大豆低温诱导人工合成启动子SP5及应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及一种大豆低温诱导启动子sp5及其在转基因植物中的应用。

背景技术：

要想实现对基因表达的精细调控，包括特异性的组织表达、特定时期的表达和诱导性的表达等，就要靠对基因的精确设计来实现，也就是如何使用“分子开关”启动子来调控单一基因或多个基因针对特异的环境、生理和化学诱导来表达。最有效的，也是最具应用前景的，就是利用植物人工合成启动子来实现。

人工合成启动子对基因的精细调控已经在植物生长发育、组织特性、生物及非生物抗性中获得了成功。mullerandsheen为了获得一个广谱性的细胞分裂素报告基因，对细胞分裂素双组分产物传感器（two-component-outputsensor，tcs）基因的启动子进行人工设计，直接将tcs中的核心元件重复6次（tcs::luc），以经过核心元件突变的tcs*::luc作为阴性对照。用不同的激素tz（反式玉米素，细胞分裂素的一种）、生长素（naa）、aba和赤霉素处理转化的拟南芥原生质体，tcs::luc只对tz处理有响应，为对照的18倍左右，而atgh3.3::luc（脱落酸诱导型）和rd29a::luc（赤霉素诱导型）也对特异的激素才有反应。用不同种类的细胞分裂素处理（ad是腺嘌呤处理，作为阴性对照）转化的原生质体，tcs::luc都有作用，表明该启动子对不同的细胞分裂素具有广谱响应性。

为了获得强诱导型启动子，hou等将胁迫诱导型启动子（rd29a,erd1,cor15a,kin1）的调控元件重新组合，以gus作为报告基因，设计合成了3个人工合成启动子。在各转基因株系中，诱导情况下，人工合成启动子的gus表达水平要强于对照株系rd29a::gus株系。在不同胁迫情况下，人工合成启动子比rd29a启动子的调控活性要好很多，但不如组成型启动子camv35s。

acharya等利用花椰菜花叶病毒（mirabilismosaicvirus）全长转录本的上游激活区（muas,−297to−38）和花椰菜花叶病毒亚基因组的5’端序列（mscp,−306to−125）构建了一个高效的人工嵌合强启动子。这个启动子可以启动gus基因在转基因烟草和拟南芥原生质体中高效表达，启动活性强于camv35s启动子，是它的两倍多。在转基因拟南芥中鉴定muasmscp嵌合启动子的活性，种子萌发过程中，muasmscp启动gus表达的活性高于其它类型的转基因株系，在21天大小的转基因拟南芥中，muasmscp启动gus基因在整株表达且活性较高。

这些研究结果表明，通过组合不同的调控元件合成人工启动子可以有目的的调控基因的表达，即实现基因精细调控。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供了一种大豆低温诱导启动子sp5。

一种大豆诱导启动子sp5，其碱基序列如seqidno.1所示。

一种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如seqidno.1所示的碱基序列；

所述的表达载体为pbi121。

一种含有其碱其序列如seqidno.1的互补或反向序列。

一种大豆诱导启动子sp5在用于以低温或盐碱为压力作为选择标记的用途。

一种大豆诱导启动子sp5在培育耐低温或抗盐碱转基因植物的应用；

所述的的植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明公开了一种大豆低温诱导启动子sp5，它是以大豆中的glyma18g03930基因启动子区179bp、glyma09g29840基因启动子区382bp、以及35s核心启动子corecamv35s连接构建而成，命名为syntheticpromoter5，简称为sp5。在转基因烟草中鉴定sp5启动子驱动报告基因gus的表达情况表明，sp5启动子可以受干旱、盐、盐碱、aba以及低温胁迫所诱导，对低温尤其敏感。本发明构建了一种大豆人工合成启动子sp5，其对低温胁迫尤其敏感，可直接应用于农作物转基因抗逆育种。

附图说明

图1为sp5与gus融合表达载体图；

图2为转sp5基因烟草在不同胁迫条件下gus蛋白的染色情况；

图3为转sp5基因烟草在不同胁迫条件下gus蛋白的活性。

具体实施方式：

实施例1大豆人工合成启动子sp5的设计

通过分析大豆glyma18g03930与glyma09g29840基因启动子区域发现，在我们选定的两个区域内含有多个与逆境响应的元件，比如tca-element、tcrichrepeat、ltr元件等，将glyma18g03930启动子区179bp、glyma09g29840启动子区382bp、以及35s核心启动子corecamv35s串联构建而成syntheticpromoter5，简称为sp5，其核苷酸序列为seqidno.1序列。

实施例2启动子sp5表达载体的构建

通过人工合成方法将sp5（seqidno.1）序列合成到载体puc57上，并在序列两端添加酶切位点bamhl和hindiii。将puc57-sp2载体和pbi121质粒（可直接从生物公司购买），分别用bamhl和hindiii进行双酶切，分别回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定，获得表达载体pbi121-sp2（图1）。将载体pbi121-sp2转化至农杆菌eha105中，用于浸染烟草。

实施例3转sp5基因烟草的获得

按照叶盘转化法（horschetal.1988）进行。农杆菌菌液用灭菌水稀释至106-107cells/ml（一般稀释30倍左右）。取无菌烟草叶片，去掉主脉将叶片切成四方形状，然后将其浸入到稀释后的菌液中，侵染8-10分钟。

(1)共培养

取出叶片外植体后在灭菌滤纸上吸干菌液，将其叶表面向下倒置于ms培养基的表面，24°c-25°c暗培养2天。

(2)选择培养

将共培养叶片转移到选择分化培养基（含250mg/l头孢；100mg/l卡那霉素）上，28°c，每日光照16小时，15-20天换一次培养基。

(3)生根培养

当分化的抗性芽长到1cm左右，切下（最好不带任何愈伤组织）转移到生根培养基上，28°c，每日光照16小时。

(4)土壤培养

当根长出约1-3cm长，且密度较大时，去除封口膜，室温环境中进行炼苗2-3天，取出植株彻底洗净培养基，同时注意尽量减少根的损伤，移入温室土壤中培养。前2-3天需要遮阴培养。

(5)烟草的繁种

将转基因烟草播种与人工气候室中，繁种至t2代后，收取种子用于gus染色分析。

实施例4gus组织化学染色

将转sp5基因烟草种植于ms固体培养基中，待长至4片叶时将小苗移至液体培养基中，生长2天后进行盐、盐碱、干旱、低温及aba处理，干旱处理1天，其他处理均处理6小时。将处理好的烟草幼苗置于固定液（1%甲醛，50mm磷酸钠缓冲液ph7.0，0.05%tritonx-100）中，室温静置固定45-60min；然后用50mm，ph7.0的磷酸钠缓冲液漂洗2-3次，每次10-15min；加入x-gluc染色液浸没材料，盖上管盖，37℃避光保温过夜。弃去染色液，50mm，ph7.0磷酸钠缓冲液漂洗冲洗后，加入25%、50%、75%、90%、100%的梯度浓度乙醇分别浸泡1h进行脱色，体视显微镜下观察并拍照记录gus的表达情况。结果显示（图2）：sp5启动子驱动的gus基因在转基因烟草各组织中均有表达，且在盐、盐碱、干旱、aba以及低温处理下表达增强，其中低温胁迫下gus染色较深。这些结果说明sp5启动子为组成型启动子，且可以受盐、盐碱、干旱、低温以及aba处理诱导，尤其受低温胁迫诱导显著，适合作为利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品种的候选启动子。

实施例4gus组织化学染色及活性测定

（1）gus酶提取

1)将0.1g的转基因烟草材料置于研钵中，加入液氮研磨成粉末；

2)加入600µl的酶提取缓冲液，研磨成匀浆；

3)4℃，12000rpm离心10min，取上清，-20℃保存备用。

（2）bradford法测定gus提取液的蛋白含量

1）制作标准曲线：配置浓度0-100µg/ml的bsa梯度液（表1），与考马斯亮蓝g250按照1：5混匀，室温静置5min，595nm测量吸收值，以吸收值作纵坐标，蛋白浓度为横坐标做回归方程；

2)提取液蛋白含量的测定：取gus提取液20µl，加水至4ml，取出1ml，加入5ml考马斯亮蓝溶液混匀，595nm测量吸收值，根据回归方程计算样品中蛋白含量。

（3）荧光测定

1）制作标准曲线：配制10µm4-mu母液，用反应终止液将其稀释成依次为：62.5nmol/l，125nmol/l，250nmol/l，500nmol/l，1000nmol/l的浓度，用荧光分光光度计在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定各管荧光强度，制作一条标准曲线；

2）取6支1.5ml的离心管，各加入900µl的反应终止液，并编号；

3）取1支1.5ml的离心管，加入37℃预热的检测液2mmol/lmug1ml，根据测定蛋白的浓度加入适量的gus提取液，迅速充分混合，立即取出100µl加入1号管中，此时反应为0，严格计时；

4）反应管放入37℃水浴中进行酶反应，分别于5、10、15、30、60min时各取出100µl加入到900µl反应终止液，依次加入到2-6号管中混匀，分别为酶反应5、10、15、30、60min时的样品，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定各管荧光强度，并从标准曲线上读取2-6号管中4-mu的含量。

（4）gus酶活性计算

l)酶活力单位定义：每分钟水解4-mug生成1nmol或1mg、1µg、1ng4-mu的酶量为一个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力；

2)gus基因表达活性：以每毫克蛋白的酶活力来计算，每毫克蛋白每分钟催化生成1pmol4-mu作为gus的一个活力单位。

gus荧光检测的gus活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。荧光测定结果（图3）显示，未处理的转sp5基因烟草荧光值与aba胁迫处理相近，都较低；在盐、盐碱、干旱及低温处理下，转基因烟草的gus荧光值均有所提高，其中低温胁迫下提高的尤为显著。这就表明，sp5启动子是组成型启动子，并且能够在胁迫条件下驱动gus基因高表达而使对应的荧光值提高。

<110>吉林农业大学

<120>大豆低温诱导人工合成启动子sp5及应用

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