扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白MaHMBP及其编码基因、植物双元载体和应用的制作方法

文档序号:11686187阅读:474来源:国知局
扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白MaHMBP及其编码基因、植物双元载体和应用的制造方法与工艺

本发明属于遗传育种领域,具体涉及扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白mahmbp及其编码基因、植物双元载体和应用。



背景技术:

随着现代工农业的迅速发展、城市的急剧扩大,自然环境中的重金属污染日益严重。每年因重金属污染带来的粮食减产达1000多万吨,被重金属污染的粮食每年达1200万吨,年经济损失在200亿以上。传统的土壤重金属污染修复技术有排土填埋法、稀释法、淋洗法、物理分离法和化学法等因成本高、效率低,而且会破坏土壤结构,导致二次污染等原因,难以大面积应用。

植物修复是生物修复(bioremediation)的一种方式,又称绿色修复(greenremediation),是以植物忍耐、分解或超量积累某种或某些化学元素的生理功能为基础,利用植物及其共存微生物体系来吸收、降解、挥发和富集环境中污染物的一项环境污染治理技术。与传统的处理方式相比,植物修复的主要优点是成本低,处理设施简单,适合大规模的应用,利于土壤生态系统的保持,对环境扰动小,具有美学价值等特点。但是目前植物修复的能力有限,例如,植物对于重金属的种类和浓度的抗性均有一定限度,这大大制约了植物修复的应用。



技术实现要素:

有鉴于此,本发明的目的在于提供一种扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白及其编码基因和植物双元载体,所述扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白或编码基因具有提高植物的抗重金属的功能。

为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:

本发明提供了一种扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白mahmbp,具有序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp,具有序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种植物双元载体,pcambia-1301载体中包含权利要求2所述的扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp、烟草的染色质附着sar序列的外源基因的表达单元。

本发明还提供了所述的重金属结合蛋白基因mahmbp或所述的植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用。

优选的,所述植物包括拟南芥。

优选的,所述重金属包括铬离子、镉离子、汞离子、铬离子、铅离子和砷离子中的一种或几种。

优选的,所述培育的方法采用农杆菌介导法将所述重金属结合蛋白基因mahmbp或所述植物双元载体转化入宿主植物中。

本发明了扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白mahmbp及其编码基因,为了进一步分析所述基因在重金属逆境中的作用与功能,比较转mahmbp基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。结果表明,野生型和转mahmbp基因拟南芥植株在表型上有很大的差异;同时在500μm浓度的氯化铬浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制,根系不生长,叶片稀少,而转基因株系抑制较小,这说明mahmbp基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

附图说明

图1为本发明中拟南芥转化的植物表达载体示意图;

图2为实施例5转mahmbp基因拟南芥的gus染色图;

图3为实施例6转mahmbp基因拟南芥与野生型拟南芥的抗重金属表型图。

具体实施方式

本发明提供了一种扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白mahmbp,具有序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列。

本发明中,所述扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白mahmbp的合成方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的合成方法即可。

本发明提供了一种扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp,具有序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明中,所述扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp的合成方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的合成方法即可。

本发明中,所述扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp的合成方法优选采用人工方法合成。所述人工方法包括以下步骤:

依照ptds(pcr-basedtwo-stepdnasynthesis,ptds)方法进行源自扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白编码基因的化学合成,在保持mahmbp基因的氨基酸序列不变的基础上,合成基因编码区,根据得到的基因编码区核苷酸序列设计引物扩增了mahmbp基因。

本发明中,所述合成基因编码区的设计方法包括以下部分:

(一)优化基因密码子,提高基因翻译效率;

(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点,便于表达盒构建;

(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号,使基因内部的gc/at均衡,提高rna的稳定性;

(四)使基因编码蛋白符合n端原则(tobias1991),以提高翻译蛋白的稳定性;

(五)设计提高基因5’端的自由能,以提高基因翻译起始效率。

所述引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列为tcagaagaaccatcagaagac(seqidno.3)。所述反向引物的的核苷酸序列为gagcaacagtagtagcagag(seqidno.4)。

本发明还提供了一种植物双元载体,pcambia-1301载体中包含权利要求2所述的扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp、烟草的染色质附着sar序列的外源基因的表达单元。

本发明中,所述植物双元载体的构建方法,包括以下步骤:

①将pcambia-1301载体在bamhi和sacl酶的作用下进行酶切,得到酶切后的线性pcambia-1301载体;

②扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp两端添加bamhi和sacl酶切位点;

③在所述步骤②中得到的具有bamhi和sacl酶切位点的扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白编码基因mahmbp的两端添加上烟草的染色质附着sar序列,以保证转基因的稳定遗传,得到两端附加了烟草的染色质附着sar序列的外源基因的表达单元;

④将所述步骤①得到的线性pcambia-1301载体和所述步骤③得到的两端附加了烟草的染色质附着sar序列的外源基因的表达单元连接,得到植物双元载体。

本发明中,所述植物双元载体中外源基因的表达由双camv355启动子+tmvomegaleadersequence控制。

本发明还提供了所述的重金属结合蛋白基因mahmbp或所述的植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用。

本发明中,所述植物优选包括拟南芥。

本发明中,所述重金属优包括铬离子、镉离子、汞离子、铬离子、铅离子和砷离子中的一种或几种。

本发明中,所述培育的方法优选采用农杆菌介导法将所述重金属结合蛋白基因mahmbp或所述植物双元载体转化入宿主植物中。

本发明中,所述培育方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的培育方法即可。

本发明中,培育后的抗重金属植物优选进行功能验证。所述验证方法为将培育后的抗重金属植物自交纯合3代,获得纯合转化株,收取种子;将所述种子播种后,在22℃条件下生长两周;将野生型和转基因培养皿小苗进行抗重金属实验。

本发明中,所述抗重金属实验的方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的抗重金属实验即可。所述重金属的种类为氯化铬。所述氯化铬的摩尔浓度优选为300~600μm,更优选为500μm。

下面结合实施例对本发明提供的扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白mahmbp及其编码基因、植物双元载体和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明所用的试验材料及其来源如下:

野生型拟南芥(arabidopsisthaliana)和生态型拟南芥columbia在23℃人工气候室培养,16h光照培养,光照强度为130μmol/(㎡·s)。

克隆载体pmd-18-simplet、各类限制性内切酶、taq聚合酶、连接酶、dntp、10×pcrbuffer和dnamarker购自宝生物工程大连有限公司。

所有的化学试剂购买自美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂。

测序试剂盒购自美国应用系统公司的abipriambig-dyeterminatordna测序试剂盒。

本发明所用的试剂若未明确指明,则均购自西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich)。

实施例1

扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白mahmbp基因的人工合成

根据genbank登录的扭脱甲基杆菌mahmbp基因序列,用以基因合成方法【nucleicacidsresearch,2004,32,e98】,在不改变基因编码的氨基酸序列的前提下,按以下原则进行合成基因编码区的设计:(一)优化基因密码子,提高基因翻译效率。(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点,便于表达盒构建。(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号,使基因内部的gc/at均衡,提高rna的稳定性。(四)使基因编码蛋白符合n端原则(tobias1991),以提高翻译蛋白的稳定性。(五)设计提高基因5’端的自由能,以提高基因翻译起始效率。

扩增条件为:94℃预热1min;94℃,30s,50℃,30s,72℃,2min,使用的taqdna聚合酶为kodfxtaq酶(toyobo公司,日本),共25个循环。

pcr结束后,1%琼脂糖胶回收,取10μl直接与t/a克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜,高效转化dh5α感受态中。获得阳性克隆。

实施例2

mahmbp农杆菌双元载体的构建

上述人工合成的mahmbp基因的阳性克隆用引物经pcr扩增后头尾分别加入bamhi和saci切点,经bamhi+saci双酶切,回收dna片段与相应酶切的载体相连,经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体(见图1)。

实施例3

电击法转化农杆菌

1)制备农杆菌gv3101感受态,方法参照micropulsertmelectroporationapparatusoperatinginstructionsandapplicationguide(bio-rad公司)((rainerietal.,bio.tech.,1990,8:33-38)。

2)取50μlgv3101感受态细胞,加入1μldna,转入0.2cm电击杯转化(400ω,2.5kv,25μf)。加入1ml含有1%甘露醇的lb培养基恢复培养2小时(28℃,250rpm)。分别取10μl、100μl涂lb平板(利福平50μg/ml,庆大霉素50μg/ml,氯霉素100μg/ml)。

3)挑取几个克隆,碱法抽提农杆菌质粒,酶切鉴定,pcr检测。

实施例4

农杆菌介导转化拟南芥

a拟南芥的培养

1)拟南芥种子在4℃进行2-3天的春化处理,目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。

2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9:3:0.5的比例拌匀,经高温灭菌后装于10cm的塑料小盆,以营养液pns浸湿待用。

3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上,保鲜膜封口。放置于22℃暗培养2-3天,待种子萌发后,揭开保鲜膜,置于22℃培养室中进行16小时光照培养。

4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以pns营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔,利于次生苔的生长,当次生苔长至2-10cm(少数已经开花)可用于转化(何玉科,巩振辉,细跑生物学杂志,1991,13(3):97-101)。

b农杆菌的准备

1)挑取农杆菌单菌接种于5mllb液体培养基(利福平50μg/ml,氯霉素100μg/ml)中,28℃,250rpm培养20小时。(rashidetal.,1996)

2)取1ml菌液转接入20-30mllb液体培养基(利福平50μg/ml,氯霉素100μg/ml)中,28℃,250rpm培养约12小时,测od600≈1.5。

3)8000rpm,4℃,10min离心收集菌体,重悬于农杆菌转化渗透液(5%蔗糖,0.05%silwetl-77)并稀释至od600≈0.8。

c拟南芥蘸花法转化

1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中,轻轻搅动约3~5秒后取出,全部转化完毕后,托盘中加入pns营养液,以黑色塑料袋套盆封口,保持湿润环境,置于22℃培养室低光强度下生长24小时,即可正常培养。

2)初次转化四天后,可再进行一次转化,重复两次,总共转化三次,这样可以在花发育的不同时期进行转化,提高转化效率。

3)生长约两个月后,收集种子,4℃冰箱贮存待用。

实施例5

拟南芥转化植株种子的筛选

1)称25-30mg种子放入1.5ml离心管。

2)1ml75%乙醇消毒1min(不停摇晃振荡),8000rpm离心5秒,去上清。

3)加入1ml过滤后的漂白粉消毒15min(不停摇晃振荡,充分消毒),8000rpm离心5秒,去上清。

4)无菌水洗涤3-4次。

5)将种子均匀的播撒到1/2ms平板(hyg50μg/ml)上,parafilm膜封口,4℃冰箱放置两天,22℃,16小时光照培养6天。

6)将抗性植株移栽到盆中培养,苗稍大后,进行gus活性检测,选出阳性植株(t1)继续培养,并收集种子进行t2代和t3代筛选。

实施例6

转基因阳性植株的检测

按jefferson(1978)的方法,将待测拟南芥叶片样品与x-gluc染色反应液(50mmol/lnah2po4,ph7.0;0.5mmol/lk4[fe(cn)6],0.1%tritonx-100,20%甲醇,0.5mg/mlx-gluc[x-glucuronide])于37℃保温2~4小时后,用75%乙醇脱色观察。

由图2可以看出,离心管底部沉淀为蓝色,说明拟南芥叶片样品为转基因阳性植株。

实施例7

扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白mahmbp基因转化植物后的抗重金属分析

将转化植物自交纯合3代,获得纯合转化株,收取种子。播种后,在22℃生长两个星期。然后比较了转mahmbp基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。重金属首先抑制的根的生长,根长是比较直接简单的指标。

结果如图3所示,结果表明,野生型和转mahmbp基因拟南芥植株在表型上有很大的差异。结果显示在500μm浓度的氯化铬浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制,根系不生长,叶片稀少,而转基因株系抑制较小。说明mahmbp基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海市农业科学院

<120>扭脱甲基杆菌重金属结合蛋白mahmbp及其编码基因、植物双元载体和应用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>234

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggatccatggatcagtctccaatcgaacttactatgagagttgatggtatgacttgtgaa60

ggttgtgctgaagctgtcagaagaaccatcagaagacttgatccacaagctgacgtctct120

gttgatgttggtcttggcagagtctctgctactactgttgctcagtctctggatgttgct180

caagctctgactcaagctggctatactgctactgctatgactggctaagagctc234

<210>2

<211>73

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metaspglnserproilegluleuthrmetargvalaspglymetthr

151015

cysgluglycysalaglualavalargargthrileargargleuasp

202530

proglnalaaspvalservalaspvalglyleuglyargvalserala

354045

thrthrvalalaglnserleuaspvalalaglnalaleuthrglnala

505560

glytyrthralathralametthrgly

6570

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcagaagaaccatcagaagac21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagcaacagtagtagcagag20

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