一种融合蛋白及光敏剂复合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于光动力治疗技术领域，尤其涉及一种融合蛋白及光敏剂复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

白血病干细胞是患者体内存在的一种比例极少的肿瘤细胞，是白血病发生、发展和耐药的根源。人il-3受体是由α和β亚基组成的异源二聚体，il-3受体α亚基(il-3rα、cd123)具有在急性髓性白血病(aml)干细胞中较高的表达量，而在正常造血干细胞表面不表达的特点，使其成为aml靶向治疗的重要靶点。

已有研究利用il-3在正常造血干细胞上不表达，而在aml干细胞中高表达的特点，设计以il-3为靶头的偶联药物，并在体内外体现出有很好的靶向性和治疗效果。有研究已经报道il-3和化疗药物达托霉素偶联形成的融合蛋白有更好的靶向性杀伤作用，明显降低了达托霉素单独使用时的毒副作用。但该融合蛋白基于化疗药物，系统毒性大。目前并没有一种毒性更小的il-3偶联药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种融合蛋白及光敏剂复合物及其制备方法和应用，为了提供一种水溶性好、粒径均一性好，且对il-3rα肿瘤细胞的主动靶向性高的光敏剂复合物，在体内外都显示出增强的肿瘤细胞杀伤能力，以及良好的生物相容性和安全性。

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括il-3和hsa，所述il-3和hsa通过五肽进行偶联。

优选的是，所述融合蛋白的序列如seqidno:11所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述融合蛋白的基因，所述基因序列如seqidno:4所示。

本发明还提供了上述技术方案所述融合蛋白的表达载体，所述表达载体为融合有上述技术方案所述基因的pcdna3.0载体。

本发明还提供了上述技术方案所述融合蛋白的表达系统，为哺乳动物真核表达系统。

优选的是，所述哺乳动物真核表达系统的宿主细胞为hek293细胞。

本发明还提供了一种光敏剂复合物，所述光敏剂复合物为ce6以非共价键结合到上述技术方案所述融合蛋白的hsa部分得到。

优选的是，所述光敏剂复合物的平均水化粒径为8.5nm。

本发明还提供了上述技术方案所述光敏复合物的制备方法，包括以下步骤：

在避光条件下，将上述技术方案所述融合蛋白与ce6溶液按照融合蛋白与ce6摩尔比为1：5混合，在旋转条件下反应14h，得到光敏复合物。

本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂复合物或上述技术方案所述制备方法得到的光敏剂复合物在制备靶向治疗急性髓性白血病药物中的应用。

本发明提供了一种融合蛋白、光敏剂复合物及所述光敏剂复合物的制备方法和应用。本发明提供的光敏剂复合物包括由il-3的c端和hsa的n端通过五肽连接而成的融合蛋白和以非共价键形式连接在所述融合蛋白的hsa部分的ce6。本发明的光敏剂复合物水溶性好、粒径均一性好，对il-3rα肿瘤细胞的主动靶向性更高，在体内外都显示出增强的肿瘤细胞杀伤能力，以及良好的生物安全性，所述光敏剂复合物在制备治疗急性髓性白血病药物中显示出很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的核酸电泳图：a：以人pbmc提取的mrna为模版，得到的pcr产物，m：marker，lane1：il-3，lane2：hsa；lane3：his-il-3-pa；b：重组载体pcdna3.0-his-il-3-pa的构建，m：marker，lane1：pmd-18t-his-il-3-pa的hindiii和bamhi双酶切，lane2：pcdna3.0的hindiii和bamhi双酶切；lane3：his-il-3-pa和pcdna3.0的酶连产物；c：重组载体pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa的构建，m：marker，lane1：pmd-18t-hsa的bamhi和noti双酶切，lane2：pcdna3.0-his-il-3-pa的bamhi和noti双酶切；lane3：hsa和pcdna3.0-his-il-3-pa的酶连产物；

图2为本发明实施例1提供的表达载体pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa的构建流程图；

图3为本发明实施例2提供的wb验证融合蛋白的正确表达：

a、b、c分别是用抗his、抗人il-3、抗hsa抗体检测，其中lane1为转染空载体pcdna3.0的hek293上清；lane2为转染表达载体pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa的hek293上清；

图4为本发明实施例3提供的sds-page检测融合蛋白的表达：

m为marker，lane1为酶切前的ni柱纯化产物；lane2为酶切后的ni柱纯化产物；

图5为本发明实施例3提供的wb验证融合蛋白的纯化；

a、b、c分别是用抗his、抗人il-3、抗hsa抗体检测，其中，lane1为酶切前的ni柱纯化产物；

lane2酶切后的ni柱纯化产物；

图6为本发明实施例5提供的il-3-hsa-ce6、hsa、ce6的荧光激发发射光谱测定；

图7为本发明实施例6提供的dls法检测il-3-hsa-ce6、ce6的水化粒径；

图8为本发明实施例7提供的il-3-hsa-ce6和ce6的单线态氧产量测定；

图9为本发明实施例8提供的流式检测各细胞表面的il-3rα的表达量；

图10为本发明实施例9提供的il-3-hsa-ce6和ce6的细胞摄取量测定；

图11为本发明实施例10提供的mtt检测il-3-hsa-ce6和ce6对各个细胞的pdt毒性；

图12为本发明实施例11提供的il-3-hsa-ce6和ce6对aml模型鼠体内pdt疗效检测。

具体实施方式

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括il-3和hsa，所述il-3的c端和hsa的n端通过五肽连接。在本发明中，所述五肽的氨基酸序列为papap。

具体的，所述融合蛋白的序列如seqidno:11所示，具体序列如下：kapmtqttplktswvncsnmideiithlkqpplplldfnnlngedqdilmennlrrpnleafnravkslqnasaiesilknllpclplataaptrhpihikdgdwnefrrkltfylktlenaqaqqttlslaifpapapgskwvtfisllflfssaysrgvfrrdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktykttlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasraalgl。

本发明对所述il-3和hsa基因的获得方式没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的il-3和hsa基因的常规获得方法即可，如从人外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)中提取的mrna为模板，设计特异性引物，获得人il-3和hsa的cdna序列。在本发明中，所述融合蛋白il-3-hsa优选通过重叠pcr反应获得。本发明对所述提取的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的从mrna中扩增基因片断的常规方法即可。本发明对所述特异性引物的获得方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的引物合成公司进行引物的合成即可。本发明对所述重叠pcr反应的条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的用于基因连接的重叠pcr反应条件即可。

本发明还提供了编码上述技术方案所述融合蛋白的基因，所述基因序列如seqidno:4所示，具体序列如下：

aagcttatgcaccaccaccatcatcatgacgatgacgataaggctcccatgacccagacaacgcccttgaagacaagctgggttaactgctctaacatgatcgatgaaattataacacacttaaagcagccacctttgcctttgctggacttcaacaacctcaatggggaagaccaagacattctgatggaaaataaccttcgaaggccaaacctggaggcattcaacagggctgtcaagagtttacagaacgcatcagcaattgagagcattcttaaaaatctcctgccatgtctgcccctggccacggccgcacccacgcgacatccaatccatatcaaggacggtgactggaatgaattccggaggaaactgacgttctatctgaaaacccttgagaatgcgcaggctcaacagacgactttgagcctcgcgatctttcctgctccagctccaggatccaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttagtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttctatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaggctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagaggctcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatataaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagcttgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcgagctgccttaggcttataagcggccgc。

本发明还提供了上述技术方案所述融合蛋白的表达载体，所述表达载体为融合有上述技术方案所述基因的pcdna3.0载体。在本发明中，所述表达载体构建过程中，优选在il-3-hsa序列的5’端添加his标签和酶切位点。在本发明中，所述酶切位点优选为肠激酶酶切位点，相应的酶为肠激酶。

本发明还提供了上述技术方案所述融合蛋白的表达系统，为哺乳动物真核表达系统。在本发明中，所述表达系统用表达宿主细胞优选为hek293细胞。本发明对所述hek293细胞的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的hek293细胞常规市售产品即可。

本发明在所述表达系统表达得到蛋白后，优选对所述蛋白进行纯化，得到上述技术方案所述融合蛋白；本发明对所述融合蛋白的纯化方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的镍柱纯化方法即可。为了去除hek293细胞表达的融合蛋白的his标签，所述纯化过程优选依次包括：镍柱吸附，酶切，镍柱再吸附，得到蛋白序列如seqidno:11所示的融合蛋白。在本发明中，所述融合蛋白以单体形式存在，不会发生聚集或形成胶体。

本发明还提供了一种光敏剂复合物，所述光敏剂复合物为ce6以非共价键结合到上述技术方案所述融合蛋白的hsa部分得到。本发明的光敏剂复合物溶解度高，减少了光敏剂复合物在水或生理溶液中发生聚集产生沉淀和光漂白的几率。在本发明中，所述光敏剂复合物(il-3-hsa-ce6)和游离的光敏剂ce6在特定激发波长下有相似的ros产量。在本发明中，所述光敏剂复合物保留了ce6对肿瘤细胞的被动靶向性，同时，对表面表达il-3rα分子的aml细胞还具有主动靶向性，具体表现为，在表达il-3rα的aml细胞中，il-3-hsa-ce6复合物有更高的细胞摄取量；在表达il-3rα的aml细胞中，il-3-hsa-ce6复合物有更强的细胞毒性。

等摩尔量的il-3-hsa-ce6和ce6具有相同的单线态氧产量，光敏剂复合物il-3-hsa-ce6保留了ce6的光动力学性质。本发明的光敏剂复合物在等摩尔量的情况下能更多的聚集在表面表达il-3rα的细胞内，具有更好的靶向性。在本发明中，所述光敏剂复合物对表达il-3rα的细胞系和来自aml患者的pbmc都有更强度细胞毒性，对于不表达il-3rα的细胞也有相似的细胞毒性；对于正常人pbmc几乎没有细胞毒性。相比于ce6，相同剂量(质量浓度)的光敏剂复合物有更强的pdt治疗效果。

在本发明中，所述光敏剂复合物的平均水化粒径为8.5nm。

本发明还提供了上述技术方案所述光敏复合物的制备方法，包括以下步骤：

在避光条件下，将上述技术方案所述融合蛋白与ce6溶液按照融合蛋白与ce6摩尔比为1：5混合，在旋转条件下反应14h，得到光敏复合物。

在本发明中，所述光敏剂复合物的制备在避光条件下进行，本发明配制的ce6溶液时，优选将ce6溶解于双蒸水中，滴加naoh使ce6完全溶解，加hcl将ph调节为7.5～8。本发明对所述氢氧化钠和hcl的浓度没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的ph值调节用氢氧化钠和hcl的常规浓度即可。在本发明中，所述ce6溶液的浓度优选为1～7mg/ml，优选的为4mg/ml。

得到ce6溶液后，本发明优选将il-3-hsa和ce6溶液按照il-3-hsa和ce6的摩尔比为1：5溶于pbs溶液中，室温旋转反应14h。本发明对所述pbs溶液没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的pbs溶液即可。在本发明中，所述旋转的转速优选为50～160rpm，更优选为80rpm。在本发明中，每0.1～0.2g融合蛋白优选溶于80～100ml的pbs，更优选溶于95mlpbs。

本发明旋转反应14h后，优选将得到的产物进行超滤，除去游离的ce6，所述超滤膜的截留分子量优选为50kda。

本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂复合物或上述技术方案所述制备方法得到的光敏剂复合物在制备靶向治疗急性髓性白血病药物中的应用。

本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物剂型即可。在本发明中，所述药物的剂型优选为冻干粉末，优选采用生理盐水在避光条件下溶解，所述药物的浓度优选为5～10mg/ml。

下面结合具体实施例对本发明提供的一种抗cd33单链抗体及光敏剂复合物及其制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

重组表达载体的构建

1)通过提取人外周血，分离其中的pbmc，利用逆转录试剂盒提取其中的mrna，设计引物：

2)il-3s、il-3a作为上下游引物，得到表达il-3的cdna(如seqidno:1所示)；hsas、hsaa作为上下游引物，得到表达hsa的cdna(如seqidno:2所示)；以he、te作为上下游引物，以得到的il-3的cdna为模版，在其基础上，于5端添加6×his标签和肠激酶酶切位点，于3端添加由5个氨基酸组成的刚性肽(papap)(如seqidno:3所示)，记为his-il-3-pa(如seqidno:4所示)，结果如图1a所示。

各引物对应的序列编号如表1所示：

表1引物序列表

3)将pcr得到的序列：hsa和his-il-3-pa，分别连接入pmd-18t载体，进行t-a克隆，依次得到相应的重组克隆载体：/pmd-18t-hsa；pmd-18t-his-il-3-pa。分别将这2个载体转化入dh5α，经菌落pcr验证，筛选阳性克隆并进行dna测序，分别得到序列正确的菌株：dh5α/pmd-18t-hsa；dh5α/pmd-18t-his-il-3-pa。

4)将质粒pmd-18t-his-il-3-pa和pcdna3.0用hindiii和bamhi双酶切，随后酶连，得到重组表达载体：pcdna3.0-his-il-3-pa，结果如图1b所示。

5)将质粒pmd-18t-hsa和重组表达载体pcdna3.0-his-il-3-pa用bamhi和noti双酶切，随后酶连，得到最终的重组表达载体：pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa，结果如图1c所示。

以上构建流程见图2。

实施例2

瞬时转染验证融合蛋白的表达

将重组表达载体pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa通过pei法转染入hek293中进行瞬时表达，

转染48h后，取上清分别用抗his、hsa、il-3的抗体进行wb验证，证明目的蛋白能以分泌的形式正确表达，结果如图3所示。

实施例3

融合蛋白的纯化

1)将对数期的hek293细胞消化，然后按10⁶个细胞/皿，铺20个皿。

2)于37℃，5％co2的条件下培养72h，将重组表达载体pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa利用pei法瞬时转染。

3)收集转染后72h的表达上清，3000rpm，5min离心，将上清过0.22um滤膜后，通过ni柱纯化，纯化步骤如下：

①平衡：用10倍体积的平衡缓冲液平衡ni柱，流速：1ml/min。

②上样：将细胞培养上清进行ni柱上样，流速：0.5ml/min。

③洗涤：用至少10倍体积的平衡缓冲液洗涤ni柱至基线，流速：1ml/min。

④洗脱：依次用咪唑浓度为10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、500mm的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱15倍体积。

4)洗脱产物经sds-page验证，确定含有目的蛋白的洗脱组分。将含有目的蛋白的组分合并，置于透析袋中，用1lpbs透析3次，每次12h。

5)由于得到的产物中其5端的his标签后面含有一个肠激酶酶切位点，可以用重组肠激酶切除his标签。

6)得到的透析液中按100iu/ml加入含his标签的重组肠激酶，于37℃反应16h。

7)反应产物再次经ni柱吸附，收集流出液，去除含his标签的重组肠激酶和切除下来的his标签，流出液利用超滤管(wmco：50kda)，超滤3次得到浓缩液，得到浓缩的产物经sds-page和wb验证，结果如图4和图5所示。得到的最终il-3-hsa融合蛋白序列如seqidno:11所示。

实施例4

ce6装载反应

1)配制ce6溶液母液(1mg/ml)：称取35mgce6溶解于7mlddh2o中，滴加1m的naoh溶液全部溶解ce6，加入hcl调节ph至7.5-8，再用ddh2o定容至35ml，制备过程全程避光，配制完后溶液避光保存。

2)在避光条件下，称取0.174g融合蛋白il-3-hsa溶于94ml的pbs中，然后加入6mlce6溶液母液，(il-3-hsa和ce6的摩尔比为1：5)，并在室温条件下，旋转反应14h。

3)采用超滤法，将上述反应产物于超滤管(wmco：50kda)中，超滤3次，去除游离的ce6，得到复合物il-3-hsa-ce6。

实施例5

荧光激发发射光谱测定

由于ce6的最大激发波长和最大发射波长分别为671nm和715nm，hsa的最大激发波长和最大发射波长分别为280nm和443nm。同等浓度(10μm)的il-3-hsa-ce6、hsa、ce6在280nm波长的激发下，检测发射光谱，

结果如图6所示：可以看出，ce6和hsa分别在715nm和443nm处出现特征单发射峰，而复合物il-3-hsa-ce6在在715nm和443nm两处出现双发射峰。说明复合物il-3-hsa-ce6是由il-3-hsa和ce6两部分组成的。

实施例6

dls法检测粒径

将合成的溶解于pbs，得到浓度为1mg/ml的溶液。应用动态光散射仪(dls)，测得化合物平均水化粒径。

结果如图7显示，il-3-hsa融合蛋白的水化粒径平均值为7.5nm，而il-3-hsa-ce6复合物的水化粒径平均值为8.5nm，并且该复合物的水化粒径均一性好，在水中有很好的分散度，没有出现任何胶状物或沉淀物。说明，由于装载了ce6后，复合物的构象改变，粒径变大。而这种装载只是在单个il-3-hsa分子水平上的，不会发生沉淀，或相互聚集产生胶体。

实施例7

单线态氧释放实验

利用rno脱色反应检测单线态氧的释放量，具体步骤如下。

1)将rno溶于重水(d2o)，配成终浓度为250μm的溶液a。

2)将组氨酸溶于重水(d2o)，配成终浓度为0.03m的溶液b。

3)将溶液a和溶液b按体积比1：3混合，得到溶液c。

4)6.67μm游离的ce6溶解在700μl含有1％dmso的重水中，随后加入400μl溶液c，将混合溶液置于石英皿中，立刻检测440nm处的发光强度，记为初始发光强度。

5)用波长为671nm、强度为6j/cm²的光源照射上述石英皿中的溶液30min。并且在此期间，每隔2min检测440nm的发光强度。每个时间点的单线态氧产量的比例为：(初始发光强度-该时间点的发光强度)/初始发光强度×100％。

6)以时间为横坐标，以该时间点的单线态氧产量比例为纵坐标，得到单线态氧产量曲线。

7)用同样的方法检测等摩尔il-3-hsa-ce6在各个时间点的单线态氧产量。

结果如图8所示，可以看出，il-3-hsa-ce6和游离的ce6在671nm的激发下，都能逐步产生单线态氧，且产量基本一致，都随时间的延长而增加，说明il-3-hsa-ce6复合物没有影响其中ce6的产生单线态氧的能力。

实施例8

检测各细胞表面il-3rα表达量

利用流式方法，取10⁵个对数生长期的细胞，离心，细胞沉淀重悬于500μl带有pe荧光标签的鼠抗人il-3rα抗体中，另用500μl带有pe荧光标签的同型抗体作对照，检测kg-1a、tf-1、k562细胞表面的il-3rα表达量。

取2名急性髓性白血病(aml)患者和1名健康者的血液100ml，ficoll淋巴细胞分离液分离其中的pbmc，采用相同的方法检测其中il-3r的表达量。

流式结果见如图9，结果显示，il-3rα在kg-1a细胞中的表达量最高，几乎为100％，其次为tf-1细胞，表达量约为75％，k562细胞表面几乎不表达。aml患者1和患者2中分别有70％的il-3rα表达量，而il-3rα在正常人血pbmc中没有表达。

实施例9

细胞摄取量测试

1)收集pbs洗涤后的5×10⁷个对数生长期的tf-1细胞，3000rpm离心5min，得到细胞沉淀，加入1ml细胞裂解液(0.1mnaoh,1％sds)，得到细胞裂解产物。

2)将10μl不同剂量的il-3-hsa-ce6，加入100μl上述细胞裂解产物中，依次得到il-3-hsa-ce6终浓度为0.1μm、1μml、5μm、10μm、20μm的裂解液混合物。

3)于671nm的激发波长下，检测715nm处相应浓度的吸光度数值，得到吸光值与il-3-hsa-ce6浓度的关系。

4)采用同样的方法，得到ce6的吸光值与浓度的关系。

5)将处于对数生长期的tf-1细胞铺于6孔板的6个孔中，1×10⁶细胞/孔。

6)24h后，更换新鲜培养基，加入用pbs稀释的光敏剂il-3-hsa-ce6和ce6至终浓度为1μm，再孵育0h、1h、2h、4h、8h、16h。

7)到取样时间点时，将对应孔中的细胞悬液移至一干净ep管，3000rpm离心5min，得到细胞沉淀，经pbs洗涤2次后，加入100ul细胞裂解液(0.1mnaoh,1％sds)，获得均匀的细胞裂解产物，

8)细胞裂解产物于671nm的激发波长下，检测715nm发射波长处的吸光度数值，再根据前面得到的吸光值与浓度的关系，转换为光敏剂复合物il-3-hsa-ce6或光敏剂ce6的含量。

9)将k562细胞、人新鲜pbmc细胞也按上述方法进行细胞摄取量的测试。

10)以孵育的时间为横坐标，以相应的il-3-hsa-ce6或ce6的含量为纵坐标，得到上述3个细胞的细胞摄取量曲线。

结果见图10，在il-3rα表达的tf-1细胞中，il-3-hsa-ce6的细胞摄取量显著高于ce6，且呈很好的时间依赖性，而单纯的ce6在4h的细胞摄取量即达到饱和，不再变化。

在il-3不表达的k562细胞中，il-3-hsa-ce6的细胞摄取量略高于ce6，时间依赖性不明显。

在人新鲜pbmc细胞中，il-3-hsa-ce6和ce6的细胞摄取量都很低，没有时间依赖性。

实施例10

mtt检测细胞毒性

1)将处于对数生长期的kg-1a细胞、tf-1细胞、k562细胞、2名急性髓性白血病患者的pbmc和1名健康者的pbmc重悬于1640+10％fbs培养基，铺96孔板，1×10⁴细胞/孔。

2)培养24h后，换成无血清的1640培养基，每个细胞分为3组，每组3复孔，分别加入pbs、ce6(终浓度为5ug/ml)、il-3-hsa-ce6(等摩尔量的ce6，终浓度为150ug/ml)。

3)于培养箱中避光温育1h后，换成新鲜的1640+10％fbs培养基，100μl/孔，进行671nm波长光照射，光照时间为10min，光照能量为9j/cm²。此后，再于培养箱中避光培养24h。

4)每孔加入11μlmtt溶液(5mg/ml)，孵育4h，3000rpm离心5min，弃上清，每孔加入dmso200μl溶解甲臜，于酶标仪570nm处检测吸光度。细胞抑制率(％)＝1-实验组吸光度值/对照组吸光度值×100％。

结果如图11所示，

相比于游离的光敏剂ce6，光敏剂复合物il-3-hsa-ce6对表面il-3rα有一定表达量的肿瘤细胞(kg-1a、tf-1)有更强的杀伤能力；同时，对于表面不表达il-3rα的肿瘤细胞(k562)也有相同的杀伤效果。

对于2例不同程度il-3rα表达的aml患者的pbmc，光敏剂复合物il-3-hsa-ce6也显示出比游离的ce6更好的杀伤效果。

对于正常人pbmc，游离的ce6有很轻微的细胞毒性，而光敏剂复合物il-3-hsa-ce6几乎没有显示出细胞毒性。

实施例11

体内实验评价pdt效果：

1)将kg-1a细胞，经尾静脉植入9只scid鼠(雌性，4周龄)体内，每只鼠植入7×10⁷个细胞，进行aml造模。一周后，将鼠分为3组，3只/组。通过尾静脉分别注射ce6(2.5mg/kg)、il-3-hsa-ce6复合物(2.5mg/kg)，以及等体积的pbs，避光培养1天。

2)1天后，在暗室中进行pdt治疗，采用埋针法：将鼠尾固定于37℃的恒温版上，采用浸润肝素溶液(250mg/ml)的g24留置针(直径0.75mm)穿刺入小鼠尾静脉中，

3)随后将碘酒消毒的光导纤维(直径0.5mm)伸进留置针内，光导纤维的另一端连接血液内照射ne-he激光治疗仪，发光功率：9j/cm²。

4)每隔一小时，重新将g24留置针和配套的光导纤维沿尾静脉的近心端方向换一个部位穿刺，一共进行3h的激光照射治疗，期间，使鼠尾保持静止固定状态。

5)将以上小鼠处死后，解剖剥离出双侧股骨，将股骨减断后，抽取其中的骨髓，利用ficoll淋巴细胞分离液，分离得到其中的骨髓细胞。

6)利用带pe标签的鼠抗人il-3rα的抗体，流式检测其中各组骨髓中表达il-3rα的细胞比例，计算平均值。

结果如图12所示，由于植入的kg-1a细胞表面高丰度表达人il-3rα蛋白，而scid鼠本身细胞表面没有il-3rα分子，因而骨髓中il-3rα的细胞所占比例反应了治疗效果。

可以看出，pbs组中，表达il-3rα细胞所占比例最高，约为55％，而在ce6治疗组中，这个比例下降为20％左右，在il-3-hsa-ce6治疗组中，比例更低，为10％左右。因此，相比于单纯的ce6，il-3-hsa-ce6复合物在体内能更有效地清除aml细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>李斯文

<120>一种融合蛋白及光敏剂复合物及其制备方法和应用

<130>2017

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

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