一种人血浆转铁蛋白分离纯化的方法与流程
本发明属于蛋白质分离纯化领域，尤其涉及一种人血浆转铁蛋白分离纯化的方法。
背景技术：
人血浆转铁蛋白是一种重要的β-球蛋白，分子量为79kda，等电点约为5.9左右。转铁蛋白是一种单链糖基化蛋白，糖基约占10％，由c端和n端两个具有高度同源性的结构域组成，两个结构域都由一个短肽连接，而且，c端和n端都由两个大小相同的小亚基构成，两个小亚基之间的间隙则是fe3+结合位点，因此，转铁蛋白有2个铁离子结合位点。根据结合数目及位点的不同，转铁蛋白有四种形式，分别是无铁离子结合转铁蛋白、只有n端结合铁离子的转铁蛋白、只有c端结合铁离子的转铁蛋白以及n端和c端都结合铁离子的转铁蛋白。正常条件下，转铁蛋白的铁离子饱和度是20％-35％。人血浆中转铁蛋白的浓度约为2.0～3.0g/l。转铁蛋白是人血浆和组织细胞外空间的主要铁载体，其主要生理功能是把铁离子从吸收和储存的地方运输到红细胞供合成血红蛋白用，或输送到机体的其他需铁部位。转铁蛋白结合的铁不会催化羟基自由基形成，而且可以使铁离子远离细菌和真菌，因此转铁蛋白具有抗氧化和抗菌的作用。转铁蛋白可用于治疗先天性无转铁蛋白性贫血、铁功能缺乏、非转铁蛋白结合的铁结合治疗、细胞培养以及药物载体等。
患有白血病和其他恶性肿瘤的患者通常具有转铁蛋白的水平较低，在高剂量的化疗过程中，转铁蛋白的转运铁能力超载，导致游离的铁离子将会富集在体内。骨髓性化疗和骨髓干细胞移植的过程中，同样会有非转铁蛋白结合的铁离子富集的情况。这些非转铁蛋白结合的铁离子会促进细菌和真菌生长，使病人容易发生败血症感染。因此，铁结合治疗对于避免非转铁蛋白结合铁的毒副作用和败血症感染显得尤其必要。目前，临床上使用小分子量的铁螯合剂，但结合能力有限，而且有剂量相关的毒性。人血浆来源的无铁离子结合的转铁蛋白将会更适合于用于临床上的铁离子结合治疗，因此研究其分离纯化尤其必要。
早在上世纪中期的时候，转铁蛋白的分离纯化主要为沉淀法，包括乙醇沉淀、利凡诺沉淀和硫酸铵沉淀。但沉淀法得到的转铁蛋白纯度和回收率较低。随后，层析法逐渐被广泛应用于转铁蛋白的分离纯化，但层析法分离纯化仍存在一些问题：(1)尽管纯度已达到要求，但是回收率较低，纯度和回收率不能同时达到最优。(2)有些方法在层析之前需进行一步或多步沉淀，增加了操作步骤和成本，降低回收率。(3)有些方法使用了昂贵的亲和层析。因此，寻求一种可以得到高纯度以及高回收率转铁蛋白的高效分离纯化方法显得非常重要。
技术实现要素：
为了得到高纯度以及高回收率转铁蛋白，同时降低纯化回收成本，本发明提供一种分离纯化人血浆转铁蛋白的方法，本发明的方法经过阴离子交换层析和疏水作用层析，即可分离纯化得到铁蛋白，大大提高了血浆的综合利用度。本发明制备出的转铁蛋白具有高纯度、高回收率、步骤简单以及易规模化生产的特点，解决了目前其纯化方法存在的问题。
本发明采用的技术方案为：一种人血浆转铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：
1)将人血浆组分fiv-1蛋白沉淀溶解于缓冲液中，过滤，得滤液；
2)利用阴离子交换层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含转铁蛋白的洗脱液；
3)将步骤2)得到的洗脱液进行病毒灭活，过滤、透析后，收集透析液；
4)利用疏水作用层析对步骤3)中的透析液进行二次分离，得含转铁蛋白的穿透液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤4)之后还包括步骤5)：将步骤4)得到的含转铁蛋白的洗脱液进行超滤之后进行病毒过滤、除菌过滤，分装冻干。
在上述技术方案中，fiv-1蛋白沉淀是采用低温乙醇-cohn法分离血浆蛋白工艺产生的。采用低温乙醇-cohn法分离血浆蛋白，可以沉淀产生组份ι、ⅱ、ⅲ、ⅳ、v五种组份，即fι、fⅱ、fⅲ、fⅳ、fv，而fⅳ又可分为组分iv-1和iv-2，即fiv-1和fiv-2，是低温乙醇法不同步骤得到的产物表示。其中，fiv-1又分为fiv-1上清液和fiv-1沉淀，fiv-1上清液用来提取其他蛋白，fiv-1沉淀现在血液制品企业一般废弃，为了提高人血浆的综合利用度，本发明将fiv-1沉淀再用缓冲液溶解，用于转铁蛋白的纯化。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)中溶解fiv-1沉淀的缓冲液的ph为7.0～9.0；
优选地，所述的缓冲液为ph7.0-9.0，10～100mm的磷酸盐缓冲液或ph7.0～9.0，10～100mm的tris-hcl缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)中，溶解在20～45℃的温度下进行5～10h。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)具体为：取装有阴离子交换层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡色谱柱后上样，然后用洗脱液进行洗脱，收集含转铁蛋白的洗脱液。优选地，上样之前还包括：将步骤1)得到的滤液的ph调至与平衡缓冲液相同的步骤。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤2)中所述的阴离子交换层析填料为deaesepharosehighperformance、deaesepharosefastflow、deaemacro-prep、toyopearyldeae-650m、qsepharosehighperformance、qsepharosefastflow或captoq；
平衡缓冲液为ph6.5～9.0，10～100mm的tris-hcl缓冲液或ph6.5～9.0，10～100mm的磷酸盐缓冲液；
洗脱以a液和b液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述a液为平衡缓冲液，所述b液为含0.08～0.15mnacl，ph6.5～9.0，10～100mm的tris-hcl缓冲液或含0.08～0.15mnacl，ph6.5～9.0，10～100mm的磷酸盐缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤3)具体为：向步骤2)得到的洗脱液中加入磷酸三正丁酯和吐温-80至其最终浓度分别为0.2～0.4％和0.5～1.5％，进行s/d灭活，于20～30℃灭活3-10h后，进行过滤和透析，收集透析液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤4)具体为：取装有疏水作用层析填料的色谱柱，用平衡缓冲液平衡色谱柱后上样，用洗脱液进行洗脱，得到含转铁蛋白的穿透液。优选地，上样之前还包括：将步骤的3)得到的透析液的电导调至与平衡缓冲液相同的步骤。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤4)中所述的疏水作用层析填料为butylsepharosehighperformance、phenylsepharosehighperformance、octylsepharosehighperformance、phenylsepharosefastflow、octylsepharosefastflow或butylsepharosefastflow；
平衡缓冲液为含0.1～1mnacl，ph7.0～9.0，10～100mm的tris-hcl或含0.1～1mnacl，ph7.0～9.0，10～100mm的磷酸盐缓冲液；
洗脱以a液和b液为洗脱液进行线性梯度洗脱，其中，所述a液为平衡缓冲液，所述b液为ph7.0～9.0，10～100mm的tris-hcl缓冲液或ph7.0～9.0，10～100mm的磷酸盐缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤5)具体为：将步骤4)得到的含转铁蛋白的穿透液进行超滤浓缩至其浓度为10～50mg/ml，之后进行15nm病毒过滤、除菌过滤、分装冻干，冻干过程：先在空气氛围中-25℃保持2-4h，再在-40℃保持2-4h，然后在真空条件下，-10℃保持30-40h，升温至35℃再保持20～30h，即完成冻干。
本发明以低温乙醇法分离血浆蛋白工艺产生的fiv-1蛋白沉淀废弃物为原料，主要经过一步阴离子交换层析和一步疏水作用层析，即可分离纯化出高纯度高回收率的转铁蛋白。
本发明的有益技术效果为：
(1)本发明的方法制得的转铁蛋白具有高纯度和高回收率的优点，纯度≥95％，每步层析回收率≥90％，解决了目前转铁蛋白制备方法中纯度和回收率低的缺点。
(2)本发明的方法具有操作简单和成本低等优点。
(3)本发明中的层析方式为阴离子交换层析和疏水作用层析，具有易放大，且填料易得等优点。
(4)本发明提供了一种转铁蛋白的分离纯化方法，大大提高了血浆的综合利用度，降低生产成本。并且制备出的转铁蛋白具有高纯度、高回收率、步骤简单以及易规模化生产的特点。
附图说明
图1是本发明的人血浆转铁蛋白分离纯化方法的基本流程示意图。
图2是本发明的人血浆转铁蛋白分离纯化方法中阴离子交换步骤的层析图。
图3是本发明的人血浆转铁蛋白分离纯化方法中疏水作用层析步骤的层析图。
图4是本发明的人血浆转铁蛋白离纯化过程的sds-page图，其中，1：marker；2：转铁蛋白标准品；3：fiv-1沉淀溶解液；4：第一步阴离子交换层析转铁蛋白洗脱液；5：第二步疏水作用层析转铁蛋白穿透液；6：第二步疏水作用层析转铁蛋白穿透液(管道5稀释1.5倍)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1
1.fiv-1沉淀的溶解
称取1gfiv-1沉淀溶解于10ml20mmph6.5磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h。溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml20％乙醇保存的deaesepharosehighperformance凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
3.病毒灭活
在进行第二步层析前，含转铁蛋白的洗脱液需经过s/d灭活。向含转铁蛋白的阴离子交换层析洗脱液中加入磷酸三正丁酯和吐温-80进行s/d灭活，最终浓度分别为0.3％和1％，25℃灭活8h后，进行过滤和透析。透析后调节溶液电导与下一步的疏水作用层析平衡缓冲液的电导相同。
4.疏水作用层析
取30ml20％乙醇保存的butylsepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
5.超滤、除菌过滤、病毒过滤、分装、冻干
将疏水作用层析的转铁蛋白流穿液超滤浓缩，蛋白浓度为15mg/ml，之后进行除菌过滤、15nm病毒过滤、分装冻干。冻干过程：先在空气氛围总中-25℃保持2～4h，再-40℃2～4h。然后在真空条件下，-10℃保持30～40h，升温至35℃再保持20-30h。冻干完成后，即制备出转铁蛋白制剂。
实施例2
1.fiv-1沉淀的溶解
称取1gfiv-1沉淀溶解于10ml20mmph7.5磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h。溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml20％乙醇保存的deaesepharosehighperformance凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
3.病毒灭活
在进行第二步层析前，含转铁蛋白的洗脱液需经过s/d灭活。向含转铁蛋白的阴离子交换层析洗脱液中加入磷酸三正丁酯和吐温-80进行s/d灭活，最终浓度分别为0.3％和0.8％，25℃灭活8h后，进行过滤和透析。透析后调节溶液电导与下一步的疏水作用层析平衡缓冲液的电导相同。
4.疏水作用层析
取30ml20％乙醇保存的butylsepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
5.超滤、除菌过滤、病毒过滤、分装、冻干
将疏水作用层析的转铁蛋白流穿液超滤浓缩，蛋白浓度为15mg/ml，之后进行除菌过滤、15nm病毒过滤、分装冻干。冻干过程：先在空气氛围总中-25℃保持2～4h，再-40℃2～4h。然后在真空条件下，-10℃保持30～40h，升温至35℃再保持20～30h。冻干完成后，即制备出转铁蛋白制剂。
实施例3
1.fiv-1沉淀的溶解
称取1gfiv-1沉淀溶解于10ml20mmph8.0磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h。溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml20％乙醇保存的deaesepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
3.病毒灭活
在进行第二步层析前，含转铁蛋白的洗脱液需经过s/d灭活。向含转铁蛋白的阴离子交换层析洗脱液中加入磷酸三正丁酯和吐温-80进行s/d灭活，最终浓度分别为0.3％和0.8％，25℃灭活8h后，进行过滤和透析。透析后调节溶液电导与下一步的疏水作用层析平衡缓冲液的电导相同。
4.疏水作用层析
取30ml20％乙醇保存的butylsepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
5.超滤、除菌过滤、病毒过滤、分装、冻干
将疏水作用层析的转铁蛋白流穿液超滤浓缩，蛋白浓度为15mg/ml，之后进行除菌过滤、15nm病毒过滤、分装冻干。冻干过程：先在空气氛围总中-25℃保持2～4h，再-40℃2～4h。然后在真空条件下，-10℃保持30～40h，升温至35℃再保持20～30h。冻干完成后，即制备出转铁蛋白制剂。
实施例4
1.fiv-1沉淀的溶解
称取1gfiv-1沉淀溶解于10ml20mmph9.0磷酸盐缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h。溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml20％乙醇保存的deaesepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
3.病毒灭活
在进行第二步层析前，含转铁蛋白的洗脱液需经过s/d灭活。向含转铁蛋白的阴离子交换层析洗脱液中加入磷酸三正丁酯和吐温-80进行s/d灭活，最终浓度分别为0.3％和0.5％，25℃灭活8h后，进行过滤和透析。透析后调节溶液电导与下一步的疏水作用层析平衡缓冲液的电导相同。
4.疏水作用层析
取30ml20％乙醇保存的phenylsepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
5.超滤、除菌过滤、病毒过滤、分装、冻干
将疏水作用层析的转铁蛋白流穿液超滤浓缩，蛋白浓度为15mg/ml，之后进行除菌过滤、15nm病毒过滤、分装冻干。冻干过程：先在空气氛围总中-25℃保持2～4h，再-40℃2～4h。然后在真空条件下，-10℃保持30～40h，升温至35℃再保持20～30h。冻干完成后，即制备出转铁蛋白制剂。
实施例5
1.fiv-1沉淀的溶解
称取1gfiv-1沉淀溶解于10ml20mmph8.0tris-hcl缓冲液中，充分混合，于摇床上室温溶解5h。溶解结束后，离心去除硅藻土，上清液用0.45μm针筒式滤膜过滤，取滤液备用。
2.阴离子交换层析
取35ml20％乙醇保存的deaesepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
3.病毒灭活
在进行第二步层析前，含转铁蛋白的洗脱液需经过s/d灭活。向含转铁蛋白的阴离子交换层析洗脱液中加入磷酸三正丁酯和吐温-80进行s/d灭活，最终浓度分别为0.3％和1％，25℃灭活8h后，进行过滤和透析。透析后调节溶液电导与下一步的疏水作用层析平衡缓冲液的电导相同。
4.疏水作用层析
取30ml20％乙醇保存octylsepharosefastflow凝胶，用水反复置换，去除乙醇，放置达到温度平衡后用xk16/20装柱。以下层析过程都在ge
5.超滤、除菌过滤、病毒过滤、分装、冻干
将疏水作用层析的转铁蛋白流穿液超滤浓缩，蛋白浓度为15mg/ml，之后进行除菌过滤、15nm病毒过滤、分装冻干。冻干过程：先在空气氛围总中-25℃保持2～4h，再-40℃2～4h。然后在真空条件下，-10℃保持30～40h，升温至35℃再保持20～30h。冻干完成后，即制备出转铁蛋白制剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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