水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel2及其应用的制作方法

本发明涉及农作物分子遗传育种学领域，具体地说，涉及水稻抗稻瘟病pi9基因的共显性功能分子标记pi9indel2及其应用。

背景技术：

抗稻瘟病基因pi9是第一个被克隆水稻广谱抗稻瘟病基因(qu等2006，genetics，172(3)：1901-1914)。pi9基因对来自13个国家的43个稻瘟菌生理小种都表现高抗(liu等2002，mol.genet.genomics,267(4):472-480)。pi9基因全长编码序列为8589bp(不含启动子)，含2个内含子和3个外显子(qu等2006)，如序列seqidno.1所示。pi9基因的克隆为设计开发基因内部功能分子标记，并应用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种培育抗病水稻新品种奠定了基础。

目前，已报道的pi9基因的分子标记辅助育种方法主要为：一是利用pi9基因连锁标记进行选择(倪大虎等2005，分子植物育种3:329-334；殷得所等2011，中国水稻科学25(1)：25-30)；二是利用pi9基因内显性功能分子标记(文婷等2012，湖南农业大学学报38:262-266)；三是在pi9基因区域内开发的snp标记(张羽等2015，云南农业大学学报(自然科学版)，30(4)：528-534)；四是利用pi9基因第二个外显子区域的caps标记方法(cn201510062377.4/cn104630364a)；五是利用启动子区域插入/缺失共显性分子标记方法(专利cn201310065310.7/cn103146695a)。

目前，已有不少pi9基因分子标记在mas育种应用。其一是，利用与pi9基因连锁的分子标记进行育种实践，由于连锁标记是基于目的基因侧翼序列所开发的，与目的基因存在一定的遗传距离，在育种选择中由于标记与目的基因存在一定频率的重组，容易造成选择准确性降低，或者增加选择群体数目和工作量。第二是，在pi9基因第一个内含子区域、3’末端utr区域内开发的显性标记虽然能准确的对目的基因进行选择，但该类型标记不能区分区分回交育种后代是杂合体还是纯合体，仅适合在育种早期进行世代选择。第三是，在第二个外显子区域的caps标记虽属共显性标记，但却操作麻烦，需要对pcr产物进行酶切才能有效地检测目的基因。目前，尚未见有关pi9基因第一个内含子区域共显性功能分子标记的报道。此外，对于不同遗传背景材料需要选择不同的共显性分子标记，目前可供有效利用的共显性标记数量还甚少。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是开发一种新的水稻抗稻瘟病基因pi9共显性功能分子标记，应用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种，快速培育广谱高抗稻瘟病水稻新品种。

本发明针对已克隆的pi9基因第一个内含子，开发了一种新的水稻抗稻瘟病基因pi9共显性功能分子标记pi9indel2，在分子标记辅助选择育种中准确鉴定目标个体的基因型，大大提高育种效率。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先利用clustalw序列比对程序，对pi9基因和nbs2-pi2基因核苷酸序列进行比对，比对结果如图1所示。比对发现，pi9基因与nbs2-pi2基因序列比较，pi9基因的核苷酸序列在第一个内含子内的30bp到254bp之间存在3个插入/缺失突变，导致pi9基因在该区段比nbs2-pi2基因缺少101bp的碱基序列，如图1所示。

所述抗稻瘟病基因pi9(genbank登录号：dq285630.1)的核苷酸序列如seqidno.1所示。所述nbs2-pi2基因(genbank登录号：dq352453)为pi9基因的同源基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。pi9与nbs2-pi2基因在核苷酸序列上具有较高的同源性，pi9基因编码区核苷酸序列共有8589个碱基，nbs2-pi2基因编码区核苷酸序列有8748个碱基。

因此，本发明发现了水稻抗稻瘟病pi9基因第一个内含子内的30bp～254bp碱基之间存在3个插入/缺失位点，导致pi9基因与非pi9功能基因在此区段存在101bp碱基的插入/缺失变异。

进一步地，本发明根据pi9与非pi9功能基因30bp～254bp碱基之间的插入/缺失序列差异，设计了pi9基因特异性的共显性分子标记pi9indel2，如图1所示。利用插入/缺失差异序列两端的保守序列作为所发明标记的正反向引物。其中，正向引物pi9indel2-f序列位于pi9基因序列105bp至126bp间，如图1所示，共22个碱基；反向引物pi9indel2-r序列位于pi9基因序列389bp至410bp间，如图1所示，共22个碱基。

图1为本发明方案中pi9基因61bp～499bp核苷酸序列和nbs2-pi2基因61bp～599bp核苷酸序列比对图。其中，“-”部分为两个基因比对插入/缺失差异区域，黑色箭头标注的为pi9indel2标记正反向引物的起始和终止位置，其中pi9indel2-f所在箭头标注的为正向引物序列和位置，pi9indel2-r所在箭头标注的为反向向引物序列和位置。

该分子标记的正反向引物序列为：

正向引物pi9indel2-f序列：5’-gaaggacatctggtacgtactg-3’，如seqidno.3；

反向引物pi9indel2-r序列：5’-gagatggcgtagcgaaggcagc-3’，如seqidno.4。

本发明进一步提供了所述分子标记在检测pi9基因方面的应用，利用seqidno.3和seqidno.4所示的引物对待测目标进行pcr扩增，若扩增后得到长度为306bp的片段，则待测目标含pi9基因；若扩增后得到长度为407bp的片段，则待测目标不含pi9基因。

本发明利用pi9indel2分子标记检测不同遗传背景水稻材料中是否含有pi9基因。通过对不同水稻材料dna进行pcr扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳对dna扩增产物片段进行检测，含pi9基因的水稻材料应得到一条分子量大小与pi9基因供体75-1-127一致的目的条带，扩增dna片段长度为306bp，如图2样本1泳道检测条带所示；而不含pi9基因的水稻材料pcr扩增dna片段长度则为407bp，如图2样本2-19泳道检测条带所示。

本发明还提供了所述分子标记在选育杂交育种后代中pi9基因纯合体方面的应用，利用seqidno.3和seqidno.4所示的引物对待测目标进行pcr扩增，若扩增后仅得到长度为306bp的片段，则待测目标为含有pi9基因的纯合子；若扩增后仅得到长度为407bp的片段，则待测目标为不含pi9基因的纯合子；若扩增后得到长度为306bp和407bp的两个片段，则待测目标为含有pi9基因的杂合子。

即本发明所述的pi9indel2分子标记不但可以对pi9基因进行特异性的检测，判断不同遗传背景水稻亲本材料中是否含有pi9基因，而且可利用其进行pi9基因分子标记辅助选择改良水稻稻瘟病抗性，利用pi9indel2标记引物对杂交或回交后代进行快速pcr检测，判断pi9基因是否导入杂交后代中，以及杂交后代中pi9基因是否已是纯合状态。

进一步地，由seqidno.3和seqidno.4所示的引物组成的引物组合，以及含有所述引物组合的试剂或试剂盒、pcr反应体系及热循环参数也属于本发明的保护范围。

基于前述发明构思，本发明还提供了检测水稻抗稻瘟病pi9基因的方法，以及选育杂交育种后代中pi9基因纯合体的方法。

进一步地，本发明对前述pcr扩增的反应体系及反应条件进行了进一步优化。

优化后的pcr扩增反应体系如下：

优化后的pcr扩增反应条件为：94℃变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，扩增35个循环；72℃延伸7min。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明开发了一种水稻抗稻瘟病基因pi9共显性功能分子标记及其应用。本发明发现pi9基因第一个内含子内第30bp～254bp碱基间与其它非pi9功能基因间存在101bp碱基的插入/缺失变异，根据该插入/缺失变异开发了pi9基因的共显性功能分子标记pi9indel2及应用方法，具体步骤如下：利用pi9indel2标记引物，对不同遗传背景水稻亲本基因组dna、及其与pi9基因供体亲本的杂交后代基因组dna进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定不同水稻亲本及杂交后代中是否含有pi9功能基因，以及杂交育种选育后代中的pi9基因是否纯合。本发明可准确鉴定不同遗传背景水稻亲本及杂交后代中是否含有pi9基因以及该基因位点是否已经纯合，适用于pi9功能基因的检测和利用分子标记辅助选择育种方法快速培育抗稻瘟病水稻新品种。

附图说明

图1为本发明pi9与nbs2-pi2基因序列比对图。

图2为本发明实施例1中pi9indel2标记多态性检测。

图3为本发明实施例2中pi9indel2标记对杂交种f1代的分子检测。

图4为本发明实施例3中pi9indel2标记检测回交自交群体中pi9基因纯合子。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1利用pi9indel2标记检测不同遗传背景水稻亲本中是否含有pi9基因

供试材料：pi9基因供体材料75-1-127、23份不同遗传背景水稻亲本材料：gm4、fyb、fya、ii32b、ii32a、co1403、co1404、桃1b、桃1a、p102、p88s、he-88、he-127、he-130、he-159、he-160、黄华占、玉针香、玉晶软占、马坝银占、16hz-164、16h凡、r288。

所需试剂：10×pcr缓冲液(含mg2⁺)、dntps、pi9indel2-f正向引物、pi9indel2-r反向引物、taqdna聚合酶、水稻基因组dna模板、ddh2o。

实验程序：分别以供试水稻材料基因组dna为模板，配置10μlpcr反应体系，然后进行pcr扩增，扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果如图2所示。

图2为本发明实例1中利用pi9indel2标记在不同遗传背景水稻亲本中检测pi9基因及标记多态性分析pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，m为dnamarker，左侧标注为对应dnamarker标记条带分子量大小；各泳道分别为：1：75-1-127；2：gm4；3：fyb；4：fya；5：ii32b；6：ii32a；7：co1403；8：co1404；9：桃1b；10：桃1a；11：p102；12：p88s；13：he-88；14：he-127；15：he-130；16：he-159；17：he-160；18：黄华占；19：玉针香；20：玉晶软占；21：马坝银占；22：16hz-164；23：16h凡；24：r288。

其中，pcr反应体系配置为：

上述pcr扩增反应条件为：94℃变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，扩增35个循环；72℃延伸7min。

实施例2利用pi9indel2标记检测杂交种f1代中pi9目的基因

供试材料：pi9基因供体材料75-1-127、1份与75-1-127遗传背景不同的水稻亲本材料15s002、及其以75-1-127作为供体亲本杂交获得的10个f1代群体。

所需试剂：同实例1。

实验程序：分别以各供试水稻材料基因组dna为模板，配置10μlpcr反应体系，然后进行pcr扩增，扩增产物用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr反应体系配置和pcr反应条件同实例1。实验结果如图3所示。

图3为本发明实例2中利用pi9indel2标记检测杂交种f1代中，pi9基因的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，m为dnamarker标记，左侧标注为对应dnamarker条带分子量大小；各泳道分别为：1：75-1-127；2：15s002；3-12：15s002/75-1-127f1株系，其中仅9泳道为不含有pi9基因的纯合子(即为假杂种)，其余为含有pi9基因的杂合子。

实施例3利用pi9indel2标记检测回交自交育种群体中pi9基因纯合状态

供试材料：pi9基因供体材料75-1-127、1份不含pi9基因的水稻亲本材料lh422和10份该亲本材料与75-1-127杂交后的bc6f2代回交自交分离群体株系。

所需试剂：同实例1。

实验程序：分别以各供试水稻材料基因组dna为模板，配置10μlpcr反应体系，然后进行pcr扩增，扩增产物用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr反应体系配置和pcr反应条件同实例1。实验结果如图4所示。

图4为本发明实例3中利用pi9indel2标记检测bc6f2代回交自交育种群体中，pi9基因纯合状态的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，m为dnamarker，左侧标注为对应dnamarker条带分子量大小；各泳道分别为：1：75-1-127；2：lh422；3-12：lh422/75-1-127bc6f2株系，其中4、7、8均为含有pi9基因的纯合子，10为不含有pi9基因的纯合子，其余为杂合子。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>水稻抗稻瘟病pi9基因的共显性功能分子标记pi9indel2及其应用

<130>khp171111046.2

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8589

<212>dna

<213>pi9

<400>1

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