一种鉴定长臂猿性别的PCR引物、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物检测鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定长臂猿性别的pcr引物、试剂盒及方法，该方法教传统sry1作为引物进行性别鉴定方法具有特异性强、灵敏度高的优势。

背景技术：

长臂猿(hylobatidae)是一类分布于东南亚地区的小型猿类，与黑猩猩、猩猩和大猩猩同属于类人猿(ape)。通常营一夫一妻制家庭生活，3至5年繁殖一次，每胎1子，8岁左右性成熟。人工饲养的长臂猿会作为科学研究实验动物或者观赏动物，分别被引入到动物实验室或动物园。长臂猿在性成熟之前，性征表现不明显，通过外观难以鉴定其性别。在长臂猿的引种过程中，一般不直接引入成年长臂猿，因为生活环境与气候的改变，容易引发长臂猿的生理或心理健康疾病。故引种时，一般会选择幼年的长臂猿。为了长臂猿繁殖和育种的需要，在引种时会同时引入雄性长臂猿和雌性长臂猿。因此，对性发育尚未成熟的幼年长臂猿进行性别鉴定，是具有必要性的。

长臂猿基因组与人类基因组相近。在药物研发过程中，以长臂猿为对象对药物效应动力学及药物代谢动力学的研究具有重要意义。对幼年长臂猿进行性别鉴定，可根据性别进行不同的针对性试验，有利于提高试验的效率和指向性。而现有鉴定幼年长臂猿的方法，在灵敏度、特异性方面均较差，所以建立一种特异性和灵敏度较高，且成本较低的快速鉴定长臂猿性别的方法具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鉴定长臂猿性别的pcr引物。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定长臂猿性别的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定长臂猿性别的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种鉴定长臂猿性别的pcr引物，其核苷酸序列如下所示：

sry233-f1：5’-gggtcgcttcactctatc-3’(seqidno：1)，

sry233-r1：5’-gctctggcacctttcaatt-3’(seqidno：2)。

一种鉴定长臂猿性别的试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。

进一步的，上试剂盒还含有内参引物，其核苷酸序列如下所示：

β-actin-f：5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno：3)，

β-actin-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3’(seqidno：4)。

一种鉴定长臂猿性别的方法，包括以下步骤：

1)长臂猿基因组dna的提取；

2)以基因组dna为模板，以上述所述sry1-f2和sry1-r2为引物、β-actin-f和β-actin-r为内参，进行pcr扩增；

3)凝胶电泳检测pcr扩增效果，分析长臂猿的性别。

进一步的，步骤2)中，所述的pcr扩增的体系为：

进一步的，步骤2)中，所述的pcr扩增的反应程序为：98℃预变性5min，98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸30s，72℃终延伸10min，共32个循环。

本发明的有益效果是：

1)本发明提供的方法可对长臂猿性别进行快速鉴定，鉴定结果不受年龄条件的限制。该方法为雌雄性征表现差异极小的幼龄长臂猿性别鉴定提供了一种技术手段，较传统使用sry1引物扩增677bp片段的方法更为特异和灵敏，也为动物园及实验室的引种程序进行优化，避免了引种性别错误带来的饲养成本浪费。

2)本发明的引物对sry233-f1和sry233-r1对长臂猿性别鉴定具有很好的检测效果，pcr扩增效率高，检测灵敏度高，特异性强。本发明较传统sry1为引物的pcr反应扩增的灵敏性高10倍，能对幼龄长臂猿快速且准确地进行性别鉴定。

3)本发明方法对样品的采集简易，样品采集过程对长臂猿的损伤性小，只需采集长臂猿的血液便可进行实验，简便快速。

附图说明

图1为现有传统引物sry1用于pcr扩增鉴定长臂猿性别的结果，标号219042和大的长臂猿为雌性，标号218663和小的长臂猿为雄性；

图2为sry233和sry1为引物的pcr扩增结果，图中marker为dl2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp)；泳道1和2为本发明引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)扩增结果；泳道3和4为现有引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)的扩增结果；

图3是以sry1为引物、质粒pvax-sry1为模板的pcr扩增结果；m为dl2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp)；1为10⁴copies/ml的pvax-sry1质粒，2为10³copies/mlpvax-sry1质粒，3为10²copies/mlpvax-sry1质粒，4为10¹copies/mlpvax-sry1质粒，5为10⁰copies/mlpvax-sry1质粒；

图4是以sry233为引物、质粒pvax-sry233为模板的pcr扩增结果；m为dl2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp)；1为10⁴copies/ml(copies/ml？请提供具体的单位)的pvax-sry233质粒，2为10³copies/mlpvax-sry233质粒，3为10²copies/ml的pvax-sry233质粒，4为10¹copies/mlpvax-sry233质粒，5为10⁰copies/mlpvax-sry233质粒。

具体实施方式

实施例1一种鉴定长臂猿性别的pcr引物

本发明经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对sry233-f1和sry233-r1区分长臂猿性别的效果最好，其碱基序列如下所示。

sry233-f1：5’-gggtcgcttcactctatc-3’(seqidno：1)，

sry233-r1：5’-gctctggcacctttcaatt-3’(seqidno：2)。

实施例2一种鉴定长臂猿性别的方法

1)提取长臂猿基因组dna；

2)以基因组dna为模板，以sry233-f1和sry233-r1为引物、β-actin-f和β-actin-r为内参，进行pcr扩增；

其中，β-actin-f和β-actin-r的序列为：

β-actin-f：5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno：3)，

β-actin-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3’(seqidno：4)。

其中，pcr扩增体系为：

pcr反应程序为：98℃，5min；98℃，10sec；50℃、15sec，72℃、30sec(32个循环)；72℃、10min。

3)用凝胶电泳方法检测pcr扩增效果，并对检测结果进行分析，不同性别有明显的条带区别(见图2)。

对比例：

本对比例除了使用的引物为现有引物sry1-f2和sry1-r2，其他操作方法均与实施例2类似，具体操作步骤如下：

1)提取长臂猿基因组dna；

2)以基因组dna为模板，以现有引物sry1-f2和sry1-r2为引物、β-actin-f和β-actin-r为内参，进行pcr扩增；

其中，sry1-f2和sry1-r2的序列为：

sry1-f2：5’-cgaactctggcacctttcaa-3’(seqidno：5)，

sry1-r2：5’-gttacccgattgtcctacagct-3’(seqidno：6)。

其中，pcr扩增体系为：

pcr反应程序为：sry1：98℃，5min；98℃，10sec；55℃、15sec，72℃、30sec(32个循环)；72℃、10min。

3)用凝胶电泳方法检测pcr扩增效果，如图1和2所示。

图1结果表明，使用现有传统引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)扩增后，当在677bp同时出现特异性扩增条带和内参基因条带时判定为雄性长臂猿，当在677bp只出现内参基因条带时判定为雌性长臂猿。然而，在100bp以下出现的模糊条带为引物带，250bp和500bp之前出现的条带为杂带，杂带的出现说明该引物特异性不高，发生了非特异性扩增。并且图2中使用传统引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)扩增鉴定长臂猿雄性和雌性的样品中，扩增片段明显出现了非特异条带，经过反应条件的优化也不能消除非特异性。而使用本发明引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)为引物的pcr扩增鉴定结果显示，在233bp处雄性长臂猿扩增出一条特异带，而雌雄长臂猿在233bp处未扩增出特异条带，且电泳图中无杂带(见图2中的泳道1和2)，说明本发明引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)的特异非常好，明显优于现有引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)。

实施例4本发明引物sry233和现有引物sry1的pcr灵敏性对比

分别通过构建质粒pvax-sry233和pvax-sry1，提取质粒pvax-sry233和pvax-sry1，并分别将这种质粒浓度逐渐稀释为10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml、10¹copies/ml、10⁰copies/ml作为模板，分别以引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)和sry1(sry1-f2和sry1-r2)为进行扩增，扩增体系和反应程序同上述实施例2和对比例。

如图3可知，以sry1引物扩增，最低检测线为10个拷贝的基因，而图4所示，以sry233引物扩增，最低可以检测到1个拷贝的基因。相比之下，本发明sry233为引物进行长臂猿性别鉴定检测的灵敏度较传统引物sry1的灵敏性高10倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广州动物园

<120>一种鉴定长臂猿性别的pcr引物、试剂盒及方法

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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ctccttaatgtcacgcacgatttc24

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gttacccgattgtcctacagct22