80μg/ml时，胰蛋白酶解多肽对对小鼠脾淋巴细胞的转化值si为1.03，比空白对照提高了2.8%；raw264.7细胞的吞噬率为176.03%，比空白对照提高了76.0%；raw264.7细胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的量分别是29.88μm、478.12pg/ml、519.77pg/ml和5.99ng/ml，比空白对照分别提高了53.0%，116.4%，187.3%和310.8%（如图2~图7所示）。

实施例3

以蛋白含量为27%，脂肪含量为0.75%，水分含量为7.4%，灰分含量为6.9%的脱脂小麦胚芽为原料,将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同样在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min。获得的上清液用1m的hcl调ph至4.0，9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调ph至7.0，然后用蒸馏水透析72h透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。球蛋白配成4%的蛋白溶液，在90-95℃保温10min，再冷却至55℃。用1mnaoh调节ph至7.5，加入中性蛋白酶，加酶量是每1kg球蛋白加166.7g胰蛋白酶（酶活60u/mg）。在55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入1m的naoh,使ph保持不变。水解完成后，调节ph至7.0，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，9000r/min离心5min，保留上清液并冷冻干燥。将上述得到的多肽配成浓度为10-30g/l的溶液，吸附到大孔树脂后，用水洗脱至流出液的吸光值与水接近，再用75%的乙醇洗脱，收集，旋转蒸发后冷冻干燥。得到的酶解产物水解度为20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量为72.2%，可溶性肽得率为69.3%。在药物剂量为80μg/ml时，中性蛋白酶解多肽对小鼠脾淋巴细胞的转化值si为1.05，比空白对照提高了5.3%，raw264.7细胞的吞噬率为173.06%，比空白对照提高了73.1%，raw264.7细胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的量分别为35.40μm、355.92pg/ml、537.04pg/ml和7.42ng/ml，比空白对照分别提高了81.3%，61.1%，196.9%和408.9%（如图2~图7所示）。

实施例4

以蛋白含量为27%，脂肪含量为0.75%，水分含量为7.4%，灰分含量为6.9%的脱脂小麦胚芽为原料,将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同样在25℃下搅拌2h，8000r/min低温离心10-20min。获得的上清液用1m的hcl调ph至4.0，9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调ph至7.0，然后用蒸馏水透析72h透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。球蛋白配成4%的蛋白溶液，在90-95℃保温10min，再冷却至50℃。用1mnaoh调节ph至8.0，加入中性蛋白酶，加酶量是每1kg球蛋白加50g碱性蛋白酶（酶活200u/mg）。在50℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入1m的naoh,使ph保持不变。水解完成后，调节ph至7.0，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，9000r/min离心5min，保留上清液并冷冻干燥。将上述得到的多肽配成浓度为10-30g/l的溶液，吸附到大孔树脂后，用水洗脱至洗脱液的吸光值与水接近，再用75%的乙醇洗脱，收集，旋转蒸发后冷冻干燥。得到的酶解产物水解度为19.1%，分子量低于1450da，蛋白含量为76.2%，可溶性肽得率为55.7%。在药物剂量为80μg/ml时，碱性蛋白酶解多肽对小鼠脾淋巴细胞的转化值si为1.27，比空白对照提高了27.4%，raw264.7细胞的吞噬率为214.59%，比空白对照提高了114.6%，raw264.7细胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的量为33.22μm、941.72pg/ml、732.83pg/ml和11.71ng/ml，比空白对照分别提高了70.1%，326.3%，305.1%和703.2%（如图2~图7所示）。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。