一种基于血红素结合域的可视化蛋白表达融合标签的应用的制作方法

【技术领域】

本发明属于蛋白质表达纯化技术领域，具体涉及一种基于血红素结合域的可视化蛋白表达融合标签的应用。

背景技术：

重组蛋白表达技术现已广泛应用于生物学各个领域。将外源基因转入大肠杆菌、酵母菌等宿主细胞中进行表达以获得目的蛋白，是科学研究以及生产过程中获取所需蛋白质的重要方法。然而，许多外源蛋白的可溶性表达量很低或者形成不具有活性包涵体。目前，有许多方法可以提高重组蛋白的可溶性表达，其中将目的蛋白和标签蛋白融合表达是提高目的蛋白可溶性的有效手段。标签蛋白是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。大量实践证明，合理使用标签蛋白可增加目标蛋白的表达量，促进目标蛋白的正确折叠。而一些亲和标签，如谷胱甘肽s-转移酶(gsttag)、组氨酸标签(histag)、麦芽糖结合蛋白(mbp)等，还可用于蛋白的纯化(curropinbiotechnol.2006,17(4):353-358)。但是目前使用的融合标签种类还不足，由于蛋白质结构和性质的多样性，没有一种通用的融合标签能解决提高所有的异源蛋白的表达可溶性问题，也没有一种融合标签可以用于纯化所有的蛋白，因此开发新型的标签蛋白对异源蛋白的可溶性表达及纯化具有重要意义。

除了重组蛋白的可溶性表达问题，另一个制约重组蛋白表达技术的是蛋白质的纯化。尽管目前组氨酸标签(histag)、谷胱甘肽s-转移酶(gsttag)和麦芽糖结合蛋白(mbp)等多种标签已经广泛用于重组蛋白的亲和层析纯化。但是这些标签蛋白在可见光下均为无色，无法实现重组蛋白在表达及纯化过程中的持续可视化跟踪。如果借助融合蛋白标签能实现重组蛋白表达过程及其纯化过程的肉眼可视化，不仅能够提高蛋白表达条件优化的效率，而且在后续纯化中能实时监测蛋白纯化效率及纯度。例如，可以通过肉眼观察菌体和菌体破碎液的颜色判定重组蛋白的可溶性表达量；通过测定特定可见光波长下重组蛋白的吸光度就可以获得重组蛋白的浓度。近年来，来源于细胞色素p450还原酶的黄素单核苷酸结合域(～21kda)以及来源于细胞色素b5的血红素结合域(～13kda)被用于融合蛋白标签，在可见光下这两个标签的颜色分别为黄色和红色(biotechniques.2005,38(3):387-392；proteinsci.2010,19(10):1830-1839)。然而由于这两种蛋白标签在大肠杆菌中的可溶性表达较低，并没有得到广泛应用。因此，开发能增加重组蛋白可溶性表达并且实现可视化的融合标签具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种包含血红素结合域的可视化融合标签在蛋白质表达纯化中的应用，可以解决通过肉眼观察重组蛋白在表达及纯化过程中变化的问题。

本发明所要解决的问题是针对现有的肉眼可视化融合标签的种类很少，提供更多的可视化融合标签用于目标蛋白的表达，具体是提供一种包含来源于人胱硫醚β-合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列，其序列如序列表中seqidno:1所示；

seqidno:1

metglyserserhishishishishishisserserglymetprosergluthrproglnalagluvalglyprothrglycysprohisargserglyprohisseralalysglyserleuglulysglyserprogluasplysglualalysgluproleutrpileargproaspalaproserargcysthrtrpglnleuglyargproalasergluserprohishishisthralaproalalysserprolysileleuproaspileleulyslysileglyaspthrprometvalargileasnlysileglylyslyspheglyleulyscysgluleuleualalyscysgluleuvalproargglyser；

还包括一种将上述氨基酸序列作为可视化蛋白表达融合标签的用途；

还包括用于上述用途的融合表达载体，该载体是将六个组氨酸、包含人胱硫醚β-合酶的血红素结合域片段基因的氨基酸序列和凝血酶酶切位点基因克隆至大肠杆菌表达载体pet-28a(+)而获得，即获得包含可视化蛋白标签的融合表达载体pet-hm14；

还包括一种可视化融合蛋白表达系统，其至少包括上述的融合表达载体。

上述的可视化蛋白表达融合标签包括来源于人胱硫醚β-合酶(cbs)氨基端的血红素(heme)结合域(第1-110位氨基酸残基)，它具有较强的水溶性，融合蛋白表达量更高，表现为肉眼可见的鲜红色。因此，在表达和纯化过程中可以实现目的蛋白的肉眼可视化跟踪，根据融合标签在420nm的特征吸收可以实现目的蛋白含量实时监测，根据重组蛋白溶液od420/od280比值可以实现目的蛋白纯度的实时监测，同时该可视化标签也大大提高了目的蛋白的可溶性表达。

使用过程中，待表达的目的基因连接到pet-hm14载体实现可视化标签和目的基因的融合表达。为了方便目的蛋白的纯化，本发明在融合标签的氨基端加入六个组氨酸残基，利于使用ni-nta树脂亲和层析纯化融合蛋白；同时为了获得天然n端的目的蛋白，在融合标签的羧基端加入凝血酶酶切位点(lvprgs)，在纯化融合蛋白后能够切除标签。

本发明还公开了可视化蛋白表达融合标签的编码基因，其编码基因可以是序列表中seqidno:2所示的dna分子，当然，由于密码子的简并性，其它与seqidno:2所示核苷酸序列同源且编码相同氨基酸序列的dna分子也可用于构建本发明的融合标签蛋白。

seqidno:2

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcatgccttctgagaccccccaggcagaagtggggcccacaggctgcccccaccgctcagggccacactcggcgaaggggagcctggagaaggggtccccagaggataaggaagccaaggagcccctgtggattcggcccgatgctccgagcaggtgcacctggcagctgggccggcctgcctccgagtccccacatcaccacactgccccggcaaaatctccaaaaatcttgccagatattctgaagaaaatcggggacacccctatggtcagaatcaacaagattgggaagaagttcggcctgaagtgtgagctcttggccaagtgtgagctggtgccgcgcggcagc；

优选应用实施例中选择的是：

来源于灰色链霉菌(streptomycesgriseus)的胆固醇酯酶基因，该基因在大肠杆菌中单独表达时的可溶性蛋白量很少(<10％)，而与本发明的可视化蛋白标签融合表达后，重组蛋白可溶性得到大幅度提高(>30％)。同时由于可视化标签的存在使胆固醇酯酶的表达和纯化过程可以实现肉眼可视化跟踪，目的蛋白浓度可以根据od420的吸光度实时监测，目的蛋白纯度可以根据od420/od280比值进行实时监测，大大简化了胆固醇酯酶的表达和纯化过程。胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶，它是临床检测血清总胆固醇的重要酶之一，提高其可溶性表达量以及纯化效率将使大规模胆固醇酯酶的表达和纯化更加简便和快捷。

本发明的有益效果是：(1)来自于人胱硫醚β-合酶(cbs)的血红素结合域可以作为肉眼可视化蛋白表达融合标签用于重组蛋白的表达，能大大提高融合蛋白的可溶性表达量；(2)由于该融合标签具有肉眼可见的鲜红色，因此在表达和纯化过程中可以实现目的蛋白的肉眼可视化跟踪，可以不通过紫外检测器而仅靠肉眼判定融合蛋白纯化过程，大大简化了纯化流程；(3)由于该可视化蛋白表达融合标签的特征吸收为～420nm，根据纯化过程中od420的数值变化可以实现目的蛋白含量的实时监测，根据od420/od280比值可以实现目的蛋白纯度的实时监测。

人胱硫醚β-合酶(cbs)氨基端包含有110个氨基酸残基的血红素(heme)结合域，分子量约12kda，具有很强的水溶性，作为融合蛋白标签可以提高目的蛋白的可溶性表达。并且该血红素标签(hemetag)在～420nm下具有特征吸收峰，表现为肉眼可见的鲜红色，可以对重组蛋白的表达过程和纯化过程进行可视化跟踪，同时可以根据420nm的吸光度测定融合蛋白的浓度，根据重组蛋白溶液在420nm和280nm下的吸光度比值(od420/od280)判定重组蛋白的纯度。

【附图说明】

图1为5660个碱基对的人胱硫醚β-合酶血红素(heme)结合域片段基因作为可视化蛋白表达融合标签的大肠杆菌表达载体pet-hm14图谱，其中：

26-72是t7终止子序列，158-203是多克隆位点序列，204-221是凝血酶酶切位点的核苷酸序列，222-551是血红素结合域可视化蛋白表达融合标签的核苷酸序列，561-578是编码6个组氨酸位点的核苷酸序列，661-677是t7启动子序列，1064-2143是laci基因的编码序列，3577是pbr322复制起始位点，4286-5098是卡拉霉素抗性基因kan的编码序列；

图2为pet-hm14空载体诱导表达的可视化标签的sds-page图，其中：

1.蛋白质分子量标准，大小分别为200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda，29.0kda，20.1kda，14.3kda，6.5kda；2.未诱导的大肠杆菌bl21(de3)/pet-hm14破碎后上清液；3-4.诱导后的大肠杆菌bl21(de3)/pet-hm14破碎后上清液，其中箭头标注为诱导表达的蛋白标签；

图3为胆固醇酯酶基因与可视化标签融合表达蛋白的sds-page图，其中：

1.蛋白质分子量标准，大小分别为200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda；2.诱导前的重组菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；3.诱导后2h的重组菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；4.诱导后4h的重组菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；5.诱导后6h的重组菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；

图4为融合表达胆固醇酶的重组大肠杆菌破碎后上清液的紫外-可见吸收光谱，其中：280nm是蛋白质的特征吸收峰，420nm是包含可视化标签的融合蛋白特征吸收峰，烧杯中的红色溶液为重组大肠杆菌裂解液；

图5是纯化的胆固醇酯融合蛋白sds-page图，其中：1.蛋白质分子量标准，大小分别为200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda；2.表达胆固醇酯酶融合蛋白的重组大肠杆菌破碎后上清液(可溶性蛋白)；3.经ni-nta树脂亲和层析纯化的胆固醇酯酶融合蛋白(20μg)；4.经ni-nta树脂亲和层析纯化的胆固醇酯酶融合蛋白(20μg)；5.经ni-nta树脂亲和层析纯化的胆固醇酯酶融合蛋白(50μg)；

图6是纯化后融合蛋白的紫外-可见吸收光谱，其中：280nm是蛋白质的特征吸收峰，420nm是包含血红素可视化标签的融合蛋白特征吸收峰，离心管中红色蛋白溶液为纯化的胆固醇酯酶融合蛋白。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：包含可视化血红素融合标签质粒载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

本发明中，使用的大肠杆菌e.colidh5α以及e.colibl21(de3)均为外购，大肠杆菌质粒pet-28a(+)购自美国novagen公司。包含人胱硫醚β-合酶(cbs)基因序列的大肠杆菌表达载体已在论文中公开(medchemcommun.2017,8:198-201)。质粒dna抽提试剂盒、dna胶回收试剂盒购自omega公司；t4dna连接酶、taqdna聚合酶和各种限制性内切酶、蛋白marker购自takara公司。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,5-ala)购于sigma公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。

lb培养基(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％氯化钠；以上均为质量分数)，氨苄青霉素(ampicillin)终浓度均为50μg/ml。固体lb培养基：在液体lb培养基中加入1.5％的琼脂，即制成固体lb培养基(固体琼脂平板培养基)。

设计引物pr1：

5′-tcaccatgggcagcagcagcagcggcatgccttctgagaccccccag-3′；

引物pr2:

5′-actggatccctcacacttggccaagagctc-3′。引入的ncoⅰ和bamhⅰ酶切位点以下划线表示。引物pr1中包含6个组氨酸的编码基因(双下划线)，引物pr2中包含凝血酶酶切位点氨基酸的编码基因(双下划线)。以包含人胱硫醚β-合酶(cbs)基因序列的质粒为模板，使用引物pr1和pr2扩增得到包含血红素结合域的融合标签。将扩增的融合标签基因片段用ncoⅰ和bamhⅰ双酶切连接到载体pet-28a(+)上，构建能表达可视化标签蛋白的融合表达载体，即重组质粒pet-hm14，质粒图谱如图1所示。

然后将重组质粒转化到e.colibl21(de3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌bl21(de3)/pet-hm14。将培养过夜的e.colibl21(de3)/pet-hm14按照1:100的比例接种到500ml含有50ug/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养至菌液od600达到0.6～0.8，然后加入终浓度为0.3mmol/l的5-ala和终浓度为0.1mmol/l的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)于30℃下诱导过夜，在4℃离心收集菌体备用。将上述收获的菌体重悬于20ml破碎缓冲液中，在冰水浴中超声波(300w，超声3s，间隔8s)处理1100s破碎细胞，破碎液在4℃离心30min(12000r/min)获得上清液，然后进行sds-page分析。

实验结果如下：成功构建能表达可视化标签蛋白的表达载体，即重组质粒pet-hm14，如图1所示，过夜诱导表达后的菌体为肉眼可见的微红色，菌体破碎上清液为鲜红色；sds-page结果表明融合蛋白标签成功表达，表观分子量约14kda，如图2所示。以上结果表明包含血红素结合域的可视化标签成功可溶性表达，标签蛋白为肉眼可见的血红色，可用于融合蛋白的可视化表达和纯化中。

实施例2使用包含可视化标签载体pet-hm14在大肠杆菌中表达胆固醇酯酶。

根据灰色链霉菌(streptomycesgriseus)的胆固醇酯酶基因(genbank:llzl01000117.1)设计引物

pr3：5′-tcaggatccatgggcagcagccatcatcatc-3′,

引物pr4：5′-actaagctttcagctgccgcgcggcaccag-3′，引入的bamhⅰ和hindⅲ酶切位点以下划线表示。灰色链霉菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。使用真菌基因组dna提取试剂盒(购于北京索莱宝科技有限公司)提取灰色链霉菌(streptomycesgriseus)的基因组dna，使用引物pr3和pr4扩增得到灰色链霉菌的胆固醇酯酶基因，将扩增的目的基因片段用bamhⅰ和hindⅲ双酶切连接到载体pet-hm14上构建能表达可视化融合蛋白的融合表达载体，即重组质粒pet-hm14-ce，然后将重组质粒转化到e.colibl21(de3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌bl21(de3)/pet-hm14-ce。将培养过夜的e.colibl21(de3)/pet-hm14-ce按照1:100的比例接种到1l含有50ug/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养至菌液od600达到0.6～0.8，然后加入终浓度为0.3mmol/l的5-ala和终浓度为0.1mmol/l的iptg于30℃下诱导过夜，在4℃离心收集菌体备用。将上述收获的菌体重悬于50ml破碎缓冲液中，在冰水浴中超声波(300w，超声3s，间隔8s)处理1100s破碎细胞，破碎液在4℃离心30min(12000r/min)获得上清液，上清液进行紫外-可见光谱分析并进行sds-page分析。同时破碎上清液经ni-nta树脂亲和层析后获得带有可视化标签的融合蛋白，纯化后融合蛋白进行蛋白含量测定、紫外-可见光谱分析以及sds-page分析。

实验结果如下：来源于灰色链霉菌的胆固醇酯酶使用pet-28a(+)载体表达时，可溶性目的蛋白的表达量低于菌体总蛋白的10％，并且表达和纯化过程无法实现肉眼可视化。而使用可视化标签表达的可溶性蛋白表达量超过菌体总蛋白的30％，结果如图3所示。表明融合标签大幅度提高了胆固醇酯酶的可溶性表达。

另外，表达融合蛋白的重组大肠杆菌破碎液为肉眼可见的红色，紫外-可见光谱分析表明破碎上清液具有～420nm的血红素特征吸收峰以及280nm的蛋白质吸收峰，结果如图4所示。经测定上清液蛋白浓度为6mg/ml，其中带有可视化标签的融合蛋白含量为1.5mg/ml，在420nm的吸光度约为od420＝1.1，在280nm的吸光强度约为od280＝3，表征融合蛋白纯度的od420/od280的比值约为0.4。经过一步亲和层析目的蛋白的纯度达到95％，纯化的带有可视化标签的融合蛋白为肉眼可见的鲜红色，结果如图5和图6所示。将纯化的融合蛋白浓度调整至1.5mg/ml(与菌体破碎上清液中融合蛋白含量一致)并进行紫外-可见光谱分析如图6所示，结果表明纯化的融合蛋白在420nm的吸光度约为od420＝1.1，与含有相同浓度融合蛋白的菌体破碎上清液在420nm的吸光度一致，表明可以通过可视化标签在420nm的特征吸收对重组蛋白的浓度进行测定。同时纯化的融合蛋白在280nm的吸光度约为od280＝1.3，纯化的融合蛋白(95％纯度)od420/od280的比值约为0.9，而细胞裂解液的od420/od280的比值约为0.4。因此，在使用可视化标签进行蛋白质的表达纯化过程中，可以通过蛋白溶液的od420/od280的比值判定目的蛋白的纯度。

<110>西北工业大学

<120>一种基于血红素结合域的可视化蛋白表达融合标签的应用

<130>无

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>seqidno1

<211>129

<212>prt

<213>人工序列

<400>seqidno1

metglyserserhishishishishishisserserglymetproser

151015

gluthrproglnalagluvalglyprothrglycysprohisargser

202530

glyprohisseralalysglyserleuglulysglyserprogluasp

354045

lysglualalysgluproleutrpileargproaspalaproserarg

505560

cysthrtrpglnleuglyargproalasergluserprohishishis

65707580

thralaproalalysserprolysileleuproaspileleulyslys

859095

ileglyaspthrprometvalargileasnlysileglylyslysphe

100105110

glyleulyscysgluleuleualalyscysgluleuvalproarggly

115120125

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<210>seqidno2

<211>387

<212>dna

<213>人工序列

<400>seqidno2

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcatgccttctgagaccccccag60

gcagaagtggggcccacaggctgcccccaccgctcagggccacactcggcgaaggggagc120

ctggagaaggggtccccagaggataaggaagccaaggagcccctgtggattcggcccgat180

gctccgagcaggtgcacctggcagctgggccggcctgcctccgagtccccacatcaccac240

actgccccggcaaaatctccaaaaatcttgccagatattctgaagaaaatcggggacacc300

cctatggtcagaatcaacaagattgggaagaagttcggcctgaagtgtgagctcttggcc360

aagtgtgagctggtgccgcgcggcagc387