基于转录组测序技术用于早期肝癌诊断和预后评估的基因群及其应用的制作方法

文档序号:11506452阅读:535来源:国知局
基于转录组测序技术用于早期肝癌诊断和预后评估的基因群及其应用的制造方法与工艺

本发明属于生物技术领域,具体涉及基于转录组测序技术的用于肝癌早期诊断及预后评估的基因群及其应用。



背景技术:

原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc,简称肝癌)是恶性程度最高的肿瘤这一,其发病率居全球肿瘤的第6位,病死率居第3位。以手术为主的综合治疗模式对肝癌的治疗取得了显著成效,但是由于肝癌患者在发现时经常已处于中晚期且伴有不同程度的肝硬化,手术切除率低,复发率高,预后差。目前蛋白质类血清标志物筛查及影像学诊断时检测肝癌患者术后或化疗后残瘤、复发和转移病灶的主要手段,但二者均存在灵敏度及特异性不足的问题。根据研究资料显示,用于肝癌诊断的重要血清标志物afp的假阳性率高达40%,尤其是用于早期诊断或者直径小于3cm的肝癌时。由于afp也是胎儿血清中的正常成分,是胚胎发育过程中维持正常妊娠所必需的蛋白,所以孕妇也会出现一过性的afp阳性;此外部分胚胎癌,如睾丸、卵巢、骶尾部及后腹膜畸胎瘤等也会导致afp的明显升高。即afp也不是早期肝癌的特异性血清标志物。b超对肝癌性病变检查的敏感性约为90%,特异性约为50%-70%;核磁共振对于小于1cm病灶的检出率为55%,1-2cm病灶的检出率为70%,2-3cm病灶的检出率约为82%。尤其蛋白质类血清标志物的灵敏度和特异性较差,存在在血液中的半衰期较长,其浓度水平与病变程度相关性较差等问题。且在临床诊疗过程中发现,根据术前影像学资料、血生化肿瘤标志物表达水平及既往史等,仍有一部分患者被诊断为原发性肝癌,然而患者术后病理诊断为局灶性结节性增生或者是不典型增生,这给患者治疗带来了痛苦,也是对有限医疗资源的浪费。因此,提高对这部分患者的早期诊断准确率具有重要的临床意义。

作为目前研究热点的基因二代测序技术,在早期肝癌的诊断、筛查中有着巨大的应用前景。然而,目前针对肝癌早期诊断的试剂盒灵敏度不高、特异性不强的问题,使得该技术的临床应用明显受阻。因此,对与原发性肝癌发生相关基因的有效筛选和组合以提高早期原发性肝癌的诊断率,是解决问题的有效方法之一。

大量基础研究表明,原发性肝癌的发生与多种基因的突变等因素有密切关系,如n-ras、c-myc、igf-2、c-fms、mxr7、egfr、kras、braf、pik3ca、alk、ddr2、pdgfra、nras、kit、erbb2、ret、flt3、dnmt3a、npm1、smo、abl1、tsc1及p53等。因此,通过检测患者血液中这类基因的表达水平,对提高诊断准确率有重要价值。



技术实现要素:

本发明针对目前二代测序试剂盒敏感性和特异性不高的问题进行有效的基因筛选和组合,用二代基因测序技术筛选出与原发性肝癌诊断关联较强的基因群,可明显提高早期原发性肝癌的诊断,降低误诊率,同时用于患者的预后评价。

本发明提供了一组基于二代测序技术的用于原发性肝癌诊断及预后评估的基因群,包括gpc3(glypican3)、hsp70(heatshockprotein70)、gs(glutaminesynthetase)和pivka-ⅱ(proteininducedbyvitaminkabsence)这4个基因,以及根据该基因群的表达量计算复发风险值(rs值)的算法用于原发性肝癌的早期诊断和预后评估。

所述基因gpc3的cdna序列如seq.no.1所示;基因hsp70的cdna序列如seq.no.2所示;基因gs的cdna序列如seq.no.3所示;基因pivka-ⅱ的cdna序列如seq.no.4所示;基因gapdh的cdna序列如seq.no.5所示;所述基因actb的cdna序列如seq.no.6所示。

所述gpc3的qpcr引物序列为:

seq.no.7:gpc3-f:aggaaagctgaccaccactg

seq.no.8:gpc3-r:gccaatctgtaagtctagccc

所述hsp70的qpcr引物序列为:

seq.no.9:hsp70-f:tggtggtgctacacgaatcc

seq.no.10:hsp70-r:aagcaggcgataagatggca

所述gs的qpcr引物序列为:

seq.no.11:gs-f:cttctgcaggaggactcaaca

seq.no.12:gs-r:tccgtttctcccacttcagtt

所述pivka-ⅱ的qpcr引物序列为:

seq.no.13:pivka-ⅱ-f:ggacaggacagcatcctcaat

seq.no.14:pivka-ⅱ-r:tccgcaggcaacctaacaat

所述gapdh的qpcr引物序列为:

seq.no.15:gapdh-f:tccaaaatcaagtggggcga

seq.no.16:gapdh-r:aaatgagccccagccttctc

所述actb的qpcr引物序列为:

seq.no.17:actb-f:gggcatgggtcagaaggatt

seq.no.18:actb-r:tcgatggggtacttcagggt。

用于肝癌早期诊断及预后评估的试剂盒,所述试剂盒中包括用于检测待测患者的离体样本中基因群中各个基因的表达量的试剂,所述基因群是由gpc3(glypican3)、hsp70(heatshockprotein70)、gs(glutaminesynthetase)和pivka-ⅱ(proteininducedbyvitaminkabsence)4个基因组成的基因群;根据基因群中4个基因的表达量计算复发风险值,根据复发风险值对待测患者做出是否为早期肝癌以及判断肝癌患者预后复发率。

所述的表达量计算复发风险值的算法为:rs=0.080×gp3+0.098×hsp70+0.047×gs+0.13×pivka-ⅱ。

复发风险值小于3分的,建议不判断为原发性肝癌,大于及等于3分的建议判断为原发性肝癌;得分大于3分小于12分的复发风险较低,得分大于等于12分小于27分的复发风险为中等,得分大于等于27分的复发风险较高。

所述的基因群或试剂盒在制备预测或辅助预测早期肝癌或者肝癌患者预后复发率的产品中的应用。

所述的基因群作为标志物在制备预测或辅助预测早期肝癌或者肝癌患者预后复发率的产品中的应用。

本发明提供的用于肝癌早期诊断及预后评估的试剂盒,包括总rna抽提试剂、逆转录试剂、分别检测四个基因的四对引物和qpcr反应液。

其中,所述总rna抽提试剂为本领域常规的总rna抽提试剂,例如可以是trizol总rna提取试剂,或者柱式rna提取试剂盒等。

所述的逆转录试剂是本领域常规的逆转录试剂,较佳地包括dntp溶液和rna逆转录酶。

所述的pcr反应液是本领域常规的pcr反应液,较佳地包括dntp溶液和热启动dna聚合酶。

所述的离体样本为来自检测对象的肝组织离体样本,只要能从检测样本中抽提检测对象的总rna即可。所述检测样本较佳地为手术中切除的或活检取得的离体的新鲜组织或由离体新鲜组织制作的石蜡组织样本,优选地为肿瘤细胞含量高的组织。

上述二代测序试剂为本领域常规使用的试剂,只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述的二代测序试剂较佳地为市售可得。所述的二代测序为本领域常规的二代测序,较佳地为dasl-seq技术。所述的二代测序试剂较佳地还包括可供构建rasl-seq文库的试剂。

采用本发明提供的试剂盒进行肝癌早期诊断和预后评估的检测方法,包括以下步骤:

1)利用本发明所述试剂盒抽提检测对象的总rna(totalrna);

2)将纯化的rna反转录为cdna,然后制成可供二次测序的文库;

3)对步骤2)所得的dna测序文库进行测序即得;

4)将所得测序结果进行数据分析,并得出所述4个基因的表达量;

5)根据4个基因的表达量用算法得出复发风险值(rs值);

6)根据步骤5)所得的rs值,判断待测者是否为原发性肝癌患者,及对预后做出评估。

其中,步骤1)所述的抽提方法为本领域常规方法,较佳地为利用检测试剂盒提取检测对象的新鲜冷冻组织(freshfrozen)或石蜡包埋组织(ffpe)的总rna。更佳地为利用roche公司生产的rna抽提试剂盒来提取(产品号为rochecatalognumber#3270289001)。

其中,步骤2)所述文库的构建方法为本领域常规的文库构建方法,所述文库的构建方法较佳地包括以下步骤:

将抽提的总rna反转录生成cdna文库。末端补平并进行5’端磷酸化,将30uldna、45ul纯水、10ul具有10mmatp的t4dna连接酶缓冲液、4ul包含10mmdntpmix、5ult4dna聚合酶、1ulklenow酶、5ult4连接酶混合后,在20℃温浴30分钟(试剂来自illumina样本准备试剂盒pe-102-1001),温浴后采用qiagenqiaquickpcr纯化试剂盒(part#28104)纯化dna。末端悬液a:将上步的产物溶解在32ul缓冲液中,加入klenow缓冲液5ul,1mmdatp10ul、klenowexo3ul,在37℃保持30分钟(试剂来自illumina样本准备试剂盒),产物由qiagenminelutepcr纯化试剂盒(part#28004)连接:dna溶解在10ul缓冲液中,加入dna连接酶缓冲液2×25ul、peadaptoroligomix10ul、dna连接酶5ul,在20℃保持15分钟(试剂为illumina样本准备试剂盒pe-102-1001),温浴后采用qiagenqiaquickpcr纯化试剂盒(part#28104)纯化dna即得文库。

其中,步骤3)所述测序的方法为本领域常规的测序方法,较佳地为利用illunimamiseq测序仪进行二代基因测序。根据步骤2)所制备的文库的不同,可以对所得基因序列进行二次测序。较佳地,所述二次测序为dasl-seq技术,用illuminamiseq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。

其中步骤4)所述的数据分析,采用常规的fpkm标准化公式进行归化,得到所述4个基因的表达量。

其中步骤5)所述的复发风险值(rs值)算法为:rs=0.0080×gp3+0.0098×hsp70+0.0047×gs+0.013×pivka-ⅱ

根据步骤5)所述的复发风险值(rs值),对待测患者做如下判断和预后评估:小于3分的,建议不判断为原发性肝癌,大于及等于3分的建议判断为原发性肝癌;得分大于3分小于12分的复发风险较低,得分大于等于12分小于27分的复发风险为中等,得分大于等于27分的复发风险较高。

本发明中,我们发现基于二代测序技术检测gpc3(glypican3)、hsp70(heatshockprotein70)、gs(glutaminesynthetase)和pivka-ⅱ(proteininducedbyvitaminkabsence)这4个基因的表达,对诊断原发性肝癌有较高的灵敏度和特异度,同时与患者的预后也有明显的相关性。

有益效果:与目前已有的二代测序技术相比,本发明首次利用转录组测序的方法,筛选得到与原发性肝癌发生及预后评估相关的基因群组合,并首次公开了根据表达量计算出复发风险值(rs值)的算法进行原发性肝癌早期诊断和预后评估。本发明临床前验证结果确切,对早期原发性肝癌的诊断灵敏性达到100%,对非肝癌的诊断灵敏性达到100%;对低复发风险患者的预测灵敏性达到100%,对中复发风险患者的预测灵敏性达到96.774%,对高复发风险患者预测的灵敏性达到99.375%,提高了检测能力和效率,同时极大降低了检测成本;且可明确提示患者预后。因此,该基因群及基于二代测序技术根据该基因群的表达量计算复发风险值(rs值)的算法用于原发性肝癌的早期诊断和预后评估,敏感度高,特异性强,操作流程简单,成本较低,在早期原发性肝癌的诊断和预后评估中具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中复发分值rs与肝癌3年远端复发率关系图。

图2为实施例2中复发分值rs与肝癌3年远端复发率关系图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。

实施例1基于二代测序技术用于原发性肝癌早期诊断和预后评估的基因群的筛选

收集某三甲医院2008年1月至2008年12月间疑似肝癌(单个直径≤5cm或肿瘤数目小于3个,且直径均≤3cm)手术患者共200人,其中术后诊断提示为局灶性结节增生3例,非典型型增生8例,炎症性结节2例,总计早期肝癌患者187例,非肝癌患者13例。取以上200例患者手术中取出的离体新鲜组织按要求制成石蜡组织样本。按如下步骤进行检测:

(一)患者石蜡组织标本mrna的提取(采用qiagen公司rneasyffpekit)

1)首先用刀片,修剪蜡块;

2)在石蜡切片机上切成5μm的蜡片,取5-10张;

3)马上把组织片放入到1.5ml的ep管中,盖上盖子;

4)加入1ml二甲苯脱蜡,漩涡振荡10s,10000rpm离心10min;

5)离心弃去二甲苯,加入无水乙醇洗脱。如果脱蜡不完全,再加入二甲苯重复上述4)步骤;

6)加入240μlbufferpkd,漩涡振荡。加入10μl蛋白酶k,轻柔上下颠倒几次;

7)在55℃孵育15min,然后80℃15min;

8)转移液体到一个新的2ml离心管中;

9)在冰上孵育3min,13500rpm离心15min;

10)将上清转移到一个新的离心管中,不要碰到下面的沉淀;

11)加入1/10上清液体积的dnaseboosterbuffer,然后加入10μldnaseⅰ原液。颠倒管子,离心,使壁上的液体至底部;

12)室温放置15min;

13)加入320μlbufferrbc,彻底混合溶解;

14)加入1200μl无水乙醇,立即进行下一步;

15)吸出700μl样品,包括沉淀物,转移到一个rneasyminelutespincolumn套在2ml的离心管中,盖上盖子,大于10000rpm离心15s;

16)重复以上步骤,直到全部样品都穿过rneasyminelutespincolumn;

17)加入500μl的bufferrpe到rneasyminelutespincolumn中,盖上盖子,大于10000rpm离心15s,弃去废液;

18)加入500μl的bufferrpe到rneasyminelutespincolumn中,盖上盖子,大于10000rpm离心2min,洗膜,弃去废液;

19)将rneasyminelutespincolumn放到一个新的2ml的离心管中,打开管盖,离心5min,弃去废液;

20)再将rneasyminelutespincolumn放到一个新的1.5ml的ep管中,加入30μl的rnase-freewater,均匀分布在膜上。盖上盖子,离心1min,洗脱总rna。

(二)将提取好的总rna逆转录成cdna(采用takara试剂盒drr047a)

1)gdna去除反应

5×gdnaeraserbuffer2μl

gdnaeraser1μl

totalrna≤1μg

rnasefreewaterupto10μl

2)反转录反应

5×primescriptbuffer2(forrealtime)4μl

primescriptrtenzymemixⅰ1μl

rtprimermix1μl

第1)步的反应液10μl

rnasefreewaterupto20μl

将上述反转录好的cdna在-20℃储存备用。

(三)测序文库的构建

所述文库的构建方法为本领域常规文库构建方法,所述文库的构建方法较佳地包括用以下步骤:

将上述步骤制备的cdna末端补平并进行5’端磷酸化,将30uldna、45ul纯水、10ul具有10mmatp的t4dna连接酶缓冲液、4ul包含10mmdntpmix、5ult4dna聚合酶、1ulklenow酶、5ult4连接酶混合后,在20℃温浴30分钟(试剂来自illumina样本准备试剂盒pe-102-1001),温浴后采用qiagenqiaquickpcr纯化试剂盒(part#28104)纯化dna。末端悬液a:将上步的产物溶解在32ul缓冲液中,加入klenow缓冲液5ul,1mmdatp10ul、klenowexo3ul,在37℃保持30分钟(试剂来自illumina样本准备试剂盒),产物由qiagenminelutepcr纯化试剂盒(part#28004)连接:dna溶解在10ul缓冲液中,加入dna连接酶缓冲液2×25ul、peadaptoroligomix10ul、dna连接酶5ul,在20℃保持15分钟(试剂为illumina样本准备试剂盒pe-102-1001),温浴后采用qiagenqiaquickpcr纯化试剂盒(part#28104)纯化dna即得文库。

(四)文库测序和数据分析

其中所述测序的方法为本领域常规的测序方法,较佳地为采用dasl-seq技术,用illuminamiseq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。

其中所述的数据分析,采用常规的fpkm标准化公式进行归一化,以肝癌患者为观察组,以非肝癌患者(包括局灶性结节增生、非典型型增生、炎症性结节)为对照组,分析得到早期肝癌患者表达上下调5倍以内的以下四个基因:gpc3(glypican3)、hsp70(heatshockprotein70)、gs(glutaminesynthetase)和pivka-ⅱ(proteininducedbyvitaminkabsence)。所述基因gpc3的cdna序列如seq.no.1所示;基因hsp70的cdna序列如seq.no.2所示;基因gs的cdna序列如seq.no.3所示;基因pivka-ⅱ的cdna序列如seq.no.4所示。

(五)pcr扩增和数据分析

1)样本准备:

收集某三甲医院2009年1月至2009年12月间早期肝癌(单个直径≤5cm或肿瘤数目小于3个,且直径均≤3cm)手术病人共387人,其中术后诊断提示为局灶性结节增生7例,非典型性增生12例,炎症性结节3例。将以上样本按照要求制成石蜡组织标本,使用rna抽提试剂盒提取样本中的总rna,使用逆转录试剂盒将总rna逆转录成cdna。

2)qpcr扩增和数据处理:

pcr反应液的配制

sybrpremix10μl

forwardprimer(10μm)0.4μl

reverseprimer(10μm)0.4μl

dh2o7.2μl

cdna2μl;

qpcr反应程序

预变性95℃30s1cycles

扩增(信号收集)95℃5s40cycles

60℃30s

熔解曲线信号收集95℃15s1cycles

60℃1min

60-95℃+0.3℃

95℃15s;

数据处理

通过qpcr检测上述387例患者标本中gpc3、hsp70、gs、pivka-ⅱ、gapdh、actb六个基因的表达量。每个标本的gapdh和actb基因的ct值取算术平均值,其它四个基因的ct值采用δct算法计算相对表达量。

rs值计算公式拟合

采用spss软件对上述得到的相对表达量进行多元线性回归,得到复发风险值rs的计算公式为rs=0.080×gp3+0.098×hsp70+0.047×gs+0.13×pivka-ⅱ。

(六)数据回顾分析

根据以上算法得到rs值与存档的患者随访记录进行回顾性分析发现,其中rs分值低于3分为非早期肝癌患者(包括局灶性结节增生、非典型性增生、炎症性结节),具有较低复发风险的患者rs分值大于等于3分小于12分,具有中等复发风险的患者rs分值大于等于12分小于27分,具有较高复发风险的患者rs分值大于等于27分。

实施例2基于基因群及rs值算法诊断早期肝癌及预后评估

实施例2收集某三甲医院2010年1月至2011年1月期间早期肝癌(单个直径≤5cm或者肿瘤数目小于3个,且直径均≤3cm)手术病人共329人,其中术后诊断提示为局灶性结节增生3例,非典型增生7例,炎症性结节4例。按照要求将患者手术中取出的离体新鲜组织制成石蜡组织样本,抽取样本的总rna,反转录成cdna,用qpcr检测样本中gpc3、hsp70、gs、pivka-ⅱ、gapdh、actb六个基因的表达量,根据实施例1中的rs值计算公式计算得到每位患者的rs值。比较rs值与存档的随访资料,其中根据随访资料显示,处于低复发风险的患者为62人,处于中复发风险的患者为93人,处于高复发风险的患者为160人;根据rs的分布显示,小于3分的患者为14人,大于等于3分小于12分的患者为65人,大于等于12分小于27分的患者为90人,大于等于27的患者为159人。其中对于早期肝癌患者和非肝癌患者诊断的灵敏度为100%,对于低复发风险患者的预测灵敏度为100%,对于中等复发风险患者的预测灵敏度为96.774%,对于高复发风险患者的预测灵敏度为99.375%。以上检测结果说明该基因群及根据该基因群的表达量计算复发风险值(rs值)的算法可以有效诊断早期原发性肝癌并对患者预后做出有效评估。

sequencelisting

<110>上海东方肝胆外科医院

<120>基于转录组测序技术用于早期肝癌诊断和预后评估的基因群及其应用

<130>

<160>18

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1812

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggccgggaccgtgcgcaccgcgtgcttggtggtggcgatgctgctcagcttggacttc60

ccgggacaggcgcagcccccgccgccgccgccggacgccacctgtcaccaagtccgctcc120

ttcttccagagactgcagcccggactcaagtgggtgccagaaactcccgtgccaggatca180

gatttgcaagtatgtctccctaagggcccaacatgctgctcaagaaagatggaagaaaaa240

taccaactaacagcacgattgaacatggaacagctgcttcagtctgcaagtatggagctc300

aagttcttaattattcagaatgctgcggttttccaagaggcctttgaaattgttgttcgc360

catgccaagaactacaccaatgccatgttcaagaacaactacccaagcctgactccacaa420

gcttttgagtttgtgggtgaatttttcacagatgtgtctctctacatcttgggttctgac480

atcaatgtagatgacatggtcaatgaattgtttgacagcctgtttccagtcatctatacc540

cagctaatgaacccaggcctgcctgattcagccttggacatcaatgagtgcctccgagga600

gcaagacgtgacctgaaagtatttgggaatttccccaagcttattatgacccaggtttcc660

aagtcactgcaagtcactaggatcttccttcaggctctgaatcttggaattgaagtgatc720

aacacaactgatcacctgaagttcagtaaggactgtggccgaatgctcaccagaatgtgg780

tactgctcttactgccagggactgatgatggttaaaccctgtggcggttactgcaatgtg840

gtcatgcaaggctgtatggcaggtgtggtggagattgacaagtactggagagaatacatt900

ctgtcccttgaagaacttgtgaatggcatgtacagaatctatgacatggagaacgtactg960

cttggtctcttttcaacaatccatgattctatccagtatgtccagaagaatgcaggaaag1020

ctgaccaccactgaaactgagaagaaaatatggcacttcaaatatcctatcttcttcctg1080

tgtatagggctagacttacagattggcaagttatgtgcccattctcaacaacgccaatat1140

agatctgcttattatcctgaagatctctttattgacaagaaagtattaaaagttgctcat1200

gtagaacatgaagaaaccttatccagccgaagaagggaactaattcagaagttgaagtct1260

ttcatcagcttctatagtgctttgcctggctacatctgcagccatagccctgtggcggaa1320

aacgacaccctttgctggaatggacaagaactcgtggagagatacagccaaaaggcagca1380

aggaatggaatgaaaaaccagttcaatctccatgagctgaaaatgaagggccctgagcca1440

gtggtcagtcaaattattgacaaactgaagcacattaaccagctcctgagaaccatgtct1500

atgcccaaaggtagagttctggataaaaacctggatgaggaagggtttgaaagtggagac1560

tgcggtgatgatgaagatgagtgcattggaggctctggtgatggaatgataaaagtgaag1620

aatcagctccgcttccttgcagaactggcctatgatctggatgtggatgatgcgcctgga1680

aacagtcagcaggcaactccgaaggacaacgagataagcacctttcacaacctcgggaac1740

gttcattccccgctgaagcttctcaccagcatggccatctcggtggtgtgcttcttcttc1800

ctggtgcactga1812

<210>2

<211>2523

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgtcggtggtgggcatagacctgggcttccagagctgctacgtcgctgtggcccgcgcc60

ggcggcatcgagactatcgctaatgagtatagcgaccgctgcacgccggcttgcatttct120

tttggtcctaagaatcgttcaattggagcagcagctaaaagccaggtaatttctaatgca180

aagaacacagtccaaggatttaaaagattccatggccgagcattctctgatccatttgtg240

gaggcagaaaaatctaaccttgcatatgatattgtgcagttgcctacaggattaacaggt300

ataaaggtgacatatatggaggaagagcgaaattttaccactgagcaagtgactgccatg360

cttttgtccaaactgaaggagacagccgaaagtgttcttaagaagcctgtagttgactgt420

gttgtttcggttccttgtttctatactgatgcagaaagacgatcagtgatggatgcaaca480

cagattgctggtcttaattgcttgcgattaatgaatgaaaccactgcagttgctcttgca540

tatggaatctataagcaggatcttcctgccttagaagagaaaccaagaaatgtagttttt600

gtagacatgggccactctgcttatcaagtttctgtatgtgcatttaatagaggaaaactg660

aaagttctggccactgcatttgacacgacattgggaggtagaaaatttgatgaagtgtta720

gtaaatcacttctgtgaagaatttgggaagaaatacaagctagacattaagtccaaaatc780

cgtgcattattacgactctctcaggagtgtgagaaactcaagaaattgatgagtgcaaat840

gcttcagatctccctttgagcattgaatgttttatgaatgatgttgatgtatctggaact900

atgaatagaggcaaatttctggagatgtgcaatgatctcttagctagagtggagccacca960

cttcgtagtgttttggaacaaaccaagttaaagaaagaagatatttatgcagtggagata1020

gttggtggtgctacacgaatccctgcggtaaaagagaagatcagcaaatttttcggtaaa1080

gaacttagtacaacattaaatgctgatgaagctgtcactcgaggctgtgcattgcagtgt1140

gccatcttatcgcctgctttcaaagtcagagaattttctatcactgatgtagtaccatat1200

ccaatatctctgagatggaattctccagctgaagaagggtcaagtgactgtgaagtcttt1260

tccaaaaatcatgctgctcctttctctaaagttcttacattttatagaaaggaacctttc1320

actcttgaggcctactacagctctcctcaggatttgccctatccagatcctgctatagct1380

cagttttcagttcagaaagtcactcctcagtctgatggctccagttcaaaagtgaaagtc1440

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