牛PDHB基因过表达重组腺病毒载体构建及包装方法与流程

本发明属于重组腺病毒载体技术领域，尤其涉及一种牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体构建方法。

背景技术：

牛丙酮酸脱氢酶β亚基(pyruvatedehydrogenaseβsubunit，pdhb)基因催化丙酮酸成为乙酰辅酶a(acetyl-coa)，是将糖酵解和三羧酸循环代谢途径连接起来的关键酶。研究表明pdhb基因的表达水平与肌内脂肪(imf)含量成正相关。而对基因的功能研究，主要采用过表达技术。目前，将外源基因导入真核细胞表达的载体主要有两类。一类是非病毒表达载体系统，常见的为pcdna3.1(±)非融合性真核细胞表达载体，其优点是安全性高、毒性小、外源基因长度不受限制，缺点为效率较低，在细胞中属于瞬时表达，表达时间较短。另一类是病毒表达载体系统，常见的有慢病毒(属于逆转录病毒)表达载体系统和腺病毒表达载体系统。慢病毒表达载体系统的优点是可将外源基因整合到靶细胞基因组，持久稳定地表达外源基因，缺点为可引起人获得性免疫缺陷症，因此对实验室的安全级别要求较高。腺病毒表达载体系统的优点是产生的病毒颗粒比较稳定，装载量大(可插入约10kb的外源基因)，对人的致病性低，且能将外源基因在靶细胞中持续表达10d以上。本发明中使用的adeasy腺病毒表达载体已在基因的功能研究中广泛应用。秦川牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体的构建及其包装对进一步在牛肌内前体脂肪细胞分化过程中的作用机制具有重要意义。

综上所述，现有技术存在的问题是：瞬时表达载体构建容易，但存在在原代细胞中转染难度大，表达时间短等问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体构建方法。

本发明是这样实现的，一种秦川牛pdhb基因重组腺病毒载体，所述秦川牛pdhb基因重组腺病毒载体的序列为：genbank:ay370909.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay370909.2)。

本发明的另一目的在于提供一种所述牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体构建方法，所述牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体构建方法包括以下步骤：

步骤一，根据牛pdhb基因mrna序列设计引物，克隆该基因的编码区序列；

步骤二，测序验证后将其重组到穿梭载体padtrack-cmv上，经pmeⅰ线性化后，转化到含有padeasy-1腺病毒骨架载体的e.colibj5183感受态细胞中进行同源重组，以获得重组质粒pad-pdhb；

步骤三，再将经pacⅰ酶切线性化的pad-pdhb转染到hek293a细胞中，进行病毒包装并扩增高滴度病毒ad-pdhb，绿色荧光蛋白标记法测定病毒滴度；

步骤四，将高浓度的ad-pdhb病毒感染牛肌内前体脂肪细胞，实时荧光定量pcr检测pdhb的表达量。

进一步，所述引物序列为pdhb-f：agatggcggtggttgctgtg；pdhb-r：attaaaaggtcttatgggat，pcr产物大小为1166bp。

进一步，所述pcr以肌肉cdna为模板，用kod高保真dna聚合酶扩增牛pdhb基因，pcr反应体系为：模板1.2μl,引物f/r各0.6μl，kod酶0.4μl，10×buffer2.0μl，dntpmix2.0μl，mg²⁺2.0μl，ddh2o12.0μl；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min10s，共35个循环；72℃终止反应10min。

进一步，将pgmt-pdhb重组质粒和padtrack-cmv穿梭质粒分别用限制性内切酶kpni和noti进行双酶切，回收目的片段后用t4连接酶进行连接，转化到后top10-gold感受态细胞后挑取padtrack-cmv-pdhb阳性克隆扩繁获取菌液，提取质粒后双酶切鉴定。

进一步，将padtrack-cmv-pdhb重组质粒用pmeⅰ线性化后，酶切产物转化到含有骨架载体padeasy-1的e.colibj5183感受态细胞；挑取pad-pdhb阳性克隆，摇菌后提取质粒；用pacⅰ对重组腺病毒质粒pad-pdhb进行酶切鉴定，将重组质粒转化、涂板、挑取单克隆、菌液鉴定后送测序验证。

本发明的优点及积极效果为：通过构建秦川牛丙酮酸脱氢酶β亚基(pyruvatedehydrogenaseβsubunit，pdhb)基因的重组腺病毒载体，为pdhb基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能做准备。经测序验证，本发明克隆获得的牛pdhb基因cds与数据库genbank收录的序列一致，将pdhb基因cds与穿梭载体padtrack-cmv重组并转染hek293a细胞后成功获得了重组腺病毒ad-pdhb，其滴度为1.66×10⁹pfu·ml^-1。腺病毒ad-pdhb侵染牛肌内前体脂肪细胞后，pdhb在mrna的表达水平比对照组高25.5倍。

本发明成功克隆了秦川牛pdhb基因并构建了重组腺病毒质粒pad-pdhb，并获得能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达pdhb基因的高滴度重组腺病毒ad-pdhb。本发明通过构建腺病毒过表达载体，持续稳定地表达pdhb基因。本发明采用秦川牛背最长肌组织作为实验材料，克隆秦川牛pdhb基因。利用adeasy-1系统构建牛pdhb基因的高滴度重组腺病毒，从而能够持续稳定的表达该基因。为研究该基因在牛肌内前体脂肪细胞中过表达后，对细胞分化的影响提供实验基础。本发明通过构建牛pdhb基因的腺病毒过表达载体系统，为检测pdhb基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的作用奠定实验基础；成功构建了秦川牛pdhb基因的重组腺病毒表达载体，重组腺病毒ad-pdhb能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达pdhb基因。

附图说明

图1是本发明实施例提供的牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的牛pdhb基因的克隆示意图；

图中：m:dl2000dnamarker；1-2:pdhb基因pcr产物。

图3是本发明实施例提供的牛pdhb基因的亚克隆示意图；

图中：m:dl2000dnamarker；1:pdhb基因cds序列pcr产物。

图4是本发明实施例提供的padtrack-cmv-pdhb质粒的双酶切鉴定示意图；

图中：m:trans2kplusiidnamarke；1:双酶切产物。

图5是本发明实施例提供的腺病毒重组质粒pad-pdhb酶切鉴定示意图；

图中：m:λ-hindⅲdigestmarker；1:pacⅰ酶切产物。

图6是本发明实施例提供的重组腺病毒ad-pdhb的包装示意图。

图7是本发明实施例提供的重组腺病毒ad-pdhb感染牛肌内前体脂肪细胞示意图；

图中：a:重组腺病毒ad-pdhb；b:对照组ad-egfp；c:空白对照。

图8是本发明实施例提供的牛pdhb基因在感染48h的相对表达水平示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的秦川牛pdhb基因重组腺病毒载体的序列为：genbank:ay370909.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay370909.2)。

如图1所示，本发明实施例提供的牛pdhb基因过表达重组腺病毒载体构建方法包括以下步骤：

s101：根据牛pdhb基因mrna序列(genbankaccessionno.nm_001035435)设计引物，克隆该基因的编码区(codingsequence,cds)序列；

s102：测序验证后将其重组到穿梭载体padtrack-cmv上，经pmeⅰ线性化后，转化到含有padeasy-1腺病毒骨架载体的e.colibj5183感受态细胞中进行同源重组，以获得重组质粒pad-pdhb；

s103：再将经pacⅰ酶切线性化的pad-pdhb转染到hek293a细胞中，进行病毒包装并扩增高滴度病毒ad-pdhb，绿色荧光蛋白(gfp)标记法测定病毒滴度；

s104：将高浓度的ad-pdhb病毒感染牛肌内前体脂肪细胞，实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测pdhb的表达量。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1材料

本实验用到的cdna是以24月龄秦川公牛背最长肌提取rna后反转录而来的(由本实验室保存)；腺病毒穿梭载体padtrack-cmv、含有骨架载体padeasy-1的e.colibj5183菌株、hek293a细胞均由本实验室保存；琼脂糖、脂质体lipofectamintm2000、dmem培养基、胎牛血清fbs、胰蛋白酶trypsin0.25％edta均购自美国invitrogen公司；top10-gold感受态细胞、质粒小提中量抽提试剂盒、无内毒素大提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；trans2kplusiidnamarker购自北京全式金生物公司；pgem-t载体、dnat4连接酶购自promega公司；dl2000marker、λ-hindⅲdigestmarker、kod高保真dna聚合酶、荧光定量pcr试剂盒、限制性内切酶pmeⅰ、pacⅰ、kpni和noti均购自大连宝生物(takara)公司；dna引物合成和测序均由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。

1.2方法

1.2.1秦川牛pdhb基因的克隆

根据牛pdhb基因mrna(genbankaccessionno.nm_001035435)序列，用primer5.0软件设计引物。引物序列为pdhb-f：agatggcggtggttgctgtg；pdhb-r：attaaaaggtcttatgggat，pcr产物大小为1166bp。以肌肉cdna为模板，用kod高保真dna聚合酶扩增牛pdhb基因，pcr反应体系(20μl)为：模板1.2μl,引物f/r(10μm)各0.6μl，kod酶0.4μl，10×buffer2.0μl，dntpmix2.0μl，mg²⁺2.0μl，ddh2o12.0μl。反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min10s，共35个循环；72℃终止反应10min。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将pcr产物经dna片段回收试剂盒纯化后连接到pgem-t载体，进而转化到top10-gold感受态细胞。挑取阳性克隆扩繁获取菌液，菌液pcr鉴定正确后送测序进行验证。以测序正确的菌液为模板，引物序列为gpdhb-f：ggggtaccagatggcggtggttgctgtg；gpdhb-r：ataagaatgcggccgcattaaaaggtcttatgggat(小写字母分别为引人的kpni和noti酶切位点)，进行亚克隆牛pdhb基因的cds序列，pcr产物大小为1080bp。pcr反应体系同前。反应条件退火温度为62℃，其余条件也同前。pcr产物纯化后连接到pgem-t载体，转化后挑取pgmt-pdhb阳性克隆扩繁获取菌液，菌液pcr鉴定正确后送测序进行验证。

1.2.2腺病毒ad-pdhb的构建及鉴定

1.2.2.1重组穿梭质粒padtrack-cmv-pdhb的构建及鉴定

将pgmt-pdhb重组质粒和padtrack-cmv穿梭质粒分别用限制性内切酶kpni和noti进行双酶切，回收目的片段后用t4连接酶进行连接，转化到后top10-gold感受态细胞后挑取padtrack-cmv-pdhb阳性克隆扩繁获取菌液，提取质粒后双酶切鉴定。

1.2.2.2重组腺病毒质粒pad-pdhb的构建及鉴定

将padtrack-cmv-pdhb重组质粒用pmeⅰ线性化后，酶切产物转化到含有骨架载体padeasy-1的e.colibj5183感受态细胞。挑取pad-pdhb阳性克隆，摇菌后提取质粒。用pacⅰ对重组腺病毒质粒pad-pdhb进行酶切鉴定，将重组质粒转化、涂板、挑取单克隆、菌液鉴定后送测序验证。

1.2.2.3腺病毒ad-pdhb的包装、扩增及滴度测定

取5μg无内毒素试剂盒提取重组腺病毒质粒pad-pdhb，用pacⅰ酶切后回收大片段。当hek293a细胞生长到80％左右时，按脂质体lipofectamin^tm2000说明书2μg质粒/孔转染，进行重组腺病毒ad-pdhb包装。将细胞置于含5％co2的37℃培养箱中孵育6h后换液，待细胞长满培养皿，将细胞传代于25cm²细胞培养皿中。每天观察绿色荧光蛋白(gfp)的表达，待细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察出毒迹象，即细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落。转染12-14d后，当出现明显的细胞病变反应，且有50％以上细胞从培养瓶壁脱落后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10，000g离心10min，收集病毒上清，即为第一代病毒母液p1。将p1病毒再次感染hek293a细胞，感染48h后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10，000g离心10min收集病毒上清，标记为p2。同样方法用p2代病毒感染大量的hek293a细胞扩增病毒至p3代。取200μl的p3代病毒沸水孵育10min后立即冰浴，短暂离心后取上清用于pcr鉴定模板。pcr鉴定反应体系和条件同1.2.1。将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白(gfp)标记法测定病毒滴度的方法。

1.2.3重组腺病毒ad-pdhb的活性鉴定

当牛肌内前体脂肪细胞生长到80％左右时，分别侵染高滴度病毒ad-pdhb和ad-egfp。侵染48h后观察绿色荧光表情况，收集细胞提取总rna，实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测检测pdhb基因的表达情况。定量引物为pdhb-rt-f：tctgagatgggctttgctgg，pdhb-rt-r：tgacctggtcgatggcttgc，pcr产物大小为109bp。以牛gapdh基因(accessionno.nm_001034034)作为内参，引物为：gapdh-rt-f：ccaacgtgtctgttgtggat，gapdh-rt-r：ctgcttcaccaccttcttga，pcr产物大小为80bp。

2结果

2.1秦川牛pdhb基因的克隆及鉴定

通过克隆获得条带单一的pcr产物大小为1166bp(图2)，胶回收后连接到pgm-t载体，经测序验证，目的基因与数据库genbank收录的序列一致。设计带酶切位点的引物，进行亚克隆获得1080bp的条带单一的pcr产物(图3)，即为牛pdhb基因的cds序列，胶回收后连接到pgm-t载体，进一步测序验证无误。说明牛pdhb基因克隆成功，可进行下一步实验。

2.2重组穿梭质粒padtrack-cmv-pdhb的鉴定

限制性内切酶kpni和noti双酶切padtrack-cmv-pdhb质粒，得到大小分别约为9kb和1kb的两条条带(图4)，符合预期。说明重组穿梭质粒padtrack-cmv-pdhb构建成功，可与腺病毒骨架载体重组。

2.3腺病毒重组质粒pad-pdhb的鉴定

将经pmeⅰ酶切线性化的穿梭质粒padtrack-cmv-pdhb转化到含有padeasy-1的e.colibj5183感受态。提取质粒后pacⅰ酶切鉴定，电泳检测到两条大小分别约为30和4.5kb(图5)的电泳条带，初步证明腺病毒重组质粒pad-pdhb重组成功。后经测序验证，表明pad-pdhb重组成功，可进行下一步的腺病毒包装实验。

2.4腺病毒ad-pdhb的包装、扩繁及滴度测定

将经pacⅰ酶切线性化后的30kb左右的大片段胶回收后，转染hek293a细胞。转染24h，ad-pdhb在荧光显微镜下已能看到少量细胞开始出现绿色荧光；10d时，绿色荧光数明显增多，视野变亮并在局部出现葡萄串样荧光聚集,呈彗星状；13d时，绿色荧光铺满整个视野，大量细胞病变脱落，出现明显的空斑(图6)。而空白对照组ad-egfp,转染24h时也出现绿色荧光；7d时，呈现彗星状；11d时，大量细胞病变脱落，出现明显的空斑(图6)。反复感染hek293a细胞3次后获得高滴度病毒。滴度病毒用绿色荧光蛋白(gfp)标记法测定病毒滴度，滴度为1.66×10⁹pfu·ml^-1。

2.5病毒活性鉴定

重组腺病毒ad-pdhb感染牛肌内前体脂肪细胞48h后，观察到大量的绿色荧光(图7)，表明病毒感染效率较高。收集细胞后，实时荧光定量pcr检测结果表明感染腺病毒ad-pdhb的pdhb基因表达量比对照组ad-egfp高25.5倍(图8)。

本发明首先通过设计特异引物，将牛pdhb基因克隆出来，然后再通过设计带酶切位点的引物进行亚克隆获得牛pdhb基因的cds区，采用此方法可以有效提高克隆的效率。

本发明通过构建牛pdhb基因的腺病毒过表达载体系统，为检测pdhb基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的作用奠定实验基础；成功构建了秦川牛pdhb基因的重组腺病毒表达载体，重组腺病毒ad-pdhb能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达pdhb基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。