一种利用茶渣作为碳源制备细菌纤维素的方法与流程

本发明属于细菌纤维素制备领域，具体涉及一种利用茶渣作为碳源制备细菌纤维素的方法。

背景技术：

细菌纤维素（Bacterial Cellulose，BC），又称作微生物纤维素；化学式为(C₆H₁₀O)_n，是由β-D-葡萄糖单体以β-1,4糖苷键连接而形成的一种直链多糖生物质。由于拥有超细的三维网络结构、大量的纳米级孔径分布、很大的比表面积以及丰富的表面羟基基团，因此被广泛应用在食品、工业、造纸和医用等领域。

与植物纤维素相比， BC中吡喃葡萄糖的相邻6个碳原子呈稳定的椅式结构，而植物纤维素分子有螺旋结构。其三维结构中，同一条直链间，同一平面不同直链以及上下不同直链间都有氢键紧密交联，形成致密的交联网状结构，这使得BC虽然与自然界中植物或海藻产生的天然纤维素具有相同的分子结构单元，但具有许多独特的性质：（1）高纯度，与植物纤维素相比，BC经过分离提纯等简单工艺之后可获得纯度达 99%以上的纤维素，且不含有木质素、半纤维素和果胶等伴生产物；（2）具有高结晶度，最高可达95%，而植物纤维素的结晶度一般仅有65%，且BC还有很高的聚合度；（3）BC具有超精细网状结构，BC纤维是由直径3-4 nm的微纤维通过分子内和分子间的氧键作用而缠绕组合成40-60 nm粗的纤维束，并相互交织形成超精细的三维空间网状结构；（5）很强的持水能力，由于BC拥有致密的纳米网状结构，比表面积大，表面含有丰富的亲水性基团，这使得BC具有较高的持水性能，未经干燥的BC的WRV值高达1000% 以上，冷冻干燥后的持水能力仍超过600%；（6）生物合成具有可调控性，BC的经济价值主要体现在可以通过调控其生物合成的环境而改变其原有的结构性质，从而适应各种工业生产和学术研究的需求；（7）BC具有较好的适应性和较高的生物相容性，且具有良好的生物可降解性，能在相应的物理化学条件下降解，对环境友好，不会产生二次污染。

鉴于细菌纤维素的优良特性，细菌纤维素具有广泛而特殊的用途、在医用材料领域，细菌纤维素可以用于合成人造皮肤、人造血管、外科敷料、缓释药物的载体等；在食品工程领域，细菌纤维素本身就可以作为一种食品食用，如俗称椰果或者椰纤果；另外，BC还可以作为食品工业中的增稠剂、成型剂、添加剂等；在造纸工业方面，细菌纤维素的添加可以提高纸张抗张强度和耐破度，降低透气度，提高撕裂度等；在音响领域可作为生产超性能的声音振动膜；在材料领域，BC纳米纤维与其它高分子、有机或者无机分子的掺杂复合，可获得各种新的功能复合材料。

目前大规模利用细菌纤维素的障碍主要是其产量低，成本高，价格不敌普通纤维素，因此研究的重点集中在寻找新碳源上，寻找廉价合适的，既能降低生产成本又能提高纤维素的产量。

茶叶在生产与深加工过程中产生大量茶叶废弃物，即所谓的茶渣。我国茶渣的主要来源有两个：一是工业提取茶多酚等生化成分之后所形成的茶渣；二是茶饮料工业中形成的茶渣。因茶饮料工业所形成的茶渣中营养成分比较丰富，这里着重讨论茶饮料工业茶渣的开发。我国茶饮料工业虽然起步较晚，但发展势头十分强劲，茶饮料年产量成倍增长。从1997年起，茶饮料产量成倍增长，2000年一举超过果汁、果味饮料名列各类饮料的第三位。然而，目前内地人均年饮用茶饮料仅为0.4 L，日本人均年饮用茶饮料为20～30 L，也就是说，茶饮料在内地市场还应有30倍以上的成长空间。娃哈哈引进的4条茶饮料生产线，年消化干茶5000 吨，这表明将产生茶渣超过4000 吨；如此推算，目前生产茶饮料所产生的茶渣已超过4万吨，在接下的几年里生产量如增长30倍，茶渣将超过120万吨。如此多的茶渣目前基本都被当作工业废料抛弃，只有少量被作为肥料施用到田间，造成资源的巨大浪费。因此，将茶渣变废为宝，使难以处理的茶渣废料成为一种优质新型饲料，有利于生态环境的保护；也有利于降低企业成本，提高企业的市场竞争力。

茶饮料茶渣(速溶茶渣)指茶叶提取速溶成分后的残渣，经分析表明：粗纤维高达17%～19%，粗蛋白含量高达16%～18%，赖氨酸和蛋氨酸含量分别为1.5%～2%和0.5～0.7%，还含有一定量的维生素、茶多酚、咖啡碱及少量的茶皂素等，仍有较高的利用价值；大量茶渣常常被当作废料抛弃，造成了资源的极大浪费及生态环境破坏。因此如有一种技术能充分利用这些现有废弃资源，以其为碳源制备细菌纤维素，提升其附加价值，不仅为细菌纤维素的生产提供新途径，而且可以提高茶渣的经济利用价值。

技术实现要素：

为解决上述细菌纤维素生产成本高、茶渣利用率低的问题，本发明提供一种利用茶渣作为碳源制备细菌纤维素的方法，该方法具有原料来源广泛、工艺简单、能耗低、反应迅速等优点；且制备的培养基碳源质量好，价格低，适合于工业生产；在细菌纤维素的应用领域有着良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用茶渣作为碳源制备细菌纤维素的方法，其包括如下具体步骤：

（1）利用茶渣制备发酵液：将茶渣清洗后按照固液比1:10与水混合榨汁，高速打碎得茶渣浆液，添加无机盐，调节pH为4.0-6.0，获得以茶渣浆为主成分的发酵培养基，装入三角瓶中，121 ℃灭菌20-30min，自然冷却到20-30 ℃备用；

（2）茶渣糖化液的制备：在步骤（1）制备的茶渣发酵培养基中接种纤维素降解菌，进行纤维素糖化水解，得到茶渣糖化液；其具体工艺为：将经活化培养的纤维素降解菌接入步骤（1）所述三角瓶中进行糖化水解。

（3）发酵培养基的制备：将上述茶渣糖化液作为培养基碳源，补加氮源和磷源，调节pH为5.0-6.0，配制成发酵培养基，置于三角瓶中，灭菌备用；

（4）发酵制备细菌纤维素：接入细菌纤维素生产菌株的种子液，经过1-3天的振荡培养和3-20天静置培养，制得细菌纤维素。

其中，所述步骤（1）中的茶渣为茶叶加工生产过程中废弃的茶渣。

所述步骤（1）中的无机盐为KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaCl、MgSO₄、ZnSO₄、FeCl₃中的一种或几种。

所述步骤（2）中的纤维素降解菌为噬纤维菌属（Cytophaga）、芽孢杆菌属（Bacillus）、热酸菌属（Acidothermus）、热杆菌属（Caldibacillus），、纤维弧菌属（Cellvlbrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）和欧文菌属（Erwinia）中一种或几种。

所述步骤（2）中的糖化水解条件为30-45℃，摇床转速120~180rpm的条件下糖化水解36-120 h。

所述步骤（3）中的茶渣糖化液首先补加适量氮源和磷源，调节pH，置于三角瓶中，121 ℃灭菌20-30 min，冷却至室温后，接入细菌纤维素生产菌株的种子液，采用先在120-240 rpm转速下动态振荡培养1~3天，再静置培养3~20天的动静结合发酵形式制得细菌纤维素。

所述步骤（3）中的氮源为0.1-1.0 wt%的酵母浸膏和0.1-0.5 wt%的胰蛋白胨；或者为0.1-2.0 wt%的硫酸铵或玉米浆或麦芽汁。

所述步骤（3）中的磷源为0.1-1.0 wt%的0.1-1.0 wt%的KH₂PO₄、K₂HPO₄或NaH₂PO₄或Na₂HPO₄。

所述步骤（4）中培养条件为20-30 ℃，在120-240rpm转速下振荡培养1-3天，再静置培养3-20天。

所述步骤（4）中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属、葡糖酸醋杆菌属、葡萄糖氧化杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属、洋葱假单胞菌属、空肠弯曲菌、木葡糖酸醋杆菌中的一种或几种。

所述步骤（4）中细菌纤维素生产菌株的接种量为 3-15%vol。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明以茶渣为原料，具有价格低廉、来源广泛，预处理水解工艺具有简单、能耗低、水解液糖含量高、反应迅速等优点。茶渣中还含有少量的蛋白质、维生素、矿物质等元素，可以促进BC的合成。

（2）茶渣是一种可再生能源，用于发酵制备细菌纤维素不仅为其资源化利用提供一条有效的路径，而且为细菌纤维素的工业化提供了廉价的新原料。

（3）本发明经处理的茶渣水解液生产的细菌纤维素的原料成本大幅度降低，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1 本发明实施例1对应的细菌纤维素的SEM扫描形貌；

图2 本发明实施例1对应的细菌纤维素的XRD图谱；

图3 本发明实施例1对应的细菌纤维素的FTIR图谱。

具体实施方式

本发明提供一种利用茶渣作为碳源制备细菌纤维素的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.利用茶渣制备发酵液：

首先选取茶渣和水按固液质量比1:10置于榨汁机中，将其高速打碎并搅拌均匀，得到茶渣浆液，添加微量元素，使其最终浓度为： KH₂PO₄ 0.6 g/L、NaCl 1 g/L、MgSO₄ 0.1 g/L、ZnSO₄ 0.25 mg/L、FeCl₃ 0.01 g/L，调节pH至4.0，获得以茶渣汁为主成分的发酵培养基，装入三角瓶中，在121 ℃灭菌20 min，冷却到室温备用。

2.茶渣糖化液的制备：

将噬纤维菌属（Cytophaga）、芽孢杆菌属（Bacillus）、纤维弧菌属（Cellvlbrio）作为纤维素降解菌，将经两级放大培养的纤维素降解菌接入配好料并已灭菌并冷却的三角瓶中，于温度35 ℃，摇床转速120 rpm的发酵条件下糖化水解96 h，制得茶渣糖化液。

3.发酵培养基的制备：

将上述茶渣糖化液作为培养基碳源，补加0.5 wt%的酵母浸膏和0.3 wt%的胰蛋白胨作为氮源以及0.6 wt%的Na₂HPO₄作为磷源；调节pH至5.0，配制成发酵培养基，置于三角瓶中，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后备用。

4．发酵制备细菌纤维素：

将木葡糖酸醋杆菌、土壤杆菌属、醋酸菌属接入液体种子培养基制备细菌纤维素生产菌株的种子液，然后按体积百分比3%的接种量转移到发酵培养基，于20 ℃以180 rpm转速下动态振荡培养3天，再静置培养3天发酵制得细菌纤维素。

实施例2

1.利用茶渣制备发酵液

首先选取茶渣和水按固液质量比1：10置于榨汁机中，将其高速打碎并搅拌均匀，得到茶渣浆液，添加微量元素，使其最终浓度为：0.4 g/L KH₂PO₄、0.8 g/L NaCl、0.2 g/L MgSO₄，调节pH至4.5，获得以茶渣汁为主成分的发酵培养基，装入三角瓶中，在121 ℃灭菌25 min，冷却到室温备用。

2.茶渣糖化液的制备：

将热酸菌属（Acidothermus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和欧文菌属（Erwinia）作为纤维素降解菌，将经两级放大培养的纤维素降解菌接入配好料并已灭菌并冷却的三角瓶中，于温度35 ℃，摇床转速180 rpm的发酵条件下糖化水解72h，制得茶渣糖化液。

3.发酵培养基的制备：

将上述茶渣糖化液作为培养基碳源，补加1.0 wt%的硫酸铵作为氮源和0.5 wt%的K₂HPO₄作为磷源；调节pH至5.5，配制成发酵培养基，置于三角瓶中，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后备用。

4.发酵制备细菌纤维素：

将醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属、葡糖酸醋杆菌属接入液体种子培养基制备细菌纤维素生产菌株的种子液，然后按体积百分比6%的接种量转移到发酵培养基，于30 ℃，150 rpm振荡培养2天后，再静置培养20天发酵制得细菌纤维素。

实施例3

1.利用茶渣制备发酵液

首先选取茶渣和水按固液质量比1：10置于榨汁机中，将其高速打碎并搅拌均匀，得到茶渣浆液，添加微量元素，使其最终浓度为：0.9 g/L KH₂PO₄、1.2 g/L NaCl、0.02g/L FeCl₃调节pH至5.0，获得以茶渣汁为主成分的发酵培养基，装入三角瓶中，在121 ℃灭菌20 min，冷却到室温备用。

2. 茶渣糖化液的制备：

将纤维弧菌属（Cellvlbrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）和欧文菌属（Erwinia）作为纤维素降解菌，将经两级放大培养的纤维素降解菌接入配好料并已灭菌并冷却的三角瓶中，于温度30 ℃，摇床转速150 rpm的发酵条件下糖化水解72 h，制得茶渣糖化液。

3. 发酵培养基的制备：

将上述茶渣糖化液作为培养基碳源，补加0.8 wt%的酵母浸膏和0.5 wt%的胰蛋白胨作为氮源以及0.3 wt%的NaH₂PO₄作为磷源；调节pH至5.0，配制成发酵培养基，置于三角瓶中，121 ℃灭菌25 min，冷却至室温后备用；将葡萄糖氧化杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属接入液体种子培养基制备细菌纤维素生产菌株的种子液，然后按体积百分比9%的接种量转移到发酵培养基，于25 ℃以240 rpm转速下动态振荡培养1天，再静置培养5天发酵制得细菌纤维素。

实施例4

1.利用茶渣制备发酵液：

首先选取茶渣和水按固液质量比1：10置于榨汁机中，将其高速打碎并搅拌均匀，得到茶渣浆液，添加微量元素，使其最终浓度为：0.2 g/L KH₂PO₄、0.6 g/L NaCl、0.3 g/L MgSO₄、0.4 mg/L ZnSO₄、0.03 g/L FeCl₃调节pH至5.5，获得以茶渣汁为主成分的发酵培养基，装入三角瓶中，在121 ℃灭菌30 min，冷却到室温备用。

2. 茶渣糖化液的制备：

将芽孢杆菌属（Bacillus）、热杆菌属（Caldibacillus）、纤维弧菌属（Cellvlbrio）作为纤维素降解菌，将经两级放大培养的纤维素降解菌接入配好料并已灭菌并冷却的三角瓶中，于温度40 ℃，摇床转速150rpm的发酵条件下糖化水解48h，制得茶渣糖化液。

3. 发酵培养基的制备：

将上述茶渣糖化液作为培养基碳源，补加20 wt%的玉米浆作为氮源和0.4 wt%的KH₂PO₄作为磷源；调节pH至6.0，配制成发酵培养基，置于三角瓶中，121 ℃灭菌30 min，冷却至室温后备用。

4.发酵制备细菌纤维素：

将醋酸菌属、木葡糖酸醋杆菌接入液体种子培养基制备细菌纤维素生产菌株的种子液，然后按体积百分比12%的接种量转移到发酵培养基，于22 ℃以180 rpm转速下振荡培养3天，再静置培养15天发酵制得细菌纤维素。

实施例5

1.利用茶渣制备发酵液：

首先选取茶渣和水按固液质量比1：10置于榨汁机中，将其高速打碎并搅拌均匀，得到茶渣浆液，添加微量元素，使其最终浓度为：0.9 g/L KH₂PO₄、1.2 g/L NaCl、0.6 mg/L ZnSO₄、0.05 g/L FeCl₃，调节pH至6.0，获得以茶渣汁为主成分的发酵培养基，装入三角瓶中，在121 ℃灭菌30 min，待其灭菌完成后停止加热，使其自然冷却到室温。

2.茶渣糖化液的制备：

将芽孢杆菌属（Bacillus）、热酸菌属（Acidothermus）、热杆菌属（Caldibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和欧文菌属（Erwinia）作为纤维素降解菌，将经两级放大培养的纤维素降解菌接入配好料并已灭菌并冷却的三角瓶中，于温度45 ℃，摇床转速120 rpm的发酵条件下糖化水解36 h，制得茶渣糖化液。

3.发酵培养基的制备：

将上述茶渣糖化液作为培养基碳源，补加15 wt%的麦芽汁氮作为氮源和0.5 wt%的NaH₂PO₄作为磷源；调节pH至6.0，配制成发酵培养基，置于三角瓶中，121℃灭菌30 min，冷却至室温后备用。

4.发酵制备细菌纤维素：

将土壤杆菌属、空肠弯曲菌、木葡糖酸醋杆菌接入液体种子培养基制备细菌纤维素生产菌株的种子液，然后按体积百分比15%的接种量转移到发酵培养基，于28℃以210 rpm转速下振荡培养2天，再静置培养7天发酵制得细菌纤维素。