本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体而言，涉及一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶。
背景技术：
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。凝血酶是由在凝血酶原复合物中的非活性凝血酶原在xa因子(fxa)因子的作用下通过蛋白裂解的方式产生。当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定而在血栓性疾病的引发和传播上有着核心作用。
目前，国内外主要以动物血浆例如牛血浆为原料制备凝血酶(牛凝血酶)，也有报道从鲑鱼和鸵鸟血浆中制备凝血酶。其提取的方法主要有等电点沉淀法和氢氧化镁沉淀法。但现有的方法所提取的凝血酶对工艺设备条件要求高、并存在凝血酶的收率低、活性低等问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种牛凝血酶的制备方法，该方法以牛血浆为原料，采用柠檬酸钡吸附法提取出牛凝血酶，其具有较高的收率，所提取的牛凝血酶比活高。
本发明的另一目的在于提供一种牛凝血酶，由上述的制备方法所制得，该牛凝血酶具有纯度和比活高的特性。
本发明是这样实现的：
一种牛凝血酶的制备方法，其包括：
往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入bacl2溶液，离心、收集沉淀；其中，bacl2溶液浓度为0.8-1.1mol/l，bacl2溶液与所述抗凝牛血浆的体积比为(5-7)：50。
一种牛凝血酶，其根据上述牛凝血酶的制备方法所制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的提供的牛凝血酶的制备方法，该制备方法以含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆为原料，加入bacl2溶液沉淀后，通过采用柠檬酸钡吸附法，把依赖于维生素k的凝血因子沉淀下来，同时除去了与牛凝血酶作用的底物，降低牛凝血酶总活性的损失，提高了牛凝血酶的比活；采用本发明制备方法所制备的牛凝血酶的比活为6.34u/mg，提取率为65.15％，采用本发明提供的制备方法可以大规模制备高活力及高收率的牛凝血酶。设备要求简单、适合大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的牛凝血酶溶液的sds-page分析结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种牛凝血酶的制备方法和牛凝血酶进行具体说明。
一方面，本发明提供的一种牛凝血酶的制备方法，其包括如下步骤：
s1血液分离
取新鲜牛血液，加入柠檬酸钠抗凝，利用血球分离机进行分离，去除血细胞，取牛血桨。
其中，柠檬酸钠在牛血液中的终浓度优选为3.7-3.9％，优选为3.8％(m:v)。
s2沉淀
往含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆中加入bacl2溶液，离心、收集沉淀；其中，bacl2溶液浓度为0.8-1.1mol/l，bacl2溶液与上述抗凝牛血浆的体积比为(5-7)：50。
优选地，bacl2溶液浓度为1mol/l，bacl2溶液与上述抗凝牛血浆的体积比为6：50。
s3溶解
用edta溶液溶解上述沉淀，离心、取上清液。
优选地，edta溶液浓度为0.18-0.22mol/l、ph为7.8-8.2。
更优选地，edta溶液浓度为0.2mol/l、ph为8.0。
s4透析
上清液用tris-hcl缓冲液透析，得到牛凝血酶酶原液。
优选地，tris-hcl缓冲液浓度为0.048-0.052mol/l、ph为7.1-7.3。
更优选地，tris-hcl缓冲液浓度为0.05mol/l、ph为7.2。
s5激活
牛凝血酶酶原液经激活处理后、得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
优选地，往上述牛凝血酶酶原液中加入终浓度为0.009-0.012mol/l的ca2+，在26-28℃下激活1.9-2.0h。
优选地，往上述牛凝血酶酶原液中加入终浓度为0.01mol/l的ca2+，在27℃下激活1.95h。
采用柠檬酸钡吸附法所得的凝血酶总活性、比活均比常规的等电点沉淀法和氢氧化镁沉淀法高。因为，血浆中大部分蛋白质是酸性蛋白，凝血酶原在等电点沉淀时其他的杂蛋白(包括部分纤维蛋白原)也一同沉淀下来，凝血酶的活性损失较大。
柠檬酸钡吸附凝血酶原具有一定的选择性，只是把依赖于维生素k的凝血因子沉淀下来，同时除去了与凝血酶作用的底物，降低凝血酶总活性的损失，提高了凝血酶的比活。
本发明提供的牛凝血酶的制备方法，可以大规模制备高活力及高收率的牛凝血酶。该制备方法对设备要求简单、适合大规模生产，制备技术达到国内先进水平，为国内凝血酶制备提供先进的技术支持。
采用本发明所提供的制备方法提取牛血中的牛凝血酶，激活后的牛凝血酶的比活为6.34u/mg，提取率为：65.15％。
进一步地，为了得到精制的牛凝血酶，上述制备方法还可包括：
s6纯化
将上述牛凝血酶粗酶液经浓缩处理后，用deae柱层析进行纯化，得到精制的牛凝血酶溶液。
其中，浓缩处理为：用截留分子量为10kd的超滤离心管进行浓缩处理。
deae柱层析进行纯化包括：
洗脱步骤：经过浓缩处理后的牛凝血酶粗酶液用0-1mol/lnacl溶液线性洗脱，控制流速为0.8-1.1ml/3min，收集洗脱液，上述洗脱液经脱盐处理后得到上述牛凝血酶溶液。
优选地，控制流速为1ml/3min。
优选地，a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相进行20cv的梯度洗脱。
其中，脱盐处理包括：用0.048-0.052mol/l、ph为7.1-7.3的tris-hcl对上述洗脱液进行脱盐换液，得到上述牛凝血酶溶液。
优选地，用0.05mol/l、ph为7.2的tris-hcl进行脱盐换液。
通过上述纯化后，对牛凝血酶粗酶液进行纯化，纯化倍数16.52，回收率76.21％。
经纯度鉴定，电泳条带呈单一条带，已达到电泳纯，所提取的牛凝血酶的分子量约为37kd。
进一步地，为了使所得到牛凝血酶便于储存或运输，上述制备方法还可包括：
s7冻干
将上述牛凝血酶溶液进行冻干处理，得到牛凝血酶冻干粉。
另一方面，本发明还提供一种牛凝血酶，其有上述牛凝血酶的制备方法所制得。
另一方面，本发明还提供一种牛凝血酶制品，其含有上述牛凝血酶。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的牛凝血酶的制备方法，其具体步骤如下。
1.1血液分离
取新鲜牛血液，加入柠檬酸钠抗凝，柠檬酸钠在牛血液中的终浓度为3.8％，利用血球分离机进行分离，去除血细胞，取牛血桨。
1.2沉淀
1.2.1往上述100ml抗凝牛血浆中加入1mol/lbacl2溶液，bacl2溶液的加入量为牛血浆12％，即bacl2溶液与抗凝牛血浆的体积比为6:50。
1.2.2磁力搅拌1h后，于4000r/min的转速下离心15min，收集沉淀(柠檬酸钡沉淀)。
1.3溶解
用0.2mol/l、ph为8.0的edta溶液溶解上述沉淀，搅拌1h，4000r/min、离心15min，弃去不溶物，取上清液。
1.4透析
上清液用0.05mol/l、ph为7.2的tris-hcl缓冲液透析，不断更换透析液，至无ba2+为止，得到牛凝血酶酶原液。
1.5激活
牛凝血酶酶原液中加入ca2+，使其终浓度为0.01mol/l，在27℃下激活1.95h，得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
1.6牛凝血酶的酶活性检测
(1)酶标准品溶液：取凝血酶标准品，用0.9％nacl溶解，分别定量稀释成每毫升含5u、6.4u、8u和10u的酶标准品溶液。
(2)纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原标准品，根据标准品中所含凝固物的含量，用0.9％nacl溶解配置成含1mg/ml可凝固物的溶液。
(3)标准曲线的绘制：取内径1cm的试管4支，各准确加入0.9ml纤维蛋白原溶液，37℃的水浴中保存5min，吸取上述不同浓度的酶标准品溶液各0.1ml，迅速加入到各试管中，立即记时、摇匀，在37℃的水浴中观察纤维蛋白原的初凝时间，每种浓度测5次，求平均值(当最大值与最小值之差超过平均值的10％时重测)。酶标准品溶液的浓度应控制凝结时间在14-60s为宜。以标准品酶活单位为横坐标，凝结时间为纵坐标绘制标准曲线。
(4)样品酶活的测定：准确吸取待测样品0.1ml，按上述方法测定初凝时间，通过标准曲线计算待测样品的酶活(单位为u/ml)。
(5)比活的计算方法：牛凝血酶粗酶液的酶活(u/ml)与蛋白浓度(mg/ml)的比值；提取率的计算方法：牛凝血酶粗酶液的总活力与牛血液的总活力的比值，其中，总活力＝酶活(u/ml)×总体积(ml)。
经检测，激活后的牛凝血酶粗酶液的比活为6.34u/mg，提取率为65.15％。
为了得到精制的牛凝血酶，在上述步骤的基础，用deae柱层析进行纯化，操作如下。
1.6纯化
1.6.1deae-52的预处理
称取一定量deae-52(whatman公司)与10ml量筒中，用蒸馏水浸泡12h，观察溶胀后的体积，根据层析柱柱床体积计算试验中deae-52用量。
准确称取4gdeae-52纤维素用蒸馏水浸泡12h，期间多次换水以除去表面漂浮颗粒。布氏漏斗抽干，置于0.5mol/lhcl溶液中浸泡1h，离子水多次漂洗使其ph至中性；再置于0.5mol/lnaoh溶液中浸泡1h，离子水多次漂洗使其ph至中性。处理完毕后保存备用。
1.6.2装柱
取清洗干净的层析柱(xk16(16mm*20mm)，ge公司)，垂直固定到铁架台上，打开层析柱下出液口，取备用的edae-52，混匀后分多次缓慢倒入层析柱内，使其自然沉降，待柱高达试验要求后停止装柱。注意层析柱不能出现截面和气泡，要保证填料的的致密均匀，否则，重新装柱。
1.6.3平衡
打开恒流泵，用3-5倍柱床体积0.05mol/l、ph7.2的tris-hcl缓冲液平衡层析柱，控制流速为1ml/3min。
1.6.4上样
将上述牛凝血酶粗酶液经截留分子量为10kd的超滤离心管进行浓缩处理。
打开层析柱下出液口，待柱内液面高度为1mm时，将浓缩后的牛凝血酶粗酶液沿层析柱四周环绕注入，待酶液达一定高度后再与柱中间小心加样，上样量不宜过大，一般控制在柱床体积的1％-5％(体积分数)。样液全部进入层析柱后，用2-3倍柱床体0.05mol/lph7.2的tris-hcl缓冲液过柱，洗出未被吸附物质。
1.6.5洗脱
洗脱步骤：用0-1mol/lnacl(0.05mol/lph7.2的tris-hcl)溶液线性洗脱，控制流速为1ml/3min，收集洗脱液。
a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相进行20cv的梯度洗脱。
1.6.6脱盐
洗脱液经10kd的超滤膜包0.05mol/lph7.2的tris-hcl进行脱盐换液，得到精制的牛凝血酶溶液。
1.6.7检测精制的牛凝血酶溶液的酶活。
纯化倍数的计算方法：牛凝血酶溶液的比活与牛凝血酶粗酶液的比活的比值；回收率的计算方法：牛凝血酶溶液的总活力与牛凝血酶粗酶液的总活力的比值。
通过上述纯化后，对牛凝血酶粗酶液进行纯化，纯化倍数16.52，回收率76.21％。经纯度鉴定，电泳条带呈单一条带(如图1所示，图中：m为maker，1为牛凝血酶粗酶液，2为纯化后的牛凝血酶溶液)，已达到电泳纯，所提取的牛凝血酶的分子量约为37kd。
进一步地，为了使所得到牛凝血酶便于储存或运输，在上述步骤的基础上，本实施例提供的制备方法还包括：
1.7冻干
将上述牛凝血酶溶液放入冻干机(scientz-50nd，宁波新芝公司)进行冻干，得到牛凝血酶冻干粉。
实施例2
本实施例提供的牛凝血酶的制备方法，其具体步骤如下。
2.1血液分离
(同实施例1)。
2.2沉淀
2.2.1取100ml抗凝牛血浆，加入0.8mol/lbacl2溶液，bacl2溶液的加入量为牛血浆10％，即bacl2溶液与抗凝牛血浆的体积比为5:50。
2.2.2离心(同实施例1)，收集沉淀；
2.3溶解
用0.18mol/l、ph为7.8的edta溶液溶解上述沉淀，搅拌1h，4000r/min、离心15min，弃去不溶物，取上清液。
2.4透析
上清液用0.048mol/l、ph为7.1的tris-hcl缓冲液透析，不断更换透析液，至无ba2+为止，得到牛凝血酶酶原液。
2.5激活
牛凝血酶酶原液中加入ca2+，使其终浓度为0.009mol/l，在26℃下激活1.9h，得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
2.6纯化
2.6.1deae-52的预处理
(同实施例1).
2.6.2装柱
(同实施例1)。
2.6.3平衡
(同实施例1)。
2.6.4上样2
(实施例1)
2.6.5洗脱
洗脱步骤：用0-1mol/lnacl(0.05mol/lph7.2的tris-hcl)溶液线性洗脱，控制流速为0.8ml/3min，收集洗脱液。
a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相进行20cv的梯度洗脱。
2.6.6脱盐
洗脱液经10kd的超滤膜包0.048mol/lph7.1的tris-hcl进行脱盐换液，得到精制的牛凝血酶溶液。
2.7冻干
将上述牛凝血酶溶液放入冻干机进行冻干，得到牛凝血酶冻干粉。
实施例3
本实施例提供的牛凝血酶的制备方法，其具体步骤如下。
3.1血液分离
(同实施例1)。
3.2沉淀
3.2.1取100ml抗凝牛血浆，加入1.1mol/lbacl2溶液，bacl2溶液的加入量为牛血浆14％，即bacl2溶液与抗凝牛血浆的体积比为7:50。
3.2.2离心(同实施例1)，收集沉淀；
3.3溶解
用0.22mol/l、ph为8.2的edta溶液溶解上述沉淀，搅拌1h，4000r/min、离心15min，弃去不溶物，取上清液。
3.4透析
上清液用0.052mol/l、ph为7.3的tris-hcl缓冲液透析，不断更换透析液，至无ba2+为止，得到牛凝血酶酶原液。
3.5激活
牛凝血酶酶原液中加入ca2+，使其终浓度为0.012mol/l，在28℃下激活2.0h，得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
3.6纯化
3.6.1deae-52的预处理
(同实施例1).
3.6.2装柱
(同实施例1)。
3.6.3平衡
(同实施例1)。
3.6.4上样
(实施例1)
3.6.5洗脱
洗脱步骤：用0-1mol/lnacl(0.05mol/lph7.2的tris-hcl)溶液线性洗脱，控制流速为1.1ml/3min，收集洗脱液。
a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相进行20cv的梯度洗脱。
3.6.6脱盐
洗脱液经10kd的超滤膜包0.052mol/lph7.3的tris-hcl进行脱盐换液，得到精制的牛凝血酶溶液。
3.7冻干
将上述牛凝血酶溶液放入冻干机进行冻干，得到牛凝血酶冻干粉。
综上，本发明的提供的牛凝血酶的制备方法，该制备方法以含有柠檬酸钠的抗凝牛血浆为原料，加入bacl2溶液沉淀后，通过采用柠檬酸钡吸附法，把依赖于维生素k的凝血因子沉淀下来，同时除去了与牛凝血酶作用的底物，降低牛凝血酶总活性的损失，提高了牛凝血酶的比活；采用本发明制备方法所制备的牛凝血酶的比活为6.34u/mg，提取率为：65.15％，纯化后的回收率可达76.21％，纯化倍数16.52，采用本发明提供的制备方法可以大规模制备高活力及高收率的牛凝血酶。设备要求简单、适合大规模生产。该制备方法达到国内先进水平，为国内凝血酶制备提供先进的技术支持。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。