一种丁二酮高产乳酸菌的高通量筛选方法与流程

本发明属于微生物学领域，涉及一种乳酸菌，具体来说是一种丁二酮高产乳酸菌的高通量筛选方法。
背景技术：
：丁二酮，又称双乙酰(2，3-butanedione，c4h6o2)，外观为黄色油状液体，具有很强的奶油香味。丁二酮用途广泛，市场容量大，主要用作奶油、人造奶油、干酪的增香剂等。在发酵乳制品的风味中，丁二酮被认为是起作用的重要化合物之一，当其浓度达到lmg/l时，人们就能感受到发酵乳的特有香味。在生产中，通常通过外源添加或提高内源产生来改善发酵乳的风味。发酵乳中的丁二酮主要是通过外源添加的，其主要是通过化学方法合成、天然提取法和微生物发酵法等方法制备。用化学方法合成丁二酮污染严重，而且产品的安全性差，品质不稳定。在自然界中，丁二酮广泛存在于多种植物中，但其提取成本高，限制了大规模的生产应用。微生物发酵主要是通过一系列生化反应合成丁二酮，具有微生物种类多、生长快、所用原料低廉、产生的物质能生物降解的优势，是现在研究的热点。除外源添加，内源产生也是一种丁二酮的产生方式。内源产生是通过发酵剂在发酵乳发酵过程中直接产生，省去了分离纯化的步骤，也更符合当今崇尚天然产品的趋势。目前，天然、无添加的发酵乳已成为乳品行业发展的重要趋势。在发酵乳中，能积累丁二酮的微生物很多，包括乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸链球菌等。在发酵乳中，丁二酮的检出量在3mg/l到几十mg/l之间不等。研究表明，发酵乳中丁二酮含量高于30mg/l即被认为是高产丁二酮乳酸菌作用的结果。丁二酮在发酵乳中的重要作用不容忽视，筛选高产丁二酮的乳酸菌及提高其内源产生是当今发酵乳研究的热点。目前，丁二酮高产乳酸菌的筛选主要是采用紫外分光光度法和气相色谱法。紫外分光光度法，虽然操作简便，精确度能满足实验要求，但工作量较大。而气相色谱法，虽检测准确，但耗时过长，仪器成本较高，不宜推广。鉴于丁二酮在发酵乳中的重要作用，需要建立一种方便快捷的“高通量”筛选方法进行高产丁二酮乳酸菌的筛选。技术实现要素：针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种丁二酮高产乳酸菌的高通量筛选方法，所述的这种丁二酮高产乳酸菌的高通量筛选方法要解决现有技术中的筛选丁二酮高产乳酸菌的方法时间长、工作量大的技术问题。本发明提供了一种丁二酮高产乳酸菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：1)取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于mrs琼脂培养基中培养至长出单菌落，即为待筛选乳酸菌；2)在无菌条件下，取待筛选乳酸菌，接种于含有mrs肉汤培养基的多孔板中，活化3代后，待用；3)将活化后的乳酸菌，接种于灭菌脱脂乳中，在多孔板中发酵，待其凝乳后加入等体积的三氯乙酸，混匀，离心，取澄清上清液备用；4)取上清液加到多孔板的a1孔和b1孔中，向a1孔中加入的质量百分比浓度为1％的邻苯二胺，b1孔不加，摇匀后置于黑暗处放置，然后分别加入hcl溶液终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1孔的溶液作为参比液，用酶标仪在335nm波长下测其od值，每样至少做3次平行，取其平均值，取其平均值，od值高于0.37即为丁二酮高产乳酸菌。进一步的，步骤1)中所述的培养条件为：培养温度为37℃，培养时间为12-48小时。进一步的，步骤2)中的活化的培养温度为37℃，活化的培养时间为12-24小时。进一步的，步骤3)中，每升灭菌脱脂乳的组成为：脱脂乳粉120g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，溶剂为水，三氯乙酸的质量百分比浓度为8％(丁二酮浓度较高)或16％(丁二酮浓度较低)，离心转速为3000g-4000g，离心时间为10-15min。进一步的，步骤2)、3)中多孔板的规格可以是6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔、或者3857孔，其加样量为2μl-6ml。进一步的，步骤4)中多孔板的规格为6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、或者384孔，加样量为25μl-5ml，邻苯二胺的加样量为1μl-150μl，盐酸的加样量为4μl-600μl。多孔板是一类在生物工程领域常用的实验器皿，近年来已经成功地被用做自动搜索活性成分的可靠平台，主要用于pcr扩增、酶标仪检测、biolog鉴定系统等。常用规格有6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等。本发明为工业化大生产提供一种方便快捷的丁二酮高产乳酸菌的高通量筛选方法，所谓“高通量”是指大量样品的快速筛选，是通过灵敏快速的检测仪器采集实验数据及用计算机对实验数据进行分析处理。本发明将待筛选的乳酸菌接入含有培养基的多孔板ⅰ中扩培；将扩培后的乳酸菌接种到含脱脂乳的多孔板ⅱ中，待凝乳后，离心多孔板ⅱ；离心后取上清液到多孔板中，用酶标仪测定吸光值。本发明的原理是：邻苯二胺可以与联二酮类反应产生2，3-二甲基并吡嗪，生成物的盐酸盐在335nm波长下有吸收，可以测出丁二酮的含量。本发明与现有技术相比，其技术进步是显著的。第一，本发明综合利用多孔板进行菌种的培养、发酵，利用酶标仪进行丁二酮的快速测定，同时辅助以排枪的使用，是一种可以快速、高效的高通量菌种筛选方法，检测效率相比现有的检测技术提高约159-751倍。第二，本方法与常规的分光光度法和气相法所得结果具有很好的相关性，同时其回收率和稳定性均保持在较高水平，表明了该方法的有效性。附图说明图1为用酶标法测定丁二酮浓度标准曲线。图2为分别用酶标法和紫外分光光度法测定a-j10个样品的在335nm下的od值，从而比较其相关性。图3位分别用酶标法和气相色谱法测定a-j10个样品的丁二酮含量，从而比较其相关性。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1丁二酮含量标准曲线制备：(1)12％浓度的脱脂乳粉121℃灭菌7min后迅速冷却，用于准确配制不同浓度的丁二酮标准溶液；(2)取待测样品，加等体积的16％的三氯乙酸溶液，混匀，3500g离心10min，取澄清的上清液备用；(3)取上清液200μl加到酶标板2孔(a1、b1)中(100μl/孔)，向a1中加入5μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加20μl，b1加25μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值。每样至少做3次平行，取其平均值，然后以丁二酮的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，见图1。实施例224孔板-酶标法测丁二酮含量：(1)取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于mrs琼脂培养基，25-30℃培养48-72小时，获得的单菌落作为待筛选乳酸菌；(2)无菌条件下，取待筛选乳酸菌，接种于含有mrs肉汤的多孔板中，活化3代后，待用；(3)将活化后的乳酸菌，5％接种于灭菌脱脂乳中，42℃下在多孔板中发酵，待其凝乳后加入等体积16％的三氯乙酸，混匀，3500g离心10min，取澄清上清液备用；上述脱脂乳组成如下：脱脂乳粉120g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，溶剂为水；(4)取上清液1600μl加到酶标板2孔(a1、b1)中(800μl/孔)，向a1中加入40μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加160μl，b1加200μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样至少做3次平行，取其平均值，取其平均值，od值高于0.37即为丁二酮高产乳酸菌。实施例348孔板-酶标法测丁二酮含量：(1)取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于mrs琼脂培养基，25-30℃培养48-72小时，获得的单菌落作为待筛选乳酸菌；(2)无菌条件下，取待筛选乳酸菌，接种于含有mrs肉汤的多孔板中，活化3代后，待用；(3)将活化后的乳酸菌，5％接种于灭菌脱脂乳中，42℃下在多孔板中发酵，待其凝乳后加入等体积16％的三氯乙酸，混匀，3500g离心10min，取澄清上清液备用；上述脱脂乳组成如下：脱脂乳粉120g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，溶剂为水；(4)取上清液1000μl加到酶标板2孔(a1、b1)中(500μl/孔)，向a1中加入25μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加100μl，b1加125μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样至少做3次平行，取其平均值，取其平均值，od值高于0.37即为丁二酮高产乳酸菌。实施例496孔板-酶标法测丁二酮含量：(1)取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于mrs琼脂培养基，25-30℃培养48-72小时，获得的单菌落作为待筛选乳酸菌；(2)无菌条件下，取待筛选乳酸菌，接种于含有mrs肉汤的多孔板中，活化3代后，待用；(3)将活化后的乳酸菌，5％接种于灭菌脱脂乳中，42℃下在多孔板中发酵，待其凝乳后加入等体积16％的三氯乙酸，混匀，3500g离心10min，取澄清上清液备用；上述脱脂乳组成如下：脱脂乳粉120g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，溶剂为水；(4)取上清液200μl加到酶标板2孔(a1、b1)中(100μl/孔)，向a1中加入5μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加20μl，b1加25μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样至少做3次平行，取其平均值，取其平均值，od值高于0.37即为丁二酮高产乳酸菌。实施例5384孔板-酶标法测丁二酮含量：(1)取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于mrs琼脂培养基，25-30℃培养48-72小时，获得的单菌落作为待筛选乳酸菌；(2)无菌条件下，取待筛选乳酸菌，接种于含有mrs肉汤的多孔板中，活化3代后，待用；(3)将活化后的乳酸菌，5％接种于灭菌脱脂乳中，42℃下在多孔板中发酵，待其凝乳后加入等体积16％的三氯乙酸，混匀，3500g离心10min，取澄清上清液备用；上述脱脂乳组成如下：脱脂乳粉120g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，溶剂为水；(4)取上清液40μl加到酶标板2孔(a1、b1)中(20μl/孔)，向a1中加入1μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加4μl，b1加5μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样至少做3次平行，取其平均值，取其平均值，od值高于0.37即为丁二酮高产乳酸菌。对比例1紫外分光光度法：向发酵乳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j中加等体积16％的三氯乙酸溶液，混匀，3500g离心10min，取澄清上清液备用。取上清液20ml加到2支(1号和2号)试管中(10ml/管)，向1号管中加入0.5ml1％的邻苯二胺溶液，2号管不加，混匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4.0mol/l的盐酸溶液(1号管2.0ml，2号管2.5ml)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的2号管的溶液作为参比液，用紫外分光光度计在335nm波长下用石英比色皿测定od值，每样至少做3个平行取平均值od值高的即为丁二酮高产乳酸菌。对比例2气相色谱法：取发酵乳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j各5g于20ml顶空瓶中，并加入一定体积的2-辛醇(内标)，在55℃水浴中平衡5min，萃取吸附45min，在250℃下解吸5min，进行分析。效果例1酶标法与紫外分光光度法检测样品对比：在一定体积灭菌脱脂乳(12％脱脂乳粉、2％葡萄糖、0.5％蛋白胨)中接入5％的乳酸菌，放在42℃培养箱中，待其凝乳后，得到发酵乳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j，分别采用酶标法(选用96孔板)和紫外分光光度法在335nm波长下检测丁二酮的含量，结果见图2。采用酶标法与紫外分光光度法测定的结果基本一致。说明两种方法均能够保证样品中丁二酮的有效回收测定。但采用酶标法，不仅节约耗材、试剂，而且可以实现批量操作，高通量检测，大大节省劳动力，提高劳动效率。效果例2酶标法与气相色谱法检测样品对比：在一定体积灭菌脱脂乳(12％脱脂乳粉、2％葡萄糖、0.5％蛋白胨)中接入5％的乳酸菌，放在37℃培养箱中，待其凝乳后，得到发酵乳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j，分别采用酶标法(选用96孔板，335nm)和气相色谱法检测丁二酮的含量，结果见图3。采用酶标法与气相色谱法测定的结果基本一致。说明两种方法均能够保证样品中丁二酮的有效回收测定。用气相色谱法检测固然准确，但仪器成本较高，耗时长，不宜推广。用酶标法检测的结果与气相色谱法结果基本一致，且可以实现批量操作，高通量检测，耗时短，成本低。效果例3酶标法、紫外分光光度法、气相色谱法检测时间对比酶标法(选用96孔板)，每个样品做三次平行，一块96孔板可检测16个样品，检测时间为约为1min。紫外分光光度法，每个样品做3次平行，一个样品约需要10min，16个样品约160min。气相色谱法的程序为每个样品47min，16个样品约752min。通过3种方法检测时间的对比(见表1)，样品前处理的时间差忽略不计。表1酶标法、紫外分光光度法、气相色谱法检测时间对比效果例4酶标法测丁二酮回收率实验取一定体积的灭菌脱脂乳(12％脱脂乳粉、2％葡萄糖、0.5％蛋白胨)放在42℃培养箱中，待其凝乳后，向其中加入一定体积一定浓度的丁二酮溶液，使发酵乳中丁二酮的浓度分别为10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l，向其中加入等体积(灭菌脱脂乳+丁二酮溶液)16％的三氯乙酸溶液，3500g离心10min，取上清液200μl加到96孔酶标板2孔(a1、b1)中(100μl/孔)，向a1中加入5μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加20μl，b1加25μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样做3次平行，取其平均值。表2回收率测定结果(n＝3，x±d)效果例5酶标法检丁二酮稳定性实验在一定体积灭菌脱脂乳(12％脱脂乳粉、2％葡萄糖、0.5％蛋白胨)中接入5％的乳酸菌，放在42℃培养箱中，待其凝乳后，得到发酵乳k(5次重复)，向其中加入等体积16％的三氯乙酸溶液，3500g离心10min，取上清液200μl加到96孔酶标板2孔(a1、b1)中(100μl/孔)，向a1中加入5μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加20μl，b1加25μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样做3次平行，取其平均值。表3稳定性测定结果样品丁二酮(mg/l)122.62221.41322.19424.86522.44平均值22.70标准差1.29效果例6用96孔板-酶标法进行高产丁二酮菌种的筛选：(1)取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于mrs琼脂培养基，25-30℃培养48-72小时，获得的单菌落作为待筛选乳酸菌；(2)无菌条件下，取待筛选乳酸菌，接种于含有mrs肉汤的多孔板中，活化3代后，待用；(3)将活化后的乳酸菌，5％接种于灭菌脱脂乳中，42℃下在多孔板中发酵，待其凝乳后加入等体积16％的三氯乙酸，混匀，3500g离心10min，取澄清上清液备用；上述脱脂乳组成如下：脱脂乳粉120g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，溶剂为水；(4)取上清液40μl加到酶标板2孔(a1、b1)中(20μl/孔)，向a1中加入1μl的1％的邻苯二胺，b1不加，摇匀后置于黑暗处放置30min，然后加入4mol/l的hcl溶液(a1加4μl，b1加5μl)终止反应，混匀后以不加邻苯二胺的b1的溶液作为参比液，酶标仪在335nm波长下测其od值，每样至少做3次平行，取其平均值。经检测其od值为0.44，即丁二酮浓度为38.07mg/l。(5)将该株菌进行16srrna检测，其检测结果为戊糖片球菌。当前第1页12