一种高效表达小鼠促性腺激素抑制激素基因的慢病毒载体及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种高效介导促性腺激素抑制激素基因过表达的慢病毒载体及其应用。

背景技术：

促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitoryhormone，gnih)是2000年tsutsui及其同事于日本鹌鸫下丘脑发现的一种含有12个氨基酸的精氨酰-苯丙酰胺(rf酰胺)神经肽，其作用受体为一种g蛋白偶联受体147(gpr147)。gnih能抑制性腺激素的合成与释放进而调控动物的繁殖，故将其命名为促性腺激素抑制激素。此后，gnih及其同系物于各类动物中相继被发现，因它们都拥有特征性的c端氨基酸序列lpxrf(x＝l或p)，故被称为rf酰胺相关肽(rfrps)。gnih的发现，证明促性腺激素释放激素(gonadotropininhibitoryhormone，gnrh)并不是唯一调节性腺类激素合成与分泌的神经肽，因此在动物繁殖的研究领域，对gnih功能的研究也逐渐成为一个热点之一。

对于外源基因导入细胞常用的方法有脂质体转染法、电转法以及显微注射法。但是以上方法存在着自身的缺陷，如脂质体转染法对原代和非分裂期细胞转染效率低，电转法对细胞损伤大，显微注射操作难度大等，而且以上几种方法对于转录的基因都无法实现长期稳定的表达。慢病毒载体是一种常用的逆转录病毒，是在由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)的基础上改装而来，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞和不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒载体己经成为表达外源基因的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。已有研究表明利用慢病毒在疾病的基因治疗方面发挥重要的作用。

促性腺激素抑制激素作为一种对性腺激素具有抑制作用的调节因子，在一些物种激素调节中有过一些报道，但是构建其慢病毒载体并在小鼠卵泡发育中的作用还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术还没有对小鼠促性腺激素抑制激素基因表达进行调控的产品这一缺陷，提供一种高效表达小鼠促性腺激素抑制激素(简称gnih)基因的慢病毒载体，同时提供该载体的应用。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高效表达小鼠促性腺激素抑制激素基因的慢病毒表达载体，该慢病毒表达载体是将小鼠促性腺激素抑制激素基因插入慢病毒载体plvx-ires-zsgreen1中构建而成。

本发明同时提供上述慢病毒表达载体在促进小鼠卵巢颗粒细胞促性腺激素抑制激素基因表达中的应用。其中，该应用是指对小鼠卵巢颗粒细胞增殖具有抑制作用；对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素分泌具有抑制作用；对小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡具有促进作用。

本发明具有以下有益效果：本发明构建的慢病毒表达载体能够显著提高小鼠卵巢颗粒细胞gnih基因的表达，以及对雌激素分泌及颗粒细胞增殖、凋亡均产生重要作用。通过实时定量荧光pcr检测发现，慢病毒表达载体能使gnihmrna表达量提高1200倍以上，通过elsia检测发现，慢病毒表达载体能使雌激素分泌量降低38.2％，流式细胞技术检测表明，颗粒细胞凋亡升高47.5％。本发明所构建的慢病毒表达载体可制备成基因药物或其他合适的制剂用于调节小鼠促性腺激素抑制激素分泌水平，可应用于调控动物繁殖功能。

附图说明

图1是慢病毒系统质粒图。

其中，a为慢病毒表达质粒，b为慢病毒包装质粒。

图2是gnihpcr电泳结果图。

其中，1：gnih，2：m：dl2000marker。

图3是plvx-ires-zsgreen1空质粒酶切图。

其中，1：plvx-ires-zsgreen1空质粒，2：ecori和bamhi双酶切，m：dl8000marker。

图4是plvx-gnih菌落pcr检测图。

其中，1-5：plvx-gnih菌液，m:dl2000marker。

图5是小鼠plvx-gnih酶切鉴定电泳图。

其中，1：plvx-ires-zsgreen1空质粒，2：plvx-ires-zsgreen1空质粒ecori和bamhi双酶切plvx-gnih产物，m1：dl5000marker，m2：dl2000maker

图6是克隆基因同小鼠gnih基因对比结果。

其中，query为小鼠gnih基因序列，sbjet为克隆得到的测序结果。

图7是慢病毒干扰质粒滴度测定图。

其中，a：plvx-gnih，b：plvx-nc；a：病毒液量为9×10⁰，b：病毒液量为9×10^-1，c：病毒液量为9×10^-2、d：病毒液量为9×10^-3、e：病毒液量为9×10^-4、f：病毒液量为9×10^-5、g：病毒液量为9×10^-6、h：病毒液量为9×10^-7。

图8是plvx-gnih转染颗粒细胞96h荧光显微镜图(100×)。

图9是慢病毒质粒对小鼠卵巢颗粒细胞中gnihmrna表达水平的影响，b表示差异性显著(p<0.05)。

图10是转染空质粒病毒和慢病毒质粒后对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响，b表示差异性显著(p<0.05)。

图11是慢病毒质粒转染小鼠卵巢颗粒细胞72h后流式细胞仪测定细胞凋亡图。

其中，a：plvx-nc；b：plvx-gnih。

图12是图11是慢病毒质粒转染小鼠卵巢颗粒细胞72h后的细胞凋亡率，b表示差异性显著(p<0.05)。

图13是转染空质粒病毒和慢病毒质粒96h后对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素分泌的影响，b表示差异性显著(p<0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

实施例1小鼠卵巢颗粒细胞中gnih的扩增

1.按照invitrogen公司的trizolreagent试剂盒提取小鼠卵巢颗粒细胞的rna(小鼠促性腺激素抑制激素(gnih)，genebank登录号nm021892)，所用的器材均经过0.1％depc水浸泡过夜后，高压灭菌。所用的试管均为rna-freeep管，收集的细胞经trizol溶解，氯仿抽提及异丙醇沉淀后，用0.1％depc水溶解rna，并以此为模板合成cdna第一链；

2.以上述合成的cdna第一链为模板，以含有bamhi及ecori酶切位点的上下游引物进行pcr扩增，上游引物：ccggaattcatggaaattatttcattaaaacgattc(seqidno：1)，下游引物：cgcggatccctatttttctggtttcctttctgc(seqidno：2)，进行pcr扩增，扩增产物大小为567bp。pcr反应体系：10×buffer5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、ps酶0.5μl、dntp2μl、cdna模板2μl、补加ddh2o至20μl。反应条件：95℃，2min；95℃，10s,59℃，20s,72℃，30s，35个循环后72℃延伸10min，然后将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳片段大小与预期一致(图2)，然后用胶回收试剂盒回收片段。

实施例2构建plv-gnih慢病毒表达载体

1.酶切反应。反应体系：ecori与bamhi双酶切pcr产物。ecori与bamhi双酶切图1a所示的plvx-ires-zsgreen1，酶切体系：10×buffer2μl、bamhi1μl、ecori1μl、plvx-ires-zsgreen1质粒5μl，补充ddh2o至20μl。反应条件为37℃反应1h，然后采用1％琼脂糖凝胶电泳(图3)。酶切产物用dna纯化回收试剂盒回收，于-20℃保存。

2.连接反应。反应体系：10×buffer1μl、线性化的plvx-ires-zsgreen1质粒2μl、gnih片段2μl、t4dna连接酶1μl，补充ddh2o至10μl。反应条件为16℃连接过夜，获得重组的plvx-gnih-ires-zsgreen1质粒。

3.转化与阳性克隆的鉴定。将重组质粒转化至感受态的大肠杆菌，于具有amp抗性的固体lb培养基中37℃孵育过夜后，挑取单个菌落，接种到lb液体培养基中，37℃恒温震荡培养5h。pcr鉴定阳性克隆，采用primer5设计引物，其中上游引物序列：gaggatctatttccggtgaattatg(seqidno：3)，下游引物序列：gtattttccgtcaccttctttgc(seqidno：4)，由南京金斯瑞生物公司合成。扩增的片段包含于插入的目的dna片段中。

pcr扩增片段约为150bp，反应体系为：10×buffer1μl、dntp0.5μl、taq酶0.1μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、菌液0.4μl，补充ddh2o至10μl。按以下条件进行pcr反应：95℃，2min；95℃，30s,60℃，30s,72℃，30s，30个循环后72℃延伸10min。分别取2μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图4。

阳性克隆酶切鉴定：选取任一阳性克隆，采用ecori与bamhi双酶切鉴定，反应体系为10×buffer1μl、bamhi0.5μl、ecori0.5μl、质粒2μl，补充ddh2o至10μl。反应条件为37℃反应1h，然后采用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图5。

阳性克隆测序验证：选取阳性克隆的菌液送南京金斯瑞生物公司测序，测序结果见图6，利用blast进行同源性分析，将构建成功的慢病毒质粒命名为plv-gnih(plvx-gnih是在plvx-ires-zsgreen1质粒中插入gnih序列构成)。实施例3慢病毒包装及滴度测定

1.准备293ft细胞。用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的293ft细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为10⁷个细胞重新接种于10cm细胞培养皿内，37℃，5％co2培养箱内培养，待细胞汇合度达70-80％时即可用于转染。

2.细胞转染，按照lipofectaminetm2000试剂盒说明书进行。

转染前2小时，更换新鲜培养基。按照10，6.5,3.5g,2.5μg的比例分别把重组质粒(空质粒),plp1,vsvg,plp2(购自invitrogen公司)加入到1500μlopti-mem内混匀，另外取35μllip2000加入到1500μlopti-mem内混匀，两者迅速混合，混匀，室温静止15min,逐滴加入到培养皿内，充分混匀。12h后更换不含双抗的含2％fbs的病毒收获培养基。

3.病毒收集。收获病毒培养基到离心管内，迅速置于冰上进行预冷。在4℃，1500g的条件下离心30min。病毒液经0.45μm滤器过滤后，加入4×病毒浓缩液，加入比例为3:1。浓缩液加入后在4℃的冰箱中静置过夜，在4℃，1500g转速下对其进行离心45min，弃上清液。用500μl无血清培养基吹打重悬病毒聚集团块，制成病毒液。

4.滴度测定。取10μl浓缩病毒加入到90μl稀释液中，此为第一稀释度，从第一稀释度中取10μl加入到90μl稀释液中，此为第二稀释度，逐级稀释，共取8个稀释度(病毒液量为9×10⁰-9×10^-7μl)。取90μl稀释病毒液加入96孔板，感染4天后，进行荧光观察计数。病毒滴度(tu/ml)等于荧光表达量除以病毒液量。

结果发现，当病毒液量为9×10^-7时，视野下均无荧光，当病毒液量为9×10^-6时，plvx-gnih及plvx-nc感染的视野下的荧光个数均为2个(见图7)，因此根据滴度计算公式，其滴度都为2×10⁸tu/ml。

实施例4gnihmrna表达水平检测

1.病毒液感染小鼠卵巢颗粒细胞。培养的颗粒细胞密度达70-80％时，以合适的感染复数(moi＝100)将感染慢病毒的病毒液感染细胞。以不感染任何慢病毒的小鼠卵巢颗粒细胞为空白对照，以感染plvx-nc病毒液的小鼠卵巢颗粒细胞为阴性对照。感染96h后收集细胞，-70℃保存，用于rna提取。

2.感染细胞总rna提取。采用invitrogen公司的trizolreagent提取感染细胞的总rna。

3.realtime-pcr检测细胞内gnih的表达水平

以提取的rna为模板，利用thermo公司逆转录试剂盒，以oligo-dt为引物进行rt反应。取总rna5ug，oligo-dt2.5μl，depc水补至12.5μl于72℃反应5min后立即至于冰上；在冰浴状态下加入5×reactionbuffer4μl，ribolockrnaseinhibitor0.5μl，dntpmix(10mm)2μl，revertaidreversetranscriptase1μl，于42℃反应60min后，再72℃反应10min逆转录形成cdna。

gnih的引物如下，gnih上游引物：tgatgcctcattttcacagca(seqidno：5)，下游引物：ctgcggggcttcttttctc(seqidno：6)，pcr扩增片段为225bp。以小鼠gapdh为内参基因(gapdh上游引物为：aggtcggtgtgaacggatttg(seqidno：7)；下游引物为：tgtagaccatgtagttgaggtca(seqidno：8))，扩增片段为123bp，引物由南京金斯瑞生物公司合成。

在荧光定量pcr专用96孔板中，每孔加入2×qpcrmix10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、cdna模板2μl，加depc水至20μl，每组设置三个平行。小心将离心管盖压紧后短暂离心。

按biorad荧光定量pcr仪的操作说明放入96孔pcr板，设置pcr反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃,20s，经42个循环后72℃，10min进行延伸。各目的基因的表达水平可用2^-△ct法进行计算，△ct＝(目的基因ct-内参基因ct)。结果发现，转染96h后，小鼠卵巢颗粒细胞中可见到荧光(图8)。慢病毒液感染小鼠卵巢颗粒细胞后，与空白组相比，空质粒病毒液组感染后基因表达几乎无变化，慢病毒过表达组显著提高细胞中gnihmrna的表达水平，提高1200倍以上(图9)。

由此可见，体外细胞实验表明，本发明涉及的慢病毒质粒可有效地提高gnih基因的表达，因此可用于小鼠促性腺激素抑制激素生物学功能研究。

实施例5gnih过表达对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖作用

1.慢病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞。以未感染任何病毒液的颗粒细胞为空白组，以感染plvx-nc颗粒细胞为阴性对照组，感染plvx-gnih慢病毒为实验组。

2.mtt法测定细胞增殖情况

(1)96孔板板中，以每孔5000个细胞的接种量，铺板感染慢病毒的颗粒细胞于96孔板中(每组三个平行)；

(2)每孔加20μlmtt溶液(5mg/ml)，在37℃、5％co2培养箱中培养4h；

(3)小心吸弃孔内培养上清液，避免吸去紫色结晶，然后每孔加150μldmso，振荡10min，使结晶物充分溶解；

(4)选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。结果表明，经过96h培养，细胞增长了将近3倍，在72h时细胞的增长速度减缓。相对于空白对照与阴性对照组，plvx-gnih可抑制颗粒细胞增殖，而在72h时的抑制作用最明显，相对于空白组其抑制效率为29％(图10)。

实施例6gnih过表达对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用

1.慢病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞。以感染plvx-nc颗粒细胞为对照组，感染plvx-gnih为实验组。

2.流式细胞仪测定细胞凋亡

采用南京凯基生物公司的annexinv-apc/pi细胞凋亡检测试剂盒说明书进行：

(1)慢病毒感染细胞72h后，各组细胞离心收集，用4℃预冷pbs洗涤2次；

(2)用500μl结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为10⁶/ml，然后取100μl细胞悬浮于5ml流式管中；

(3)加入5μlannexinv-apc混匀后，再加入5μlpropidiumiodide混匀，于室温避光孵育15min；

(4)重悬于400μlpbs，400目筛网过滤，加样于流式细胞仪(facs)检测细胞凋亡。激发波长ex＝488nm，发射波长em＝530nm。获得细胞凋亡数据后用modfitlt软件进行细胞凋亡相对定量分析。结果显示，plvx-nc感染细胞后颗粒细胞凋亡率为11.62％；plvx-gnih组颗粒细胞凋亡率为22.12％。因此相对于plvx-nc组，plvx-gnih对颗粒细胞凋亡的促进效率为47.5％(图11和图12)。

实施例7gnih过表达对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素分泌的作用

1.慢病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞。以未感染任何病毒液的颗粒细胞为空白组，以感染plvx-nc颗粒细胞为阴性对照组，感染plvx-gnih慢病毒为实验组。

2.采用上海丽臣公司小鼠雌激素elisa试剂盒的操作说明测定雌激素含量。

(1)室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；

(2)设置标准品孔、样本孔、空白孔(空白孔什么都不加)；标准品孔各加不同浓度(浓度设置见标准曲线中标准品的浓度)的标准品50μl；

(3)待测样本孔先加样本稀释液40μl，再加待测样本10μl；

(4)随后标准品孔和样本孔中(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶hrp标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；

(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(6)所有孔加入底物a\b各50μl，37℃避光孵育15min；

(7)所有孔加入终止液50μl，15min内在450nm波长处测定各孔的od值。

(8)以标准品的吸光度制作标准曲线，根据测定的各组的吸光度计算雌激素浓度。

结果表明，空白组的雌激素浓度为27.56pg/ml；plvx-nc组的雌激素浓度为25.67pg/ml；plvx-gnih组中雌激素浓度为17.49pg/ml。与空白组比，plvx-n组雌激素含量减少，但二组差异性不显著；与空白组对比，plvx-gnih组雌激素浓度降低36.5％(图13)。因此，在颗粒细胞中gnih过表达时，雌激素分泌会受到抑制。

综上所述，所构建的慢病毒质粒能明显促进gnihmrna的表达，gnih过表达后对小鼠卵巢颗粒细胞增殖及雌激素分泌具有抑制作用，对颗粒细胞凋亡具有促进作用。因此，此高效表达促性腺激素抑制激素的基因的慢病毒载体能用于调控动物的繁殖过程。

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<110>湖南农业大学

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