一种α螺旋抗菌肽RL及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种α螺旋抗菌肽rl及其制备方法和应用。

背景技术：

目前，抗生素的过分使用，导致病原微生物产生耐药性，甚至造成畜禽产品中的药物残留，严重影响畜禽的健康状况、产品质量以及其安全性，从而威胁到人类的健康。抗菌肽(antimicrobialpeptides,amps)，又称抗微生物肽或肽抗生素，是由生物体特定基因编码产生的一类能够抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞的小分子多肽，生物体天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽的生物学特性主要有三点：一、广谱抗菌性。多数抗菌肽可以杀灭包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在内的多种细菌。二、抗菌肽的作用不涉及特定的受体。传统的抗生素主要是与细菌胞膜或胞内特异的受体结合，受体类型有限，细菌容易通过变异而产生耐药性，而抗菌肽的杀菌机制是通过正负电荷吸引与微生物细胞膜直接作用，改变其通透性，导致细胞内容物外渗，仅仅是阴阳离子的物理作用，所以不易产生耐药性。三、抗菌肽具有高度的水溶性、热稳定性、盐离子稳定性。

然而，由于天然抗菌肽分子量小，在机体内含量甚微，分离提纯困难，故天然产量非常有限。并且天然抗菌肽(例如蜂毒素和天蚕素)的治疗指数不高，对机体细胞毒性较大。利用传统方法提取天然抗菌肽面临抗菌效果不佳或细胞毒性过大等问题，需要采取全新的方法来解决。越来越多的临床报道，外来同源性天然抗菌肽或天然抗菌肽衍生物的大量使用会危害机体自身免疫系统，从而引起严重的公共健康问题。所以利用生物工程手段全新设计具有高效抗菌活性，细胞选择性和免疫活性的的抗菌肽成为一条有效途径，在丰富抗菌肽家族的同时，也为新型抗菌肽制剂研制和开发开辟新道路。

技术实现要素：

基于以上不足之处，本发明提供一种α螺旋抗菌肽rl及其制备方法和应用，该抗菌肽对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌具有高效的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。

本发明所采用的技术如下：一种α螺旋抗菌肽rl，序列如seqidno.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种α螺旋抗菌肽rl的制备方法如下：

(1)以非完美两亲性α螺旋多肽折叠原则为基础，设计出含转角单元的非完美两亲性α螺旋肽模板ac-wxkywxzzykxwyk-nh2，x为正电荷氨基酸，y为疏水性氨基酸，zz为转角单元，当x＝r，y＝l，zz＝^dpg时，抗菌肽命名为rl，序列如seqno.1所示；

(2)将抗菌肽rl采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过tfa切割后，得到多肽；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成多肽的制备。

2、如上所述的一种α螺旋抗菌肽rl，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

通过本制备方法技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现rl不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌，枯草芽孢杆菌七种菌种有高效的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。综上所述，rl是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽rl的质谱图；

图2为抗菌肽rlα的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

抗菌肽rl的氨基酸序列为：

以非完美两亲性α螺旋多肽折叠原则为基础，设计出含转角单元的非完美两亲性α螺旋肽模板ac-wxkywxzzykxwyk-nh2，x为正电荷氨基酸，y为疏水性氨基酸，zz为转角单元，当x＝r，y＝l，zz＝^dpg时，抗菌肽命名为rl；当^dpg转角被破坏时，抗菌肽命名为rlα。抗菌肽的序列如表1所示。

表1衍生肽的氨基酸序列

rl和rlα的电荷数为均为+7，疏水值为-0.469。将两条肽的c端酰胺化以提高一个正电荷，n端乙酰化以增加肽的稳定性。该方法使两条肽具有高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性，提高抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，具有成为抗生素替代物的发展潜力。

实施例2

固相化学合成法合成rl和rlα两条抗菌肽

1、抗菌肽的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将fmoc-x(x是每个抗菌肽的c端第一个氨基酸)接入到wang树脂，然后脱去fmoc基团后得到x-wang树脂；再将fmoc-y-trt-oh(9-芴甲氧羧基-三甲基-y，y为每个抗菌肽c端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从c端合成到n端，直至合成完毕，得到脱去fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀tfa(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由tfa、水和tis(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3

抗菌肽抗菌活性的测定

1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％bsa)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(od492nm)处测定光吸收值，,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性

通过表2可以看出，rl和rlα对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较高的抑菌活性，并且rlα抑菌活性略高于rl，但不明显。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1ml，肝素抗凝后溶解到2mlpbs溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用pbs洗涤3遍，再用10mlpbs重悬；取50μl红细胞悬液与50μl用pbs溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μlpbs作为阴性对照；50μl红细胞加50μl0.1％tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

通过表3可以看出，rl在检测范围内未表现出溶血活性，而rlα在128μm浓度时表现出溶血活性。

以上结果显示，在非完美两亲性α螺旋抗菌肽中插入^dpg转角，可以提高细胞选择性。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度几何平均数的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，rl具有较高的治疗指数，表明设计得到的rl抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。

＜110＞东北农业大学

＜120＞一种α螺旋抗菌肽rl及其制备方法和应用

＜160＞2

＜210＞1

＜211＞14

＜212＞prt

＜213＞人工序列

＜400＞1

ac-trparglysleutrpargdproglyleulysargtrpleulys-nh2

151014

＜210＞2

＜211＞14

＜212＞prt

＜213＞人工序列

＜400＞2

ac-glytrparglysleutrpargleulysargtrpleulysdpro-nh2

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